赤霞珠葡萄籽多酚穩(wěn)定性和體外生物活性研究

范利君，王志鵬，宋安康，趙 宇，鄭 月，阿爾新古麗·活生，王 偉

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

植物多酚是廣泛存在于植物根、皮、葉、果實(shí)中的次生代謝產(chǎn)物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，植物中含有超過(guò)60000種結(jié)構(gòu)多樣的天然多酚，如類黃酮、酚酸、茋類等，這些天然多酚通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和清除自由基從而發(fā)揮對(duì)人體健康有益的作用，如預(yù)防或治療炎癥、糖尿病、肥胖、心血管疾病和癌癥等[1-2]。目前，食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)對(duì)于從天然植物中獲得安全、高效且具有一定功能特性的天然多酚的需求正不斷增加，關(guān)于多酚類物質(zhì)的研究已然成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一[3-5]。

葡萄皮渣是葡萄酒釀造過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，葡萄皮渣中的葡萄籽中含有豐富的多酚類物質(zhì)，如兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、原花青素及其聚合物等，是良好的酚類物質(zhì)來(lái)源[6-8]。多酚類物質(zhì)雖已被證實(shí)具有許多生物活性，但除自身結(jié)構(gòu)影響外，其在加工和貯藏過(guò)程中易受光照、溫度、pH、添加劑等不同條件的影響[9]，發(fā)生氧化、降解或聚合，形成新物質(zhì)使其性質(zhì)改變從而導(dǎo)致生物活性降低，限制其進(jìn)一步加工與應(yīng)用。而多酚類物質(zhì)對(duì)人體健康的影響實(shí)際上取決于其在食品加工過(guò)程中的穩(wěn)定性，因此，為了準(zhǔn)確評(píng)估多酚在食品加工行業(yè)真正的開發(fā)價(jià)值，就必須重視多酚在食品加工中的穩(wěn)定性，這也正在成為當(dāng)前生產(chǎn)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[10-13]。赤霞珠作為最受歡迎的釀酒品種之一，規(guī)?；钠咸丫萍庸ぎa(chǎn)業(yè)在帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也帶來(lái)了大量有待開發(fā)利用的葡萄籽副產(chǎn)物。因此，本文以釀酒后的赤霞珠葡萄籽為原材料，系統(tǒng)的考察pH、光照、溫度、碳水化合物等不同加工、貯藏條件對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響，同時(shí)探討葡萄籽多酚的生物活性（抗氧化、降血糖），旨在為有效開發(fā)利用赤霞珠葡萄籽資源提供更多參考依據(jù)，也為葡萄籽多酚相關(guān)產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)、應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒后赤霞珠葡萄籽脫脂粉 由實(shí)驗(yàn)室自制；福林酚試劑、AB-8 大孔吸附樹脂 北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鐵、氯化鋁、氯化鎂、硫酸銅、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

KQ-250DE 數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XMTD-400 電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；P4PC 紫外可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司；3H16RI 智能高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；xianda-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Alpha 2-4 LSCplus 冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；HL-2S 恒流泵、BS-100A 自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄籽多酚樣品的制備 按照范利君等[14]的方法制備葡萄籽多酚純化物，在此條件下所制備的葡萄籽多酚純度為80.35%。

1.2.2 多酚含量測(cè)定 葡萄籽多酚含量測(cè)定參照黃艷等[15]方法稍作修改。具體為：配制濃度為0.1 mg/mL 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 上述沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 棕色容量瓶中，各加入蒸餾水10 mL、福林酚0.5 mL，混合均勻，室溫下靜置反應(yīng)2 min 后再加入15%碳酸鈉溶液1.5 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，30 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)30 min，在760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，試驗(yàn)重復(fù)3 次，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.1317x-0.0029（R2=0.9992），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定樣品吸光值，并根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品多酚含量。

式中：C 為樣品中多酚含量（mg/mL）；A 為吸光值；N 為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 葡萄籽多酚的穩(wěn)定性研究 葡萄籽多酚穩(wěn)定性測(cè)定相關(guān)樣品處理參照張一格[16]方法并稍作修改。

1.2.3.1 pH 對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 分別配制pH 為（2、3、4、5、6、7、8）的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，用不同pH 值緩沖溶液溶解葡萄籽多酚樣品，配制為一定濃度樣品溶液，避光靜置24 h 后取樣，按1.2.2 中標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，根據(jù)公式（2）計(jì)算多酚保留率。

式中：C1為處理后葡萄籽多酚含量（mg/mL）；C0為處理前葡萄籽多酚含量（mg/mL）。

1.2.3.2 光照對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 準(zhǔn)確吸取三份2 mL 葡萄籽多酚溶液，每份中各加入2 mL蒸餾水，分別置于室內(nèi)避光、室內(nèi)自然光、直射太陽(yáng)光條件下靜置5 h，每1 h 取樣，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.3 溫度對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 準(zhǔn)確吸取六份2 mL 葡萄籽多酚溶液，每份中各加入2 mL蒸餾水，分別置于4、20、40、60、80、100 ℃條件下避光靜置2 h 后，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.4 碳水化合物對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%的葡萄糖溶液、蔗糖溶液、乳糖溶液和淀粉溶液，吸取2 mL 上述溶液并加入2 mL 葡萄籽多酚溶液，混勻后，避光靜置24 h 后，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.5 穩(wěn)定劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 準(zhǔn)確吸取三份2 mL 葡萄籽多酚溶液，分別加入2 mL 50 mg/mL Na2S2O3、2 mL 吐溫-80 以及 2 mL 蒸餾水，于室溫條件下避光靜置4 d，每1 d 取樣，于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.6 氧化劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 準(zhǔn)確吸取五份2 mL 葡萄籽多酚溶液，分別加入2 mL 0、0.5%、1%、1.5%、2%的過(guò)氧化氫溶液和于室溫條件下避光靜置5 h，每1 h 取樣，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.7 還原劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 準(zhǔn)確吸取五份2 mL 葡萄籽多酚溶液，分別加入2 mL 0、0.5%、1%、1.5%、2%的亞硫酸鈉溶液，于室溫條件下避光靜置5 h，每1 h 取樣，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.8 防腐劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 準(zhǔn)確吸取五份2 mL 葡萄籽多酚溶液，分別加入2 mL 蒸餾水、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%苯甲酸鈉溶液和0.05%、0.1%、0.15%、0.2%山梨酸鉀溶液，于室溫條件下避光靜置7 d 后取樣，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值，計(jì)算多酚保留率。

1.2.3.9 金屬離子對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 配制濃度均為50 mg/mL 的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋁、氯化鐵、硫酸銅溶液，吸取2 mL 葡萄籽多酚溶液并加入2 mL 上述金屬離子溶液，室溫條件下避光靜置。分別在0、1、2、3、4、7、15、30 d 取樣，于760 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定樣品吸光值。

1.2.4 葡萄籽多酚的生物活性研究

1.2.4.1 葡萄籽多酚對(duì)DPPH 自由基清除率的測(cè)定參照王偉等[17]方法稍作修改。具體為：精密吸取1 mL 不同濃度（10、20、30、40、50、60 μg/mL）的葡萄籽多酚溶液于棕色試管中，加入2 mL DPPH 乙醇溶液（0.4 mmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配），搖勻后30 ℃避光靜置反應(yīng)30 min，517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。Vc 做陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)公式（3）計(jì)算樣品DPPH 自由基清除率。

式中：QD—DPPH 自由基清除率（%）；A1—樣品+DPPH 溶液；A2—樣品+無(wú)水乙醇；A0—蒸餾水+DPPH 溶液。

1.2.4.2 葡萄籽多酚對(duì)ABTS+自由基清除率的測(cè)定參照Wang 等[18]方法略作修改。具體為：在室溫、避光條件下配制ABTS 儲(chǔ)備液。使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋儲(chǔ)備液至在734 nm 波長(zhǎng)下吸光值為0.70±0.02（現(xiàn)用現(xiàn)配）。分別吸取0.1 mL 不同濃度（50、100、200、300、400、500 μg/mL）樣品溶液于試管中，再加入4.9 mL ABTS+工作液，室溫下避光反應(yīng)6 min 后測(cè)定734 nm 處的吸光值。VC做陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)公式（4）計(jì)算樣品ABTS+自由基清除率。

式中：QA—ABTS+自由基清除率（%）；A1—樣品+ABTS+稀釋液；A2—蒸餾水+ABTS+工作液。

1.2.4.3 葡萄籽多酚還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定參照孫菡崢[19]的方法進(jìn)行。具體為：吸取0.5 mL 樣品溶液，2.5 mL 1%（w/v）鐵氰化鉀溶液和2.5 mL pH=6.6 磷酸緩沖溶液搖勻。50 ℃下反應(yīng)20 min 后加入2.5 mL 10%（w/v）的三氯乙酸溶液靜置10 min。離心取2.5 mL 上清液，再加入2.5 mL 去離子水和0.5 mL 1%（w/v）FeCl3溶液，靜置10 min 后于700 nm處測(cè)量吸光值，Vc 為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4.4 葡萄籽多酚抑制α-淀粉酶活性的測(cè)定 將葡萄籽多酚配制為不同濃度樣品，參照羅麗平等[20]方法稍作修改，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，按照表1 所列方法進(jìn)行試驗(yàn)，α-淀粉酶抑制率根據(jù)公式（5）計(jì)算。

表1 α-淀粉酶活性抑制測(cè)定試驗(yàn)Table 1 Assay of α-amylase activity inhibition

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，使用Excel 2019 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、IBM SPSS Statistics 19 進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），采用Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄籽多酚的穩(wěn)定性研究

2.1.1 pH 對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 由圖1 可知，不同pH 對(duì)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性均有一定影響?？傮w而言，葡萄籽多酚在酸性條件下穩(wěn)定性較堿性條件更高。當(dāng)pH 為2～3 條件下，葡萄籽多酚保留率均低于95%，但均高于90%，當(dāng)pH 為4～6 條件下，多酚保留率呈先上升后下降趨勢(shì)，在pH 為5 時(shí)有最大值96.39%，但在該pH 范圍內(nèi)多酚保留率之間并無(wú)顯著差異（P＞0.05）；而在pH7、pH8 條件下，葡萄籽多酚含量顯著下降（P＜0.05），多酚保留率分別下降了13.57%、16.49%。與堿性條件相比，葡萄籽多酚在酸性條件下降解速度較慢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槠咸炎讯喾咏Y(jié)構(gòu)中含有酚羥基，在堿性條件下結(jié)構(gòu)易被破壞，生成其他物質(zhì)，造成多酚含量下降[21]。以上結(jié)果說(shuō)明，葡萄籽多酚在弱酸條件下穩(wěn)定性更強(qiáng)。

圖1 pH 對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effects of pH values on the stability of grape seed polyphenols

2.1.2 光照對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 由圖2 可知，光照強(qiáng)度對(duì)葡萄籽多酚保留率的變化具有顯著影響（P＜0.05），不論是在避光、室內(nèi)散射光還是直射太陽(yáng)光條件下，葡萄籽多酚保留率均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降，不同光照強(qiáng)度處理5 h 后，葡萄籽多酚保留率分別下降至97.55%、92.70%、89.96%。由此可知，葡萄籽多酚對(duì)光敏感，直射太陽(yáng)光照射下多酚穩(wěn)定性最差，而在避光條件下最穩(wěn)定。岳鑫等[9]研究紅松種磷多酚光照穩(wěn)定性，也發(fā)現(xiàn)多酚對(duì)光敏感，避光條件下更穩(wěn)定，可能是因?yàn)槎喾踊衔镏泻写罅坎伙柡玩I，在光照條件下易發(fā)生自身氧化聚合，導(dǎo)致部分多酚降解。因此，在葡萄籽多酚的加工、貯藏過(guò)程中，應(yīng)注意避光保存，避免直接暴露于室內(nèi)強(qiáng)光的長(zhǎng)時(shí)間照射。

圖2 光照對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of light on the stability of grape seed polyphenols

2.1.3 溫度對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 某些食品在加工過(guò)程中可能會(huì)涉及到加熱，而熱處理會(huì)極大地促進(jìn)多酚類物質(zhì)（如槲皮素、蘆丁等）的降解，使其生物活性下降[22]。由圖3 可知，溫度對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響顯著（P＜0.05）。在6 種不同溫度條件下，隨著溫度的升高，多酚保留率逐漸下降。在4～40 ℃溫度范圍內(nèi)，多酚保留率均在95%以上，且在4 ℃時(shí)最大（99.08%），而當(dāng)溫度高于40 ℃后，多酚保留率均低于95%，且在溫度達(dá)到100 ℃時(shí)，多酚保留率已下降至86.33%，這一結(jié)果與林國(guó)榮等[23]所得葡萄多酚在溫度為90 ℃時(shí)吸光度上升的結(jié)論略有出入，推測(cè)與不同葡萄品種所含的多酚種類和含量不同有關(guān)，同時(shí)經(jīng)不同純化條件純化后所得的多酚種類也存在差異，因此，在經(jīng)高溫處理后，其多酚含量的變化趨勢(shì)有可能存在不同[24]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明葡萄籽多酚在高溫條件下其結(jié)構(gòu)易被破壞，從而導(dǎo)致穩(wěn)定性降低，故葡萄籽多酚應(yīng)于低溫條件下進(jìn)行保存。

圖3 溫度對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on stability of grape seed polyphenols

2.1.4 碳水化合物對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 由圖4 可知，不同碳水化合物對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性均有一定影響。葡萄籽多酚溶液經(jīng)葡萄糖和蔗糖處理24 h 后，多酚保留率隨其濃度的增加而上升，穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明高濃度（40%～50%）的葡萄糖和蔗糖對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性均有一定的保護(hù)作用，而低濃度的葡萄糖和蔗糖添加量與高濃度相比對(duì)多酚的破環(huán)程度更大，這可能是因?yàn)槿芤褐兴只疃冉档停瑢?dǎo)致含氧量減少，抑制了多酚的降解速率，同時(shí)多酚中的部分花青素物質(zhì)與糖類結(jié)合，使穩(wěn)定性增強(qiáng)[25-26]。經(jīng)不同濃度乳糖處理的葡萄籽多酚溶液多酚保留率無(wú)顯著變化（P＞0.05），而經(jīng)不同濃度淀粉處理后的多酚保留率與其他三種碳水化合物相比下降明顯，且濃度越高，多酚保留率越低，這主要是因?yàn)槎喾优c淀粉之間可以通過(guò)范德華力、氫鍵、疏水作用等結(jié)合形成復(fù)合物，從而使多酚含量下降[27]，而陳南等[28]研究發(fā)現(xiàn)，淀粉分子間交聯(lián)所產(chǎn)生的物理空隙能夠包裹和負(fù)載多種酚類物質(zhì)，同時(shí)，淀粉與酚類物質(zhì)之間會(huì)隨淀粉添加量及植物多酚酚羥基數(shù)目的增加而形成更連續(xù)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而強(qiáng)化淀粉-多酚復(fù)合物的穩(wěn)定性，減少其在人體消化道的損害，從而提高多酚的生物可及性和生物利用度[28]。

圖4 碳水化合物對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of carbohydrate on stability of grape seed polyphenols

2.1.5 穩(wěn)定劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 由圖5可知，添加硫代硫酸鈉、吐溫-80、蒸餾水的葡萄籽多酚溶液在反應(yīng)4 d 內(nèi)多酚保留率均呈下降趨勢(shì)且不同處理組之間影響顯著（P＜0.05）。反應(yīng)4 d 結(jié)束后，經(jīng)硫代硫酸鈉、吐溫-80 處理后的葡萄籽多酚溶液中多酚保留率分別下降了13.78%、6.17%，對(duì)照組樣品多酚保留率僅下降了2.69%，以上結(jié)果說(shuō)明在加工過(guò)程中添加硫代硫酸鈉和吐溫-80 對(duì)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性有一定影響，但硫代硫酸鈉的破壞作用更強(qiáng)，與張一格[16]的研究結(jié)果一致，推測(cè)可能與兩種物質(zhì)不同的性質(zhì)有關(guān)。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，吐溫-80 由于其具有較好的增溶效果可被用于多酚類物質(zhì)的提取，適宜的質(zhì)量濃度（20%）能得到較高多酚得率，而當(dāng)其質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)多酚得率反而下降，在本研究中經(jīng)吐溫-80 處理后的多酚保留率有一定的下降，除多酚自身存在一定降解外，也可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中吐溫-80 較高的質(zhì)量濃度有關(guān)[29]。而硫代硫酸鈉屬于還原劑也屬于金屬鹽，多酚與氧氣、光照等氧化因素作用，會(huì)產(chǎn)生氧化產(chǎn)物與硫代硫酸鈉反應(yīng)，同時(shí)，多酚結(jié)構(gòu)式中含有的鄰苯二酚或鄰苯三酚基團(tuán)可以和金屬離子配位，從而導(dǎo)致多酚含量下降[30]。

圖5 穩(wěn)定劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of stabilizers on the stability of grape seed polyphenols

2.1.6 氧化劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 H2O2在食品安全中的安全使用添加劑量是低于2%，所以在添加H2O2時(shí)其含量要控制在2%之內(nèi)。由圖6 可知，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度范圍內(nèi)，氧化劑H2O2對(duì)葡萄籽多酚具有一定破壞作用。隨著處理時(shí)間的增加，多酚保留率呈下降趨勢(shì)，而在同一處理時(shí)間，多酚保留率又隨氧化劑添加濃度的增加明顯降低。經(jīng)不同濃度氧化劑處理5 h 后，各處理組多酚保留率分別下降了3.85%、4.92%、5.66%、6.14%、8.62%，與對(duì)照組（0%）相比，氧化劑添加濃度在1%范圍內(nèi)多酚保留率無(wú)明顯差異（P＞0.05），而在1%～2%濃度范圍內(nèi)，多酚保留率差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明低濃度的氧化劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性影響不大，葡萄籽多酚具有一定程度抗氧化能力。

圖6 氧化劑-過(guò)氧化氫對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of oxidant on stability of grape seed polyphenols

2.1.7 還原劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 由圖7可知，還原劑亞硫酸鈉對(duì)葡萄籽多酚具有較強(qiáng)的破壞作用。經(jīng)還原劑亞硫酸鈉處理后的葡萄籽多酚保留率隨時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，各處理組在反應(yīng)5 h 結(jié)束后，多酚保留率分別下降了3.85%、12.75%、22.86%、27.04%、32.86%，與對(duì)照組（0%）相比，各處理組多酚保留率隨還原劑濃度的增大下降幅度增大，說(shuō)明葡萄籽多酚耐還原能力較差。此外，通過(guò)對(duì)比氧化劑和還原劑在相同濃度處理后的多酚保留率，可以看出，在相同條件下，雖然氧化劑與還原劑對(duì)葡萄籽多酚均有破環(huán)作用，但還原劑對(duì)葡萄籽多酚的破壞作用明顯強(qiáng)于氧化劑，這可能與亞硫酸鈉既具有還原性又具有氧化性的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[31]，與林國(guó)榮等[23]研究結(jié)果一致。

圖7 還原劑-亞硫酸鈉對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of reducing agent on stability of grape seed polyphenols

2.1.8 防腐劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 由圖8可知，防腐劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性影響顯著。由于葡萄籽多酚本身不穩(wěn)定，未做任何處理也會(huì)有一定程度降解。當(dāng)葡萄籽多酚用不同濃度苯甲酸鈉、山梨酸鉀處理7 d 后，多酚保留率隨濃度的增加呈先下降再上升再下降的趨勢(shì)。苯甲酸鈉在濃度為0.15%時(shí)有最大多酚保留率為87.95%，山梨酸鉀在濃度為0.1%時(shí)有最大多酚保留率為89.44%，說(shuō)明防腐劑對(duì)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性有一定影響，但當(dāng)選擇適宜的濃度時(shí)，可以減小對(duì)多酚的破壞，提高葡萄籽多酚的穩(wěn)定性，這可能是因?yàn)檫m宜濃度防腐劑可以抑制微生物的活性，減少微生物對(duì)多酚的利用，從而提高多酚穩(wěn)定性[32]。此外，通過(guò)對(duì)比相同濃度下使用不同防腐劑處理后的多酚保留率，可以看出，苯甲酸鈉對(duì)葡萄籽多酚的破壞程度更大，這可能與兩種防腐劑不同的理化性質(zhì)有關(guān)。

圖8 防腐劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of preservatives on the stability of grape seed polyphenols

2.1.9 金屬離子對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響 金屬離子對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響如表2 所示，貯藏30 d 后，7 種離子對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性均有一定的影響。通過(guò)對(duì)比CK 組在儲(chǔ)存30 d 后多酚溶液的吸光值下降率（17.60%），其中，Al3+、Fe3+、Cu2+對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性存在顯著影響（P＜0.05），與第0 d 相比，貯藏30 d 以后，添加了Al3+、Fe3+、Cu2+的葡萄籽多酚溶液吸光值分別下降了66.11%、43.38%、82.15%，同時(shí)，由于這三種離子自身顏色的存在，使得多酚溶液顏色發(fā)生改變，且有明顯沉淀產(chǎn)生，其中添加Fe3+的多酚溶液中產(chǎn)生沉淀最多，且多酚含量在Fe3+加入的同時(shí)就已經(jīng)大量降低，說(shuō)明Al3+、Fe3+、Cu2+三種離子對(duì)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性影響較大。而添加Na+、K+、Ca2+、Mg2+的多酚溶液吸光值分別下降了15.80%、9.47%、16.64%、2.28%，說(shuō)明Na+、K+、Mg2+對(duì)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性具有一定保護(hù)作用，而Ca2+對(duì)多酚穩(wěn)定性影響不大。前人研究表明，植物多酚結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)鄰位酚羥基，可以作為一種多基配體與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成穩(wěn)定的五元環(huán)螯合物，由于植物多酚配位基團(tuán)多、絡(luò)合能力強(qiáng)、絡(luò)合物穩(wěn)定，因此某些金屬離子會(huì)與多酚絡(luò)合后形成沉淀，同時(shí)某些高價(jià)金屬離子如Cr6＋、Fe3＋等絡(luò)合的同時(shí)也會(huì)將金屬離子從高價(jià)態(tài)還原至低價(jià)態(tài)[33]，而不同金屬離子與多酚結(jié)合后會(huì)形成不同的螯合物，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響多酚的穩(wěn)定性[9]。因此，在葡萄籽多酚的加工、儲(chǔ)存、使用過(guò)程中，應(yīng)盡量避免與鋁、鐵、銅制容器或含有Al3+、Fe3+、Cu2+的容器接觸。雖然在本研究中添加Al3+、Fe3+、Cu2+三種離子使多酚保留率下降，但目前已有研究發(fā)現(xiàn)，Al3+、Fe3+、Cu2+等過(guò)渡金屬易與多酚分子組裝形成金屬-多酚網(wǎng)絡(luò)（metal polyphenol network，MPN），通過(guò)調(diào)控這一過(guò)程可以形成不同形狀和功能的薄膜或涂層從而應(yīng)用于食品工業(yè)、污水凈化和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[34]，因此，關(guān)于金屬離子對(duì)于多酚穩(wěn)定性的影響應(yīng)保持辯證的態(tài)度。

表2 金屬離子對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性的影響Table 2 Influence of metal ions on stability of grape seed polyphenols

2.2 葡萄籽多酚的生物活性研究

2.2.1 葡萄籽多酚的抗氧化活性 由圖9 可知，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定濃度范圍內(nèi)，葡萄籽多酚表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH、ABTS+自由基的能力，且多酚濃度與清除自由基的能力呈正相關(guān)，當(dāng)濃度在60 μg/mL 時(shí)，葡萄籽多酚和VC對(duì)DPPH 自由基的清除能力分別達(dá)到95.03%和96.44%，當(dāng)濃度在500 μg/mL 時(shí)，葡萄籽多酚和VC對(duì)ABTS+自由基的清除能力分別達(dá)到94.61%和96.40%，二者清除效果相當(dāng)，說(shuō)明當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，葡萄籽多酚具有較強(qiáng)的DPPH、ABTS+自由基清除能力，同時(shí)，在相同濃度條件下，葡萄籽多酚的還原能力與VC接近，以上結(jié)果均說(shuō)明經(jīng)純化后的葡萄籽多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

圖9 葡萄籽多酚對(duì)DPPH、ABTS+自由基的清除率和還原力Fig.9 DPPH and ABTS+ free radical clearance rate and reducing power of grape seed polyphenols

2.2.2 葡萄籽多酚對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用 由圖10 可知，在0.5～3.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，葡萄籽多酚和陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的α-淀粉酶抑制率均與樣品濃度呈正相關(guān)，葡萄籽多酚在0.5～2.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)其抑制率均低于同濃度下對(duì)照組阿卡波糖，但當(dāng)其濃度大于2.0 mg/mL 時(shí)，抑制率大于對(duì)照組，以上結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)達(dá)到一定劑量時(shí)，葡萄籽多酚具有較強(qiáng)的抑制α-淀粉酶活性的能力。與郭雅婧等[35]的研究結(jié)果一致。

圖10 葡萄籽多酚對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率Fig.10 Inhibition rate of grape seed polyphenol on α-amylase activity

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)研究了釀酒后赤霞珠葡萄籽中提取純化得到的葡萄籽多酚的穩(wěn)定性和體外生物活性，結(jié)果表明：葡萄籽多酚若需長(zhǎng)期貯藏應(yīng)置于避光、低溫（4 ℃）環(huán)境中，在此條件下可最大程度保留其活性成分，這一結(jié)果與林國(guó)榮等[23]研究結(jié)果一致。不同的pH 環(huán)境對(duì)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性影響顯著，在本研究中，葡萄籽多酚在弱酸（pH4～6）條件下具有較好的穩(wěn)定性且在pH 為5 時(shí)有最大多酚保留率，這一結(jié)果與岳鑫等[9]報(bào)道的紅松種鱗多酚在pH＜3 條件下穩(wěn)定性最好有所不同，這可能與兩者所含不同的多酚種類有關(guān)。高濃度（40%～50%）的蔗糖和葡萄糖可以增強(qiáng)葡萄籽多酚的穩(wěn)定性，且蔗糖優(yōu)于葡萄糖，鄭燕菲等[26]也在研究中發(fā)現(xiàn)高濃度的蔗糖更有利于單性木蘭葉多酚的穩(wěn)定，乳糖對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性并無(wú)顯著影響，而淀粉顯著降低葡萄籽多酚的穩(wěn)定性，這一結(jié)果與王紅[36]所得淀粉溶液更易使燕麥麩皮多酚穩(wěn)定性下降的結(jié)論一致。氧化劑和還原劑對(duì)葡萄籽多酚均有一定破壞作用，但1%濃度范圍內(nèi)的氧化劑對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性并無(wú)顯著影響，而還原劑對(duì)葡萄籽多酚的破壞作用更加明顯，說(shuō)明葡萄籽多酚耐還原性較差。此外，與吐溫-80 相比，穩(wěn)定劑硫代硫酸鈉更易使葡萄籽多酚穩(wěn)定性下降，因此，在葡萄籽多酚的加工過(guò)程中應(yīng)盡量避免硫代硫酸鈉的添加。添加防腐劑會(huì)影響葡萄籽多酚的穩(wěn)定性，當(dāng)選擇0.15%的苯甲酸鈉和0.1%的山梨酸鉀時(shí)多酚保留率最高，從整體來(lái)看，山梨酸鉀比苯甲酸鈉更利于多酚的穩(wěn)定，此結(jié)果彌補(bǔ)了林國(guó)榮等[23]僅用苯甲酸鈉單一防腐劑考察葡萄籽多酚穩(wěn)定性的不足；不同金屬離子對(duì)葡萄籽多酚穩(wěn)定性存在不同影響，其中Na+、K+、Mg2+對(duì)葡萄籽多酚具有保護(hù)作用，可以降低多酚降解速率，Ca2+對(duì)多酚穩(wěn)定性影響不大，而Al3+、Fe3+、Cu2+對(duì)葡萄籽多酚的破壞作用更明顯，但關(guān)于Al3+、Fe3+、Cu2+等金屬離子對(duì)多酚的穩(wěn)定性的影響，應(yīng)考慮其實(shí)際應(yīng)用方向，而不能片面地認(rèn)為其穩(wěn)定性的降低即對(duì)其在加工利用中不利。生物活性研究表明，當(dāng)達(dá)到一定質(zhì)量濃度，葡萄籽多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力和抑制α-淀粉酶活性的能力，可作為今后降糖新藥的研發(fā)，以減少降糖藥長(zhǎng)期服用對(duì)于人體肝腎的損傷，研究結(jié)果可為葡萄籽多酚的加工和保存以及進(jìn)一步綜合利用提供一定理論依據(jù)。