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    乳腺癌細(xì)胞著絲粒蛋白W表達(dá)水平對抗腫瘤藥物TEOA敏感性的影響

    2023-08-09 07:13:06王陸洋張寅昊孫曉彤李可意周俊宇唐陸勝楊陳王瑩
    浙江醫(yī)學(xué) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:存活率批號分組

    王陸洋 張寅昊 孫曉彤 李可意 周俊宇 唐陸勝 楊陳 王瑩

    最新全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示,女性乳腺癌發(fā)病率達(dá)31%,且預(yù)后差、復(fù)發(fā)率和死亡率均較高[1-4]。新型免疫療法被認(rèn)為可有效提高患者療效和相對生存率,但在低收入人群較多的發(fā)展中國家,免疫療法的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)仍然較重[5-6],術(shù)后化療仍是現(xiàn)階段治療乳腺癌的一線療法。但長期使用化療藥物極易產(chǎn)生耐藥性,患者預(yù)后不理想[7-8]。因此,尋找更為有效的治療方案成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[9]。早期篩查乳腺癌并發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)有助于降低乳腺癌死亡率,是延長患者生存期的新策略[10-11]。著絲粒蛋白W(centromeric protein W,CENPW)是構(gòu)成著絲粒核小體的重要組成部分,在多種腫瘤組織中高表達(dá)[12-13]。已有研究發(fā)現(xiàn),CENPW 可影響結(jié)腸癌細(xì)胞遷移,并通過TGF-β 信號通路影響肺癌進(jìn)程[14-15]。此外,緊密連接蛋白1(claudin-1,CLDN1)是細(xì)胞間通訊和調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵,同樣在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。Wang 等[18]研究認(rèn)為CENPW 可能是乳腺癌發(fā)展過程中的重要生物標(biāo)志物,下調(diào)CENPW 表達(dá)是抑制乳腺癌發(fā)展的一種前瞻性策略。2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸(2α,3α,24-thrihydroxyurs-12-en-28-oicacid,TEOA)是從草藥毛花獼猴桃根中提純出的一種五環(huán)三萜類化合物,表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性[19]。本研究探討乳腺癌細(xì)胞CENPW 表達(dá)水平對抗腫瘤藥物TEOA 敏感性的影響,以期提高TEOA 對乳腺癌的治療效果。

    1 材料和方法

    1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231 購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,在含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5% CO2,細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。TEOA(粉劑,10 mg)由浙江大學(xué)藥學(xué)院贈予,用二甲基亞砜配成10 mmol/L的母液,備用。無血清培養(yǎng)基購自浙江森瑞生物科技有限公司。轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司。兩對靶向CENPW 的沉默RNA(siRNA:si1-CENPW、si2-CENPW)和陰性對照siRNA-NC(si-NC)序列由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。細(xì)胞增殖與毒性檢測(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測試劑盒、Hoechst 核染色試劑、碘化丙啶染色試劑和辣根過氧化物酶-偶聯(lián)二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。增強(qiáng)電化學(xué)(enhanced chemiluminescence-plus,ECL-Plus)超敏發(fā)光液購自杭州弗德生物科技有限公司。RIPA 細(xì)胞裂解液購自美國Sigma-Aldrich 公司。CENPW(批號:NBP1-70496)抗體購自美國Novus 公司。CLDN1(批號:ab242370)抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD-1;批號:ab134175)抗體、轉(zhuǎn)錄抑制因子2 蛋白(Slug;批號:ab302780)抗體、去乙?;? 蛋白(Sirtuin 3,SIRT3;批號:ab217319)抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2;批號:ab182858)抗體和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin;批號:ab8227)抗體購自英國Abcam 公司。

    1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-NC 序列:F-UUCUCCGAACGUGUCACGU, R-AAGAGGCUUGCACAGUGCA; si1-CENPW 序列:F-GCAGAAGAGUCCAGGACAA,RCGUCUUCUCAGGUCCUGUU;si2-CENPW 序列:FGGAGAAAA-GUGGUGACUUA,R-CCUCUUUUCACCACUGAAU。取對數(shù)生長期的MDA-MB-231 細(xì)胞,調(diào)整密度為5×105個(gè)/孔,接種于6 孔板,培養(yǎng)24 h。根據(jù)LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒方法,依次加入稀釋后的si-NC、si1-CENPW 和si2-CENPW,使用無血清培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育12 h 后更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h,得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

    1.3 細(xì)胞分組和處理 分組1:細(xì)胞分為si-NC 組(轉(zhuǎn)染si-NC 序列)、si1-CENPW 組(轉(zhuǎn)染si1-CENPW 序列)和si2-CENPW組(轉(zhuǎn)染si2-CENPW序列)。分組2:細(xì)胞分為si-NC 組、si1-CENPW 組、si-NC+TEOA 組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC序列后,再經(jīng)TEOA處理)和si1-CENPW+TEOA組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si1-CENPW序列后,再經(jīng)TEOA處理)。

    1.4 3 組細(xì)胞CENPW、CLDN1 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot 法。取分組1 的3 組細(xì)胞,1 000 r/min 離心3 min,棄去上清液加入RIPA 裂解液,提取蛋白溶液。根據(jù)BCA 蛋白檢測試劑盒檢測每組蛋白樣品濃度,稀釋樣品蛋白濃度至2 μmol/L。各組蛋白樣品加入到含10% SDS-PAGE 的凝膠中電泳分離,并將其標(biāo)記在聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fldoride,PVDF)膜上。印跡的PVDF 膜放置在5%的脫脂牛奶中常溫封閉1 h,加入CENPW、CLDN1 一抗,4 ℃搖床孵育過夜。取出樣品,分別加入二抗,室溫?fù)u床孵育1 h。用ECL-Plus 超敏發(fā)光液于伯樂凝膠成像儀中觀察印跡。以β-actin作為內(nèi)參,計(jì)算CENPW、CLDN1 蛋白相對表達(dá)量。

    1.5 3 組細(xì)胞遷移能力的檢測 采用貼壁細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取分組1 的3 組細(xì)胞分別接種到6 孔板,待細(xì)胞生長至95%細(xì)胞密度時(shí),用10 μL 移液管尖劃開細(xì)胞層,在0 和24 h 采集圖像,利用Image J 軟件測量劃痕距離,評估細(xì)胞遷移能力。

    1.6 兩組細(xì)胞存活率的檢測 采用CCK-8 法。取分組2 的si-NC+TEOA 組和si1-CENPW+TEOA 組細(xì)胞。調(diào)整密度為1×104個(gè)/孔,接種于96 孔板中。分別用含0、40、45、50 μmol/L TEOA 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。加入10 μL/孔CCK-8 孵育1.5 h,酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的吸光度值,計(jì)算兩組細(xì)胞存活率。

    1.7 兩組細(xì)胞死亡率的檢測 采用碘化丙啶染色法。取分組2 的si-NC+TEOA 組和si1-CENPW+TEOA 組細(xì)胞,調(diào)整密度為80%,接種于6 孔板中并培養(yǎng)至貼壁。加入50 μmol/L TEOA,1.5 mL/孔,培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)移至6孔板,加入1 g/L 碘化丙啶染色試劑,1.5 μL/孔,避光染色15 min,繼用Hoechst 染色5 min。使用熒光顯微鏡觀察拍照并計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞死亡率。

    1.8 4 組細(xì)胞中cyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)的檢測 取分組2 的4 組細(xì)胞,參照1.4.1 方法,采用Western blot 法檢測計(jì)算CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0 和SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3 組細(xì)胞CENPW、CLDN1 蛋白表達(dá)水平的比較與si-NC 組相比,si1-CENPW 組和si2-CENPW 組的CENPW、CLDN1 蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖1。

    圖1 3 組細(xì)胞CENPW、CLDN1 蛋白表達(dá)的比較(A:蛋白電泳圖;B:CENPW、CLDN1 蛋白相對表達(dá)水平)

    2.2 3 組細(xì)胞遷移能力的比較 相比si-NC 組,si1-CENPW 組和si2-CENPW 組的劃痕距離較寬(P<0.05),提示細(xì)胞遷移相對距離較短,細(xì)胞遷移能力降低,見圖2。

    圖2 3 組細(xì)胞遷移能力的比較(A:貼壁細(xì)胞劃痕圖;B:細(xì)胞劃痕相對距離)

    2.3 兩組細(xì)胞存活率的比較 隨著TEOA 藥物濃度升高,si1-CENPW+TEOA 組細(xì)胞存活率逐漸降低。在藥物濃度為50 μmol/L 時(shí),si1-CENPW+TEOA 組與si-NC+TEOA 組細(xì)胞存活率差值最大;相比si-NC+TEOA組,45、50 μmol/L TEOA 處理下si1-CENPW+TEOA 組的細(xì)胞存活率明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖3。

    圖3 兩組細(xì)胞存活率的比較

    2.4 兩組細(xì)胞死亡率的比較 碘化丙啶和Hoechst染色結(jié)果顯示,當(dāng)TEOA 藥物濃度為50 μmol/L 時(shí),si1-CENPW+TEOA 組的細(xì)胞死亡數(shù)量較si-NC+TEOA 組顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4(插頁)。

    圖4 兩組細(xì)胞死亡率的比較(A:碘化丙啶熒光染色圖,×200;B:細(xì)胞死亡率)

    2.5 4 組細(xì)胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的比較 相比si-NC+TEOA 組,si1-CENPW+TEOA 組中CyclinD-1、Slug、SIRT3 的蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。相比si1-CENPW 組,si1-CENPW+TEOA 組中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見圖5。

    圖5 4 組細(xì)胞CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的比較(A:蛋白電泳圖;B:CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 蛋白相對表達(dá)水平)

    3 討論

    乳腺癌仍然是近年來女性中發(fā)病率最高的癌癥,其中浸潤性乳腺癌是原發(fā)性乳腺癌最常見的病理類型,治療方案一般為術(shù)后化療[20-21]。由于化療藥物往往伴隨著嚴(yán)重的毒副反應(yīng)和耐藥性,乳腺癌患者的預(yù)后總是差強(qiáng)人意[22-24]。因此,在基因?qū)用嫔祥_發(fā)更有效、更小毒性反應(yīng)的治療策略是必要的[25-26]。著絲粒蛋白的調(diào)控與腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期密切相關(guān)[27-28],并通過核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)1 蛋白和TGF-β 信號通路加速細(xì)胞轉(zhuǎn)化[29-30]。CENPW 是一種有前景的基因靶點(diǎn),干擾其表達(dá)有較好的抑癌效果[31-32]。為闡明CENPW 基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵作用,本研究構(gòu)建了干擾CENPW 基因表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)抑制CENPW 表達(dá)的同時(shí)也阻礙了CLDN1 的表達(dá)。CLDN1 在具有免疫逃逸特性的腫瘤病理學(xué)中起關(guān)鍵作用,干擾CLDN1 的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[33-35]。兩者之間存在上下游關(guān)系并呈正相關(guān)調(diào)節(jié),使細(xì)胞遷移能力顯著降低。

    將CENPW 作為乳腺癌進(jìn)展的預(yù)測因子,以干擾其表達(dá)為切入點(diǎn)聯(lián)合化療藥物治療有助于開發(fā)具有創(chuàng)新性的乳腺癌治療策略。TEOA 是從毛茛根中分離出來含量最多的五環(huán)三萜化合物,在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌活性,并通過誘導(dǎo)線粒體活性氧的產(chǎn)生引發(fā)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激來達(dá)到抑癌效果[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn),TEOA 對CENPW 表達(dá)失調(diào)的乳腺癌細(xì)胞造成的殺傷效果更強(qiáng),低濃度TEOA 即可殺傷更多細(xì)胞。細(xì)胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平在抑癌過程中發(fā)揮著重要作用,抑制CyclinD-1 的表達(dá)能阻礙細(xì)胞增殖,干擾Slug 的表達(dá)能阻礙其調(diào)控的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,SIRT3 的缺失可導(dǎo)致線粒體活性氧水平異常并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,下調(diào)Bcl-2 有助于細(xì)胞凋亡的發(fā)生[38-43]。本研究結(jié)果表明,TEOA 抑制了乳腺癌細(xì)胞中CyclinD-1、Slug、SIRT3、Bcl-2 的蛋白表達(dá),而這一效果在CENPW 表達(dá)失調(diào)的細(xì)胞中更為顯著。干擾CENPW 的表達(dá)能增加細(xì)胞對抗腫瘤藥物TEOA 的敏感性,通過減少藥物用量有效降低TEOA 的毒性反應(yīng)并存在緩解耐藥性的可能性。然而一個(gè)基因調(diào)節(jié)多種代謝途徑,其具體作用機(jī)制不能用單一的信號通路來清楚地解釋,因此本研究的意義尚存在一定局限,需通過進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

    綜上所述,本研究證實(shí)干擾CENPW 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為,與TEOA 抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用可對乳腺癌細(xì)胞起抑制效果。但本研究僅局限于細(xì)胞生物學(xué)層面,在體內(nèi)是否存在同樣高效的抑癌效果,有待進(jìn)一步研究。

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