紅蕓豆多糖聯(lián)合運動改善飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠糖脂代謝紊亂

袁 彬，楊永紅，周海洋

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河 462002）

高脂飲食（High fat diet，HFD）引起的代謝紊亂可導(dǎo)致多種疾病，包括動脈粥樣硬化、炎癥、高脂血癥和肝脂質(zhì)過氧化，還可增加心血管疾病和2 型糖尿病的風(fēng)險。由于不健康的飲食習(xí)慣和缺乏運動，人類正面臨著肥胖及其并發(fā)癥的巨大挑戰(zhàn)[1]。越來越多的研究表明，過多的脂質(zhì)刺激導(dǎo)致細胞因子的異常，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、瘦素，并引發(fā)脂肪沉積，誘導(dǎo)肥胖相關(guān)代謝疾病的發(fā)生[2]。此外，代謝障礙已被證明與系統(tǒng)氧化應(yīng)激密切相關(guān)，肥胖受試者體內(nèi)氧化應(yīng)激較高。動物研究還發(fā)現(xiàn)，喂食HFD 的小鼠可導(dǎo)致肝臟中活性氧（ROS）水平升高，降低線粒體代謝功能[3]。

目前，飲食調(diào)整和體育鍛煉干預(yù)仍被認為是調(diào)節(jié)代謝的有效方案[4]，許多天然提取物已被證明對代謝紊亂具有一定的療效。前瞻性研究表明，膳食多糖作為低熱量生物活性物質(zhì)，具有保護肝臟、抗糖尿病、抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用，對糖脂代謝和腸道菌群有顯著影響[5]。紅蕓豆中含有豐富的多糖（Polysaccharides from red kidney bean，PRK），能有效的改善小鼠糖脂代謝[6]。有證據(jù)表明，體育鍛煉對能量穩(wěn)態(tài)有積極影響，并對各種肥胖所致疾病起到預(yù)防作用，激活線粒體、組織更好得能量供應(yīng)鏈，改善能量平衡并更好地調(diào)節(jié)人體代謝[7]。體育運動已被證明可以增加骨骼肌細胞中線粒體的容量，提高線粒體氧化酶的活性，并調(diào)節(jié)線粒體中脂質(zhì)的含量，從而改善線粒體功能以充分促進糖脂氧化[8]。然而，PRK 聯(lián)合運動（Exercise，E）是否能更好地調(diào)節(jié)肥胖引起的代謝紊亂尚未在體內(nèi)進行研究。與此同時，這種聯(lián)合干預(yù)如何發(fā)揮其保護作用，在很大程度上仍未得到研究。在此，闡明其調(diào)控機制具有重要意義。因此，本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠糖脂代謝紊亂，采用PRK 灌胃結(jié)合運動進行處理，考察其通過Nrf2/NQO1/HO-1 信號通路發(fā)揮降糖、降脂以及抗氧化作用，并分析及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性C57BL/6 小鼠（SPF 級，18～22g，4 周齡）購自中國科學(xué)院上海動物實驗中心，動物合格證號SCXK（滬）2017-0005。將小鼠置于（24±0.5）℃，相對濕度60%的條件下，光照/黑暗循環(huán)12 h，在研究期間可自由進食和飲水；所有動物實驗均經(jīng)校動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2021-0107）；紅蕓豆 購自于河南省漯河市許慎市場；耐高溫α-淀粉酶 廣州華鈺生物科技有限公司；無水乙醇 山東蓄福源化工有限公司；木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；氯仿、正丁醇 阿爾塔科技有限公司；AB-8 大孔樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司；試劑盒TC、TG、LDL-C、HDL、SOD、MDA、GSH-Px、胰島素、TNF-α、IL-6、IL-1β南京建成生物工程研究所；10%多聚甲醛、兔抗人PPARα、FASN、Nrf2、NQO1、HO-1、β-actin、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗 碧云天生物技術(shù)有限公司。

CKX41-C31B 倒置熒光顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；ELx800 全自動酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；BIO-RAD 伯樂電泳成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GF02100 g 多功能粉碎機 上海霸輝工具有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司；冷凍干燥機 Thermo Savant 公司；V-800 型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCH 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅蕓豆多糖的提取 500 g 紅蕓豆，電熱鼓風(fēng)干燥箱50 ℃烘干，GF02100 g 多功能粉碎機粉碎過60 目篩制成豆莢粉，加入5000 mL 蒸餾水在磁力攪拌器中充分混合。95 ℃下加入10 mL 耐高溫α-淀粉酶（40000 U/g），持續(xù)攪拌30 min，冷卻至60 ℃。然后在混合物中加入12 mg 木瓜蛋白酶溶液（2000U/mg），在60 °C 水浴中孵育30 min，持續(xù)攪拌，以3500 r/min 離心15 min，取上清、濃縮，用四倍體積的無水乙醇在4 ℃下沉淀12 h，得到粗多糖。粗多糖用蒸餾水重新溶解，與1/3 體積的Sevag 試劑（氯仿/正丁醇（4:1，v/v））混合。充分攪拌30 min 后，以3500 r/min 離心10 min，重復(fù)脫蛋白3 次。所得溶液，濃縮至1/4 體積，AB-8 大孔樹脂純化，蒸餾水洗脫，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮、冷凍干燥機冷凍干燥得到紅蕓豆多糖[9]，經(jīng)苯酚-濃硫酸法檢測多糖含量為91.2%。

1.2.2 動物分組 小鼠隨機分為5 組（每組n=8），即對照組，正常飲食；模型組，高脂飲食；PRK 組，高脂飲食+400 mg/kg/d PRK；E 組，高脂飲食+運動；PRK+E 組，高脂飲食+400 mg/kg/天PRK+運動。

1.2.2.1 飲食喂養(yǎng)及給藥 小鼠正常飲食，含量為碳水化合物（72.1%）、蛋白質(zhì)（22.1%）和脂類（5.7%），總熱值約為3100 kcal/kg，或由碳水化合物（27.5%）、蛋白質(zhì)（14.5%）和脂類（58.8%）組成的高脂肪飲食，包括正常飼料585.4 g/kg，黃油310.9 g/kg，酪蛋白73.2 g/kg，礦物質(zhì)混合物24.6 g/kg，維生素混合物4.1 g/kg，DL-蛋氨酸1.8 g/kg。所有小鼠均給予正常自來水。同時PRK 組和PRK+E 組小鼠按照400 mg/kg劑量灌胃[9]，其余組給予等量的蒸餾水灌胃，每天1 次，連續(xù)12 周。在整個實驗期間，每周監(jiān)測體重。

1.2.2.2 運動實驗 PRK+E 組、E 組的所有小鼠每周連續(xù)進行5 次運動訓(xùn)練，連續(xù)12 周。從1 到4周，采用溫和的強度進行，在跑步機上運行的速度首先5 m/min 運動5 min，其次10 m/min 的速度運動30 min，然后以5 m/min 的速度運動5 min。從5 到12 周，小鼠首先5 m/min 運動5min，其次13 m/min速度運動30 min，然后5 m/min 運動5 min[10]。

1.2.3 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT） 在干預(yù)第12 周進行OGTT 實驗。在小鼠禁食過夜后，給小鼠注射葡萄糖（1 g/kg 體重）。每30 min 從尾靜脈抽血，持續(xù)2 h 以上，采用血糖儀測試空腹血糖（FBG）水平。

1.2.4 樣本采集 干預(yù)12 周后禁食過夜，異氟醚麻醉后摘除眼球處死。采集血樣，3500 r/min 離心15 min，得到血清。收集肝臟清洗并稱重，將肝組織分為兩部分，一部分用10%福爾馬林保存，另一部分在磷酸鹽緩沖液中均質(zhì)，3500 r/min 離心15min，得上清，備用。

1.2.5 生化指標(biāo)檢測 生化分析儀測定血清或肝臟生化指標(biāo)，包括血糖、胰島素、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）。肝臟上清采用試劑盒進行TC、TG、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）分析。采用酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成）檢測血液中胰島素、肝臟上清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-1β含量。

1.2.6 組織病理學(xué)分析 取肝組織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2～7.4）沖洗，然后固定于10%多聚甲醛溶液中。處理后的組織用石蠟包埋，切片（厚度4～5 μm），用蘇木精和伊紅染色（H&E），顯微鏡觀察。

1.2.7 Western Blot 實驗 將相同重量的組織放入加冰預(yù)冷的玻璃均質(zhì)器中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑（比例為100:1）。冰浴環(huán)境中進行研磨，靜置后，置于4 ℃，12000 r/min 離心15 min。吸取上清，用BCA 法測定其蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。然后加入5%脫脂奶粉封閉1 h，加入以下一抗，4 ℃過夜:兔抗PPARα（1:1000）、FASN（1:1000）、Nrf2（1:1000）、NQO1（1:1000）、HO-1（1:1000）。TBST 洗滌三次，相應(yīng)的二抗（1:1000）在室溫下孵育1 h，用TBST 清洗三次。β-肌動蛋白作為內(nèi)參，增強化學(xué)發(fā)光溶液（ECL）處理條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Graph Pad Prism（5.0 版）進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析和Newman-Keuls 多重比較檢驗。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體重量和肝臟重量的影響

由圖1 可知，與對照組比較，模型組小鼠的體重和肝質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01），提示高脂飲食會影響小鼠的正常代謝，導(dǎo)致小鼠的體重和脂肪增加，堆積過多的能量超過了身體在脂肪組織中儲存脂肪的能力，各種來源甘油三酯溢出到非脂肪組織，增加脂肪組織的肥大和增生，最終導(dǎo)致代謝紊亂[11-12]。本研究中，與PRK 組和E 組相比，PRK+E 組體重和肝質(zhì)量極顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），說明PRK 和E 對高脂飲食所致糖脂代謝紊亂具有一定的調(diào)節(jié)作用，這與Li 等[13]的研究基本一致，這說明營養(yǎng)與運動干預(yù)相結(jié)合可能是一種比單純飲食更有效的改善代謝綜合征進展的策略[14]。

圖1 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體質(zhì)量和肝臟重量的影響Fig.1 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on body weight and liver weight

2.2 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體血糖的影響

本研究評價了從紅蕓豆中分離出的多糖對高脂喂養(yǎng)小鼠代謝障礙的影響，由圖2 可知，與對照組比較，模型組血糖、胰島素水平極顯著增加（P＜0.01），提示模型組存在潛在的胰島素拮抗。胰島素抵抗是肥胖的主要特征之一，過量攝入高脂食物會產(chǎn)生胰島素拮抗，嚴(yán)重時出現(xiàn)2 型糖尿病、肥胖、血脂異常等代謝并發(fā)癥[15]。研究顯示，與模型組比較，PRK 組、E 組和PRK+E 組血糖、胰島素水平極顯著降低（P＜0.01），表明多糖或（和）運動均可以緩解高脂肪和高能量攝入引起的代謝障礙[16]。而且，與PRK 組、E 組比較，PRK+E 組血糖、胰島素水平極顯著降低（P＜0.01），表明說明PRK 和E 聯(lián)合干預(yù)能更有效改善胰島素拮抗。而且已有文獻[17]報道多糖可以緩解高脂肪和高能量攝入引起的肥胖和代謝障礙，并調(diào)控血糖水平和代謝性疾病[18]。

圖2 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體血糖的影響Fig.2 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on blood glucose

2.3 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對血脂的影響

血脂包括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。由圖3 可知，與對照組比較，模型組小鼠TG、TC、LDL含量極顯著升高，HDL 極顯著降低（P＜0.01），說明肥胖和食用高脂食品與血清和肝臟脂類（包括甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸和低密度脂蛋白膽固醇）的積累密切相關(guān)[19]。研究顯示，與模型組比較，PRK組、E 組和PRK+E 組TG、TC、LDL 含量極顯著降低（P＜0.01），HDL 極顯著增加（P＜0.01），證實PRK和（或）運動均可以減輕高脂飲食引起脂類代謝紊亂[20]。與PRK 組、E 組比較，PRK+E 組TG、TC、LDL 含量極顯著降低（P＜0.01），HDL 極顯著增加（P＜0.01），說明紅蕓豆多糖結(jié)合運動干預(yù)能有效緩解高脂飲食所引起的脂代謝紊亂。

圖3 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體血脂的影響Fig.3 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on body blood lipid

2.4 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體肝臟炎癥因子的影響

肥胖中常見的氧化應(yīng)激和ROS 生成可激活核因子κB（NF-κB）通路，進而促進促炎細胞因子包括TNF-α、IL-6 和IL-1β的增加。由圖4 可知，與對照組比較，模型組的TNF-α、IL-6 和IL-1β極顯著增加（P＜0.01），提示模型組小鼠可能存在炎癥反應(yīng)。而且已有研究表明，高脂飲食和氧化應(yīng)激可導(dǎo)致炎癥因子分泌過多，引起慢性炎癥，慢性炎癥通過脂肪組織分泌促炎細胞因子在肥胖的發(fā)病機制中起著重要作用[21]。研究顯示，與模型組比較，PRK 組、E 組和PRK+E 組TNF-α、IL-6 和IL-1β含量極顯著降低（P＜0.01），表明PRK 和（或）運動均可以減輕高脂飲食喂養(yǎng)所致高濃度的TNF-α、IL-6 和IL-1β。與PRK 組、E 組比較，PRK+E 組TNF-α、IL-6 和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），表明PRK 聯(lián)合運動均可顯著降低肝臟中TNF-α、IL-6 和IL-1β的濃度，緩解炎癥反應(yīng)，從而減輕肝臟損傷。

圖4 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體肝臟炎癥因子的影響Fig.4 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on liver inflammatory factors

2.5 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體肝臟TG、TC 的影響

TG、TC 均為脂類成分之一。研究報道，長期高熱量進食可加速TG 的合成，導(dǎo)致TG 在血液和肝臟中大量積累。如圖5 所示，與對照組比較，模型組小鼠肝臟TG、TC 極顯著上調(diào)（P＜0.01），說明長期喂食高脂會出現(xiàn)小鼠肝臟異常，導(dǎo)致脂肪的積累。經(jīng)PRK聯(lián)合運動干預(yù)12 周后，與PRK 組、E 組比較，PRK+E組肝臟中TG、TC 含量均極顯著降低（P＜0.01）。圖6肝臟組織學(xué)染色進一步證實了這一點，與對照組比較，模型組肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，這說明動物模型已經(jīng)成功建立。與模型組比較，PRK、E 或PRK+E 組肝臟脂質(zhì)沉積物明顯減少，中央靜脈和小葉結(jié)構(gòu)清晰。參與脂肪酸合成的基因FASN 是脂質(zhì)生物合成的主要貢獻因子，脂肪酸氧化基因PPARα可抑制脂肪酸合成[22]。本研究中，與對照組比較，模型組肥胖小鼠中FASN 的表達量極顯著增加（P＜0.01），PPARα的表達量極顯著減低（P＜0.01），這與上述完全一致。而經(jīng)過PRK、E 或PRK+E 處理后，與模型組比較，PRK、E 或PRK+E 組FASN的表達量極顯著降低（P＜0.01），PPARα的表達量極顯著增加（P＜0.01），說明處理組均能有效抑制脂類異常變化，有助于降低肝臟脂質(zhì)積累，并首次證明了PRK 聯(lián)合E 通過下調(diào)脂肪酸通路表現(xiàn)出較好的協(xié)同效應(yīng)，從而改善肥胖所導(dǎo)致的異常。

圖5 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體肝臟TG、TC 的影響Fig.5 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on liver TG and TC

圖6 肝切片H&E 染色（200×）Fig.6 H&E staining of liver sections (200×)

2.6 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體氧化應(yīng)激的影響

由圖7 可知，與對照組比較，模型組MDA 水平極顯著升高（P＜0.01），GSH-Px 和SOD 活性極顯著降低（P＜0.01），說明高脂飲食喂養(yǎng)小鼠會導(dǎo)致肝臟組織中氧化應(yīng)激發(fā)生，而且氧化應(yīng)激被認為是胰島素抵抗、肥胖的主要執(zhí)行因子之一，氧化應(yīng)激的升高被認為先于高脂飲食引起的胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生和發(fā)展[23]。本研究中，與模型組比較，PRK、E 或PRK+E 聯(lián)合干預(yù)后，GSH-Px 和SOD 極顯著增加（P＜0.01），MDA 含量極顯著降低（P＜0.01），說明PRK、E 或PRK+E 均能顯著改善飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激（P＜0.05），其中PRK+E 干預(yù)效果更加明顯，這些結(jié)果清楚地表明，聯(lián)合干預(yù)能顯著保護肝臟免受肥胖誘導(dǎo)的氧化損傷，表現(xiàn)出比PRK 或E 組更充分的作用。另外，與PRK 和（或）E 處理比較，PRK 和E 聯(lián)合使用能極顯著增加Nrf2、NQO1 和HO-1 表達水平（P＜0.01），說明PRK 和E 聯(lián)合使用能顯著增強Nrf2 介導(dǎo)的II 相酶系統(tǒng)，特別是其下游基因NQO1 和HO-1，其可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激發(fā)揮保護作用，減少炎癥激活，降低炎癥的發(fā)生與發(fā)展[24]。

圖7 紅蕓豆多糖聯(lián)合運動對機體氧化應(yīng)激的影響Fig.7 Effects of polysaccharide from red kidney bean combined with exercise on oxidative stress

3 結(jié)論

目前的研究表明，PRK、E 和PRK+E 可以改善高脂飲食引起小鼠的體重和脂肪堆積，降低高脂飲食引起的肝臟炎癥，說明 PRK 和E 對高脂飲食所致糖脂代謝紊亂具有一定的調(diào)節(jié)作用。此外，本研究表明，與單獨使用PRK 或E 干預(yù)的小鼠相比，PRK+E干預(yù)對血脂、血糖和肝臟炎癥具有額外的益處。更重要的是，PRK+E 組的體重下降幅度大于PRK 或 E組，表明PRK 和 E 的組合對體重產(chǎn)生更有效的影響。本研究中，與對照組相比，PRK 和 E 可提高GSH-Px和SOD 的抗氧化酶活性，降低MDA 含量，同時激活Nrf2 信號通路。此外，TNF-α、IL-6 和IL-1β在 PRK+E 組中極顯著降低（P＜0.01），說明PRK+E 對Nrf2 信號通路具有一定的影響，PRK 聯(lián)合E 干預(yù)可以通過上調(diào)Nrf2、NQO1 和HO-1 有效減輕肥胖誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激來保護肝臟，以應(yīng)對肥胖誘導(dǎo)的代謝障礙，保護機體能量代謝，改善肝臟炎癥。與PRK 或E干預(yù)相比，該組合通過減少脂質(zhì)積累、抑制炎癥和氧化應(yīng)激，并表現(xiàn)出更大的有效協(xié)同效益，紅蕓豆多糖和運動的結(jié)合可能是一種可行的非藥物干預(yù)，以改善肥胖引起的代謝障礙。其調(diào)控作用與降低FASN 的表達，增加PPARα水平有關(guān)，并通過上調(diào)Nrf2、NQO1和HO-1 水平，降低氧化應(yīng)激，減輕肝臟炎癥。因此PRK+E 的組合可能是干預(yù)高脂飲食所致的糖脂代謝紊亂的一種有前途的方法。