環(huán)境DNA宏條形碼在浮游動(dòng)植物多樣性研究中的應(yīng)用

吳泳江，蔡明成，孫翰昌*，胡慧蝶，3，鄧雅心，3，龍應(yīng)根，3

(1.重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院，重慶402160；2.重慶文理學(xué)院生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)化技術(shù)創(chuàng)新中心，重慶 402160；3.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100)

浮游植物是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，其生產(chǎn)力占地球總生產(chǎn)力的一半以上[1]。浮游動(dòng)物是浮游植物的主要消費(fèi)者，是連通初級(jí)生產(chǎn)者與高營(yíng)養(yǎng)級(jí)動(dòng)物的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)紐帶[2]。浮游動(dòng)植物種類豐富、數(shù)量龐大、個(gè)體微小、分布廣泛，導(dǎo)致基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法難以準(zhǔn)確區(qū)分其種類，主要有以下原因：1)對(duì)鑒定人員形態(tài)學(xué)分類知識(shí)要求較高，基于主觀形態(tài)判斷難以標(biāo)準(zhǔn)化，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力；2)浮游動(dòng)植物的生命周期短，生命周期內(nèi)形態(tài)變化大；3)浮游動(dòng)植物種間形態(tài)特征的趨同進(jìn)化，導(dǎo)致形態(tài)學(xué)差異不明顯；4)浮游動(dòng)植物的形態(tài)表型存在可塑性，形態(tài)區(qū)分不精確。而最新的環(huán)境DNA(Environmental DNA，eDNA)宏條形碼技術(shù)針對(duì)上述難題提供了一套嶄新的解決方案，其無(wú)需分離生物個(gè)體，僅需提取浮游動(dòng)植物遺留在水體環(huán)境中的DNA，基于特定的條形碼基因設(shè)計(jì)通用引物完成PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)，進(jìn)行物種注釋，最終實(shí)現(xiàn)物種多樣性評(píng)估[3]。因此，本文重點(diǎn)圍繞eDNA宏條形碼技術(shù)在浮游動(dòng)植物多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，旨在為eDNA宏條形碼技術(shù)的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)資料。

1 eDNA宏條形碼技術(shù)概述

eDNA是指生物體遺留在環(huán)境中的DNA的總和，可直接從環(huán)境樣品(水體、空氣、土壤等)中提取獲得，不具備任何明顯的生物源[4]。水環(huán)境中的DNA，包括生物體經(jīng)由糞便、皮膚、黏液等路徑釋放到水體中的DNA，主要為線粒體DNA和核DNA[5]，其中利用線粒體DNA分析水生生物多樣性的研究[6-7]較多。eDNA在所處環(huán)境中會(huì)經(jīng)歷衰變、濃度下降、直至無(wú)法再被檢測(cè)的過(guò)程[8]。DNA條形碼技術(shù)由Hebert P D N等[9]于2003年首次提出，是利用不同物種在特定基因序列(條形碼)上存在的差異來(lái)開(kāi)展物種鑒別的技術(shù)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，為能夠一次性檢測(cè)宏量的基因序列并且可高效檢測(cè)生物多樣性，eDNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，相較于DNA條形碼技術(shù)，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在“宏”字上、以eDNA為基本檢測(cè)單位[10]。

eDNA宏條形碼技術(shù)首先要采集和提取eDNA，根據(jù)檢測(cè)目的選擇合適的條形碼基因來(lái)設(shè)計(jì)通用引物，再利用引物對(duì)eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序；其次拼接和合并測(cè)序獲得的雙端測(cè)序序列，并過(guò)濾掉低質(zhì)量、嵌合體以及小于150 bp的噪音序列，之后通常根據(jù)97%的相似度閾值將序列聚類成可操作分類單元(Operational taxonomic units，OTUs)，再進(jìn)行比對(duì)；最后通過(guò)生物信息學(xué)分析完成物種注釋，達(dá)到物種鑒定的目的[11]。eDNA宏條形碼技術(shù)研究浮游動(dòng)植物具備以下優(yōu)勢(shì)：1)無(wú)需采集生物樣本，對(duì)環(huán)境破壞少；2)不受物種性別和生理發(fā)育階段的影響；3)能準(zhǔn)確區(qū)分形態(tài)相似和表型可塑性高的物種；4)有統(tǒng)一的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，避免受鑒定人員主觀經(jīng)驗(yàn)的影響[2，12]。

2 eDNA宏條形碼在浮游動(dòng)物植物多樣性研究中的采集方法

eDNA宏條形碼技術(shù)研究浮游生物多樣性，其采樣的關(guān)鍵是盡可能多的采集浮游生物的eDNA。水體中eDNA的分布易受季節(jié)、自然環(huán)境、人類活動(dòng)等因素的影響，因此需要依據(jù)水體環(huán)境特征，使用具有針對(duì)性的采樣方案。1)溪流、湍急的河水和江水屬于流動(dòng)水體，eDNA混合較為均勻，其采樣只需采集表層水[13]，通常以主觀確定的距離間隔從河岸和沿著水道取樣，并在一個(gè)采樣點(diǎn)采集多個(gè)樣品。隨著水體自上游向下游流動(dòng)，河口處造就了豐富的物種，因此在河口處采樣可以較為全面地整合河流網(wǎng)絡(luò)的生物多樣性信息[14]。2)湖泊、水庫(kù)、池塘等靜止水體，通常采集沿岸表層水即可[15]。但對(duì)于大型湖泊，還需進(jìn)行精細(xì)尺度的eDNA采樣或深水區(qū)采樣。3)浮游動(dòng)植物是海洋食物網(wǎng)的基礎(chǔ)[16]，但海水中的eDNA較為破碎，且降解比例較高，因而有必要綜合采用基于濾網(wǎng)富集樣品和水樣的eDNA宏條形碼技術(shù)[2]。僅僅在海岸線或近海海域采樣，導(dǎo)致采樣空間覆蓋高度較低，生成的物種列表不全，因此需要采用覆蓋所調(diào)查區(qū)域的網(wǎng)格抽樣設(shè)計(jì)方法[17]。而且海洋的垂直空間很大，海水深度對(duì)浮游動(dòng)植物的eDNA組成也有很大的影響，采樣時(shí)最好覆蓋全深度范圍的eDNA樣本。通常情況下每個(gè)采樣點(diǎn)采集水樣1～2 L，如果浮游生物分布范圍廣或豐度低，則需要加大取樣范圍和取水量[18-19]。為降低實(shí)驗(yàn)誤差和提高目標(biāo)物種檢出率，通常要設(shè)置至少3個(gè)重復(fù)。

水樣采集后還需要從中收集eDNA，主要采用過(guò)濾法、離心法、沉淀法。過(guò)濾法指使用抽濾裝置和濾膜對(duì)水樣進(jìn)行抽濾，使eDNA富集在濾膜上；離心法指使用離心機(jī)對(duì)水樣做離心處理，使eDNA沉降在離心管底部；沉淀法指使用無(wú)水乙醇和乙酸鈉對(duì)水樣中的eDNA進(jìn)行聚集沉淀。使用過(guò)濾法可獲得最高濃度的eDNA，其次是離心法，最低的是沉淀法[20-21]。此外，可將過(guò)濾法、離心法和沉淀法相結(jié)合，獲得更為豐富的eDNA。為減少污染和降解，可將收集到的eDNA置于95%乙醇中，放入-20 ℃冰箱中保存，并及時(shí)完成擴(kuò)增和宏條形碼測(cè)序。在eDNA樣品采集過(guò)程中，要盡量避免采樣環(huán)境污染而造成的假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，因而建議使用10%漂白劑清洗采樣器械并消毒，采樣過(guò)程中操作人員要戴好手套和口罩，并設(shè)置陰性對(duì)照(空白對(duì)照)，實(shí)時(shí)監(jiān)控污染狀況；盡量使用無(wú)人機(jī)械技術(shù)進(jìn)行采樣操作，避免人為采樣造成的交叉污染。

3 eDNA宏條形碼在浮游植物多樣性研究中的應(yīng)用

浮游植物處于水體食物鏈的最底端，作為浮游動(dòng)物和部分水體動(dòng)物的食物[22-23]，是水生生態(tài)系統(tǒng)能量傳遞以及物質(zhì)流動(dòng)的基礎(chǔ)[24-26]，具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、個(gè)體微小等典型特點(diǎn)[27-28]，因而其種群結(jié)構(gòu)和豐度能敏銳地反映水域生態(tài)環(huán)境變化情況[29-31]。eDNA宏條形碼技術(shù)在浮游植物多樣性研究中的應(yīng)用關(guān)鍵在于選擇合適的條形碼基因，再針對(duì)選定的條形碼設(shè)計(jì)通用引物，完成擴(kuò)增和測(cè)序。目前使用較為廣泛的是單基因條形碼，其來(lái)源于核糖體基因、線粒體基因或葉綠體基因。核糖體基因組主要為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed space，ITS)、18S rRNA、16S rRNA；線粒體基因組主要為細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ(Cytochrome oxidase Ⅰ，COⅠ)、細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ(Cytochrome oxidase Ⅲ，CO Ⅲ)；葉綠體基因組主要為matK、rbcL、atpB；其他條形碼基因包括rpoB、trnL、tufA、rpoC1等。張麗娟等[32]、張莉等[33]、劉衛(wèi)東等[34]、王晨等[35]在使用eDNA宏條形碼技術(shù)研究我國(guó)海洋、江河、湖泊中的浮游植物多樣性時(shí)均使用的是18S rRNA基因。這是因?yàn)樵摶虻奈锓N覆蓋率較高且條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)較為完善，從而被優(yōu)先用于浮游植物多樣性研究。18S rRNA基因又分為V4可變區(qū)和V9可變區(qū)，它們均被廣泛用作目標(biāo)基因而完成引物設(shè)計(jì)[32-35]?；?8S rRNA條形碼基因設(shè)計(jì)的通用引物在利用eDNA宏條形碼研究浮游植物多樣性中的應(yīng)用示例見(jiàn)表1。為了提高單基因條形碼的分辨率，也可將幾種條形碼基因聯(lián)合使用，例如多基因條形碼rpoC1+rpoB+matK，但與單基因條形碼相比，其分析更為復(fù)雜。此外，還有超級(jí)條形碼和特定條形碼，這些在浮游植物多樣性研究中均具有巨大的潛力[1]。利用eDNA宏條形碼技術(shù)研究浮游植物多樣性的報(bào)道較多，張麗娟等[32]評(píng)估了eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)真核浮游藻類結(jié)果的精確性，發(fā)現(xiàn)eDNA宏條形碼技術(shù)能準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)到滇池和撫仙湖的真核藻類多樣性；Malviya S等[40]和王靖淇等[37]采用eDNA宏條形碼技術(shù)獲得的浮游藻類類群數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于顯微鏡觀測(cè)，且發(fā)現(xiàn)了很多新物種；郭婷等[41]基于eDNA宏條形碼技術(shù)快速監(jiān)測(cè)出鄱陽(yáng)湖中的浮游植物豐富度、均勻度及其空間分布，有效評(píng)估了鄱陽(yáng)湖的生態(tài)系統(tǒng)健康狀況。eDNA技術(shù)具有簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，在浮游植物研究和多樣性監(jiān)測(cè)中被廣泛應(yīng)用。

表1 基于18S rRNA條形碼基因設(shè)計(jì)的通用引物在利用eDNA宏條形碼研究浮游植物多樣性中的應(yīng)用示例Tab.1 Application examples of universal primer based on 18S rRNA barcode gene in eDNA metabarcoding for monitoring phytoplankton diversity

4 eDNA宏條形碼在浮游動(dòng)物多樣性研究中的應(yīng)用

浮游動(dòng)物以浮游植物為食，是連通水體中的初級(jí)生產(chǎn)者(浮游植物)和高營(yíng)養(yǎng)級(jí)動(dòng)物(魚、蝦、鳥等)的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)樞紐[2，42-43]，具有個(gè)體微小、生活史短、代謝旺盛、種類繁多、數(shù)量龐大、分布范圍廣等特點(diǎn)，因而對(duì)水體環(huán)境變化的響應(yīng)同樣十分敏感[44-47]，其種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量是衡量水體生態(tài)健康狀況重要的依據(jù)[48-51]。利用eDNA宏條形碼研究浮游動(dòng)物與研究浮游植物相似，關(guān)鍵之處都在于選擇合適的條形碼基因，據(jù)此設(shè)計(jì)最佳的PCR擴(kuò)增通用引物。與研究浮游植物相同，利用eDNA宏條形碼研究浮游動(dòng)物也使用核糖體基因中的ITS、18S rRNA、16S rRNA[2，52-53]，以及線粒體基因中的COⅠ[54-55]。18S rRNA中的V9可變區(qū)比較適用于高通量測(cè)序平臺(tái)，可覆蓋更多的浮游動(dòng)物類群，但對(duì)物種的分辨率較低，在種水平上較難區(qū)分物種[2]。COⅠ的進(jìn)化率要高于18S rRNA，在物種水平上的分辨率較高，但對(duì)更高分類層級(jí)的分辨率較低[56]。高旭等[53]比較了18S rRNA-V9、COⅠ、16S rRNA條形碼基因的通用引物在利用DNA研究浮游動(dòng)物多樣性中的差異，發(fā)現(xiàn)COⅠ條形碼的引物更適用，這是因?yàn)槠錂z測(cè)的物種特異性、物種覆蓋度和物種識(shí)別敏感性均適中，且檢出的浮游動(dòng)物種群數(shù)量高于18S rRNA-V9引物和16S rRNA引物。基于18S rRNA和COⅠ條形碼基因設(shè)計(jì)的通用引物在利用eDNA宏條形碼研究浮游動(dòng)物多樣性中的應(yīng)用示例見(jiàn)表2。孫晶瑩等[57]研究表明，基于eDNA宏條形碼技術(shù)可有效實(shí)現(xiàn)對(duì)浮游動(dòng)物的半定量檢測(cè)，在浮游生物多樣性的研究和監(jiān)測(cè)以及生物完整性評(píng)估中具有較大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。唐晟凱等[61]利用eDNA技術(shù)研究邵伯湖浮游動(dòng)物物種，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)適用于淺水湖泊浮游動(dòng)物群落的監(jiān)測(cè)，且其結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察的檢出效果最佳。馮蕓芝等[2]對(duì)eDNA宏條形碼技術(shù)在海洋浮游動(dòng)物多樣性和生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用作了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地分析大規(guī)模環(huán)境樣本，并在海洋浮游動(dòng)物生態(tài)學(xué)研究中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。總之，利用eDNA宏條形碼技術(shù)可快速而準(zhǔn)確地反映浮游動(dòng)物類群的多樣性、分布特征、數(shù)量變化等。

5 浮游生物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)

目前利用eDNA宏條形碼技術(shù)研究浮游動(dòng)植物多樣性主要用到的數(shù)據(jù)庫(kù)為生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(Barcode of life data systems,BOLD,http://www.boldsystems.org/index.php)和NCBI中的GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，二者均為開(kāi)放數(shù)據(jù)庫(kù)。截止2023年3月31日，BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)已收集到640 578種物種的條形碼序列；錄入至BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)的條形碼需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)量篩查和公示，也必須具備物種名稱、憑證數(shù)據(jù)(存儲(chǔ)機(jī)構(gòu)和目錄信息)、采集記錄、標(biāo)本標(biāo)識(shí)符、序列大于500 bp、引物信息以及原始序列數(shù)據(jù)文件。GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)已更新至2023年2月，其種的數(shù)據(jù)量比BOLD大，包括241 830 635條序列；錄入至GeneBank中的序列也要進(jìn)行基本的質(zhì)量檢查，但與BOLD相比，不存儲(chǔ)序列色譜圖、采集元數(shù)據(jù)或物種照片[62]。BOLD是一種具備存儲(chǔ)功能的條形碼管理工具，而GeneBank主要完成數(shù)據(jù)存儲(chǔ)，這兩個(gè)庫(kù)中的很多數(shù)據(jù)是重合的，BOLD中的序列會(huì)自動(dòng)傳遞到GeneBank，BOLD又從GeneBank中周期性挖掘條形碼數(shù)據(jù)[63]。對(duì)測(cè)序獲得的eDNA序列，需要使用比對(duì)工具檢索比對(duì)到相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BOLD-ID工具將測(cè)序獲得的eDNA序列比對(duì)到BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)，可查詢出與序列最匹配的物種名稱、分類單元以及相近物種等；使用NCBI-BLAST工具將測(cè)序獲得的eDNA序列比對(duì)到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，可查詢到與參考序列的相似度并打分，實(shí)現(xiàn)物種鑒定。除以上2個(gè)主要的數(shù)據(jù)庫(kù)外，很多國(guó)家都建有本國(guó)的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，例如中國(guó)科學(xué)院建立的中國(guó)生命條形碼信息管理系統(tǒng)和近海海洋DNA條形碼資源庫(kù)[64]、韓國(guó)生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)[65]、澳大利亞淡水大型無(wú)脊椎動(dòng)物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)[66]、中國(guó)淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)[67]等。研究者將eDNA測(cè)序后得到的序列比對(duì)到這些開(kāi)放或者自有數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢比對(duì)率，進(jìn)而確定物種類型。構(gòu)建高質(zhì)量、高準(zhǔn)確度的參考數(shù)據(jù)庫(kù)是eDNA 宏條形碼技術(shù)的關(guān)鍵，將測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)比對(duì)到目標(biāo)序列，如果數(shù)據(jù)庫(kù)出現(xiàn)錯(cuò)誤或缺失，就會(huì)嚴(yán)重影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，構(gòu)建一個(gè)具備世界共識(shí)的高質(zhì)量、高準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)庫(kù)是一項(xiàng)規(guī)模龐大且艱巨的任務(wù)，需要在研究過(guò)程中不斷更新完善DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，以提高其精確度和可信程度。

表2 基于18S rRNA和COⅠ條形碼基因設(shè)計(jì)的通用引物在利用eDNA宏條形碼研究浮游動(dòng)物多樣性中的應(yīng)用示例Tab.2 Application examples of universal primer based on 18S rRNA and COⅠbarcode genes in eDNA metabarcoding for monitoring zooplankton diversity

6 小結(jié)與展望

傳統(tǒng)浮游動(dòng)植物的形態(tài)鑒定容易受鑒定人員的專業(yè)水平的影響，而eDNA宏條形碼作為一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的基因鑒別技術(shù)，具備便捷可靠、靈活實(shí)用、信息量大等優(yōu)點(diǎn)，能快捷有序地應(yīng)用于浮游動(dòng)植物的鑒定與分類管理。目前eDNA宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用主要通過(guò)研究浮游動(dòng)植物多樣性，以進(jìn)一步評(píng)估水生生態(tài)系統(tǒng)物種多樣性和健康狀況。eDNA宏條形碼技術(shù)主要包括eDNA樣品采集、DNA提取、PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序、序列對(duì)比與物種注釋等，其準(zhǔn)確性從樣品采集開(kāi)始便受影響，要根據(jù)不同的水體環(huán)境選擇合適的采樣方法，并在采樣的過(guò)程中注意樣品的代表性、避免樣品被污染的情況發(fā)生。利用eDNA宏條形碼技術(shù)研究浮游植物多樣性通常使用18S rRNA條形碼基因，而研究浮游動(dòng)物多樣性通常使用COⅠ條形碼基因，但二者均根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)通用引物完成PCR擴(kuò)增。高質(zhì)量、高準(zhǔn)確度的參考數(shù)據(jù)庫(kù)是eDNA 宏條形碼技術(shù)研究應(yīng)用的關(guān)鍵，需要在研究過(guò)程中不斷完善數(shù)據(jù)庫(kù)，使其具有更高的準(zhǔn)確度且覆蓋更為廣泛的多基因片段，實(shí)現(xiàn)浮游動(dòng)植物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的精準(zhǔn)量化。