固相萃取-氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測生活飲用水中8種酰胺類除草劑殘留

曹忠波，谷洋，張媛媛，劉曉晶，華正罡

（1.遼寧省疾病預(yù)防控制中心,遼寧省環(huán)境與人群健康監(jiān)測重點實驗室,沈陽 110172；2.遼寧省檢驗檢測驗證中心,沈陽 110033）

酰胺類除草劑主要用來防治一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草,對多種禾本科雙子葉植物有較強的殺毒作用[1]。廣泛應(yīng)用于玉米、花生、大豆、棉花等農(nóng)作物生產(chǎn)種植中,是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的一類除草劑[2]。酰胺類除草劑的土壤吸附常數(shù)比較低,水溶性強,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用后易轉(zhuǎn)移到地表水和淺層地下水中,對飲用水水源可能造成污染,進(jìn)而威脅人類飲水安全及健康[3]。

酰胺類除草劑進(jìn)入環(huán)境后,容易轉(zhuǎn)化為二烷基苯醌亞胺,可增加人和動物發(fā)生癌變的風(fēng)險[4-5]。甲草胺和乙草胺已先后被美國國家環(huán)境保護署(EPA)列為B-2 類致癌物[6]。近年來,酰胺類除草劑在環(huán)境樣品中殘留的關(guān)注度逐漸提高。于志勇等[7]采用固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測方法調(diào)查了我國一些主要城市的水源水和出廠水中的除草劑乙草胺殘留水平。結(jié)果表明,水源水中乙草胺的檢出率為66.9%,乙草胺的污染比較普遍。從區(qū)域上看,東北地區(qū)的平均檢出濃度遠(yuǎn)高于西北和西南地區(qū)；從水源類型上看,湖庫型和河流型水源水中乙草胺濃度遠(yuǎn)高于地下型水源,污染嚴(yán)重。我國現(xiàn)行GB/T 5750—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》中還沒有針對8種酰胺類除草劑建立檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此,建立一個快速、準(zhǔn)確、靈敏度高檢測方法,對水源水的污染狀況評價及人體飲用水健康風(fēng)險評估等研究有積極幫助。

目前,酰胺類除草劑農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜(GC)法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)法[10]、高效液相色譜 (HPLC)法[11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS)法[12]等。氣相色譜法和高效液相色譜法用于定性分析時容易出現(xiàn)結(jié)果假陽性、方法的檢測靈敏度低等問題。串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法有更精準(zhǔn)的選擇性、特異性,能有效地降低噪音,提高信噪比,從而提高靈敏度和測定結(jié)果的準(zhǔn)確度,避免假陽性或者假陰性的結(jié)果,可以很好的解決應(yīng)用GC、LC、GC-MS 法檢測復(fù)雜基質(zhì)樣品中多種酰胺類除草劑遇到的問題。

筆者采用固相萃取凈化技術(shù)(SPE)對大體積水體樣本進(jìn)行富集、凈化,并用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS)儀進(jìn)行檢測,建立生活飲用水中酰胺類除草劑的快捷、高效、準(zhǔn)確的分析方法,以滿足生活飲用水中多種酰胺類除草劑殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-7890+MS/MS-7000B型 ,美國安捷倫科技有限公司。

氮吹儀：Turbo VapⅡ型,美國 Caliper公司。

超純水機：IQ7000型,美國密理博公司。

自動固相萃取儀：Sepaths-10型,北京萊伯泰科儀器有限公司。

分析天平：XS205,感量為0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多集團。

C18固相萃取小柱：6 mL/500 mg,美國安捷倫科技有限公司。

氨基固相萃取小柱：6 mL/500 mg,美國安捷倫科技有限公司。

HLB 固相萃取小柱：6 mL/500 mg,美國沃特世公司。

酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品：毒草胺（純度不小于99.6%）、乙草胺（純度不小于97.9%）、甲草胺（純度不小于99.9%）、異丙甲草胺（純度不小于98.5%）、雙苯酰草胺（純度不小于98.5%）、丁草胺（純度不小于96.3%）、敵草胺（純度不小于99.8%）、丙草胺（純度不小于99.8%）,德國DR.Ehrenstorfer GmbH公司。

環(huán)氧七氯B：純度不小于99.3%,德國DR.Ehrenstorfer GmbH公司。

二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、正己烷：均為色譜純,美國Fisher公司。

無水硫酸鈉：分析純,經(jīng)450 ℃烘烤2 h,置于干燥器內(nèi)備用,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

8 種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL,準(zhǔn)確稱取8種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品各10.0 mg于10 mL容量瓶中,加入丙酮溶解并定容至標(biāo)線。于4 ℃冰箱中避光保存,于6 個月內(nèi)使用。

8 種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：各組分質(zhì)量濃度均為1.00 mg/L,用丙酮將8 種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋、定容,置于冰箱中避光保存,于1個月內(nèi)使用。

環(huán)氧七氯B 標(biāo)準(zhǔn)溶液：20.0 mg/L,準(zhǔn)確稱取環(huán)氧七氯B 10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL容量瓶中,加入丙酮溶解,定容至標(biāo)線,取溶液適量,再用丙酮稀釋至50 倍體積,于4 ℃冰箱中避光保存,于1 個月內(nèi)使用。

氮氣：純度不小于99.999%,沈陽廣泰氣體有限公司。

氦氣：純度不小于99.999%,沈陽廣泰氣體有限公司。

實驗用水：經(jīng)超純水機制得,現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS UI 柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm,美國安捷倫科技有限公司）彈性石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：280 ℃。柱溫：初始溫度為85 ℃,以15 ℃/min 升溫至190 ℃,再以5 ℃/min 升溫至225 ℃,然后以20 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min；載氣：氦氣；柱流量：1.0 mL/min,恒流模式；進(jìn)樣模式：不分流；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；掃描時間：0.45 s；監(jiān)測掃描模式：MRM 模式；碰撞氣：氮氣,流量為1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣,流量為2.25 mL/min；溶劑延遲：8 min；8種酰胺類除草劑保留時間、定量離子、定性離子和碰撞能量見表1。

表1 8種酰胺類除草劑保留時間、母離子、子離子和碰撞能量

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集與運輸

用硬質(zhì)磨口棕色玻璃瓶采集樣品。每升水樣中加入約100 mg 抗壞血酸,注滿樣品瓶,上部不留有空間并加蓋密封,于4℃以下冷藏、避光保存和運輸。采樣后在24 h內(nèi)對樣品進(jìn)行萃取,萃取后若不能及時測定,應(yīng)于4℃以下避光冷藏,7 d 內(nèi)完成分析測定。

1.3.2 樣品制備

將水樣于室溫放置,若水樣中有細(xì)小顆粒物而較為渾濁,可使用0.45 μm水系濾膜過濾,便于固相萃取柱萃取水樣品,防止堵塞。

固相萃取過程：依次用5 mL二氯甲烷、5 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇、10 mL純水以3 mL/min流量過柱活化。準(zhǔn)確量取500 mL 水樣,以15 mL/min 的流量過C18固相萃取柱。用氮氣吹干固相萃取柱,去除水分。用5 mL乙酸乙酯以3 mL/min流速洗脫固相萃取小柱,并收集洗脫液。如果洗脫液中含有水分,再用無水硫酸鈉去除。將洗脫液置入氮氣濃縮儀中,于40 ℃下吹至近干。加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,用乙酸乙酯復(fù)溶定容1.0 mL,上機測定。

1.3.3 樣品測定

處理后的樣品溶液上機測定,以保留時間定性,色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣pH值的選擇

文獻(xiàn)[13]報道,對水樣中半揮發(fā)性有機物的檢測過程中,可通過調(diào)節(jié)水樣的pH來提高化合物穩(wěn)定性及目標(biāo)化合物萃取效率。實驗考察了以C18為固相萃取柱時pH分別為2、7時的樣品萃取效率,結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,當(dāng)pH 7 時8 種酰胺類除草劑的回收率為80.7%～99.2%,均高于pH 2 時的回收率（47.8%～95.2%）,因此筆者最終選擇調(diào)節(jié)水樣pH 7進(jìn)行測定。

圖1 8種酰胺類除草在不同pH值條件下的回收率（n=6）

2.2 固相萃取柱選擇

選擇合適的吸附劑對目標(biāo)化合物進(jìn)行富集及對干擾物質(zhì)進(jìn)行分離至關(guān)重要[14]。目前商品化的固相萃取柱種類繁多,主要根據(jù)目標(biāo)化合物理化性質(zhì)及基體中的主要雜質(zhì)種類進(jìn)行固相萃取柱的選擇。試驗比較了C18、HLB及NH23種固相萃取小柱對樣品中目標(biāo)物的富集和凈化效果,對比目標(biāo)物的回收率,結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果表明,NH2柱和HLB 柱只有對雙苯酰草胺的回收率大于85%,另7 種酰胺類除草劑樣品回收率均低于80%,不能滿足實驗要求。而經(jīng)C18柱萃取的樣品回收率為85.6%～103.5%,能滿足分析要求,因此選擇C18柱萃取樣品。

圖2 8種酰胺類除草在不同固相萃取條件下的回收率（n=6）

2.3 固相萃取柱活化及洗脫溶劑優(yōu)化

酰胺類除草劑均為中等極性,實驗中8 種目標(biāo)化合物的極性具有一定差異。樣品溶液取得理想的凈化效果關(guān)鍵因素取決于合適洗脫溶液和洗脫體積。在洗脫階段,分別考察了4種溶劑及溶劑組合：5 mL 乙酸乙酯、5 mL 二氯甲烷、5 mL 乙酸乙酯-正己烷（體積比為1∶1）、5 mL 丙酮-正己烷（體積比為1∶1）進(jìn)行洗脫試驗,結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明,使用乙酸乙酯時,C18固相萃取柱吸附的8種酰胺類除草劑回收率均較高（88.6%～102.5%）,故選擇用5 mL乙酸乙酯洗脫。

圖3 8種酰胺類除草在不同洗脫溶液下的回收率（n=6）

2.4 質(zhì)譜離子源溫度的優(yōu)化

質(zhì)譜離子源溫度是保證化合物離子化效率的關(guān)鍵因素之一。在一定范圍內(nèi)提高離子源溫度,可增加化合物的離子化效率,從而提高檢測靈敏度,還可以起到凈化保護離子源的作用,防止高沸點化合物的殘留[15]。分別設(shè)定離子源溫度為230、250、280 ℃,考察離子源溫度對8 種酰胺類除草劑的色譜峰面積的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可知,毒草胺、異丙醇草胺、雙苯酰草胺3 種除草劑的色譜峰面積隨離子源溫度的升高顯著增大；乙草胺、甲草胺、丁草胺、敵草胺、丙草胺色譜峰面積提高不顯著。故選擇離子源溫度為280℃。

圖4 不同離子源溫度對應(yīng)的8種酰胺類除草劑色譜峰面積

2.5 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

酰胺類除草劑的分子極性較弱,因此選擇極性較小的HP-5MS UI 彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）。優(yōu)化氣相色譜柱溫的升溫程序,使8 種酰胺類除草劑色譜峰峰形尖銳,對稱性好,具有良好的分離度。

先采用全掃描模式在m/z50～550 范圍內(nèi)對8種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,得到各種酰胺類除草劑的相對保留時間和質(zhì)譜圖。選擇分子離子峰或相對豐度較高的特征碎片峰作為母離子。再用離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,選擇豐度較高的合理斷裂碎片離子作為子離子。經(jīng)優(yōu)化最終確定8種酰胺類除草劑母離子、子離子和碰撞能量,結(jié)果見表1。圖5 為8 種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測模式總離子流圖,圖6 為空白樣品總離子流圖,圖7為加標(biāo)樣品總離子流圖。

圖5 8種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖（MRM）

圖6 空白樣品總離子流圖

圖7 加標(biāo)樣品加標(biāo)總離子流圖

2.6 線性范圍與檢出限

精確吸取一定量的8種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液,逐級用乙酸乙酯稀釋,配制成8 種酰胺類除草劑質(zhì)量濃度均為10～250 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以8種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo),除草劑定量離子色譜峰面積和內(nèi)標(biāo)物定量離子色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3倍的信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限,10倍的信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限。

8種除草劑組份線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及檢出限見表2。

表2 線性關(guān)系和方法檢出限

2.7 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗

在空白水樣中添加8種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成低、中、高三個濃度水平的加標(biāo)樣品,每種濃度水平配制6 份樣品,按1.3 方法進(jìn)行處理測定,計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表3。由表3 可知,8 種酰胺類除草劑回收率為81.1%～104.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～6.3%,說明該方法準(zhǔn)確度和精密度符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表3 3種濃度加標(biāo)回收試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

建立了C18固相萃取柱富集、凈化生活飲用水樣品中8種酰胺類除草劑,利用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法。該方法具有易操作、線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度和靈敏度高、對環(huán)境友好等優(yōu)點,適用于生活飲用水中多種酰胺除草劑殘留檢測同時檢測。為評價水體污染狀況和人體健康風(fēng)險評估等相關(guān)研究提供支持和幫助。