一種嵌合式DNA 聚合酶的表達(dá)及功能驗(yàn)證

王 堯，王玉玲，張聞慧，吳銀榮，趙夢(mèng)然，羅忠宜，林 森

（1.安陽工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽 455000；2.澳大利亞外科診斷有限公司，澳大利亞 悉尼 2069；3.安陽康圣環(huán)球醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，河南 安陽 455000）

DNA 的組成成分是脫氧核糖核酸[1]，DNA 聚合酶是DNA 合成的主要功能大分子，通過4 種不同的脫氧核苷酸導(dǎo)入單鏈模板DNA 實(shí)現(xiàn)副本DNA 合成。在上述過程中，單個(gè)核苷酸與模板DNA 鏈上的堿基通過DNA 聚合酶實(shí)現(xiàn)配對(duì)。通過該過程高保真聚合酶被廣泛應(yīng)用到病毒分子研究、分子診斷以及克隆和合成生物學(xué)等領(lǐng)域。

目前，常見的聚合酶中，Taq DNA 聚合酶是用于PCR 擴(kuò)增的最常見的酶[2]。耐熱性極強(qiáng)，在95℃下半衰期為40 min，擴(kuò)增能力強(qiáng)，但保真性較差。Vent DNA 聚合酶的保真度比觀察到的Taq DNA 聚合酶高5~15 倍。Thermo Scientific Phusion高保真DNA 聚合酶為高性能PCR 設(shè)定了黃金標(biāo)準(zhǔn)[3]。Tth DNA 聚合酶是一種具有內(nèi)在逆轉(zhuǎn)錄酶活性的熱穩(wěn)定DNA 聚合酶[4]。Pfu DNA 聚合酶是一種從Pyrococcus furiosus 中分離出來的約90 kDa 的高保真、熱穩(wěn)定的酶。Phusion 高保真DNA聚合酶的誤差率僅是Taq 的1/50，是Pfu 的1/6。除上述聚合酶外，Q5 高保真DNA 聚合酶為保真度和穩(wěn)定性設(shè)定了新標(biāo)準(zhǔn)，其保真度放大率最高（比Taq 高約280 倍），Q5 具有超低的誤差率。Q5 由一種新型、可熱的DNA 聚合酶組成，該聚合酶融合到增強(qiáng)過程性的Sso7d DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，提高了性能的速度、保真度和可靠性[5]。Q5 熱啟動(dòng)DNA 聚合酶利用獨(dú)特的aptamer 來增加熱啟動(dòng)便利性，而無需添加激活步驟。高保真聚合酶精度的提高使它們比標(biāo)準(zhǔn)Taq 聚合酶更適合敏感的下游應(yīng)用[6]。使用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)生DNA 進(jìn)行測(cè)序時(shí)應(yīng)首選高保真聚合酶，主要因?yàn)門aq 聚合酶在PCR 的擴(kuò)增子中會(huì)引起不匹配，影響測(cè)序數(shù)據(jù)的分析。因此，高保真聚合酶比Taq 聚合酶的應(yīng)用領(lǐng)域更廣[7]。

本研究將通過嘗試不同培養(yǎng)基、純度和濃度等物理?xiàng)l件，快速和經(jīng)濟(jì)地將本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的嵌合DNA 聚合酶模板進(jìn)行重組、表達(dá)與純化，從而得到一種能比市面上一些低保真度的聚合酶更好、更快地測(cè)出所需要數(shù)據(jù)、有良好保真度和穩(wěn)健性的高精確度聚合酶，降低實(shí)驗(yàn)過程中聚合酶的出錯(cuò)率，節(jié)約反應(yīng)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 嵌合DNA 聚合酶的基因合成

目的基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，亞克隆至pET11a 載體（NdeI 和EcoRI酶切位點(diǎn)之間），載體攜帶氨芐西林（AMP）抗性，用于陽性菌株的篩選。

1.1.2 儀器設(shè)備

全自動(dòng)臺(tái)式快速蒸汽滅菌器、ZEY-2102C 37 度恒溫箱、實(shí)用垂直單人凈化工作臺(tái)、-80℃超低溫保存箱、4℃冰箱、THZ-82B 氣浴恒溫震蕩器、自動(dòng)紫外可見分光光度計(jì)、INFORS HT恒溫箱、SHAEER 搖床、H4-21KR 落地式高速冷凍離心機(jī)、電子天平、ATS 儀器高壓破碎、磁力攪拌器、OHAUS-PH 儀、Nano-300 Microspetrophotometer、SCIOGE 快速離心機(jī)、PCR 儀、DYY-12 型電泳儀及其他儀器設(shè)備。

1.1.3 主要試劑

50 mol/L Tris-HCl，2 mol/L EDTA，1 mol/L DTT，10 % 甘 油，300 mol/L NaCl，ddH20，Lysis buffer(pH=8)，Elution buffer(pH=8)，Washing buffer 1 (pH=8)，Washing buffer 2 (pH=8)，Binding buffer(pH=8)。

1.1.4 主要培養(yǎng)基配制

1 L 液 體LB 配 方：10 g Tryptone，5 g Yeast Extract， 10 g NaCl， 0.1 g Glucose。

200 mL 固體LB 配方：2 g Tryptone，1 g Yeast Extract，2 g NaCl， 0.02 g Glucose，2.6 g Agar。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白表達(dá)

超凈臺(tái)內(nèi)把菌涂在含AMP 的固體LB 培養(yǎng)皿，封口膜封口，放在37℃恒溫箱培養(yǎng)12~16 h。用移液槍槍頭取單菌落放在新的含AMP 固體LB培養(yǎng)皿上，用滅菌后的接種環(huán)進(jìn)行涂開（涂3~4遍）越密越好，封口膜封口，放37℃恒溫箱培養(yǎng)12~16 h。在液體LB中加入AMP抗生素（1∶1000）混合均勻，滅菌接種環(huán)接菌在液體LB 中混勻，放在37℃恒溫振蕩器3 h 進(jìn)行搖菌。取樣到比色皿中，用自動(dòng)紫外分光光度計(jì)測(cè)OD 值，約為0.6時(shí)加終濃度1 mol/L IPTG 開始誘導(dǎo)。①28℃、120 r/min、37℃搖床6 h ②20℃ 200 r/min 37℃24 h。誘導(dǎo)后的樣品用750 mL 大離心管離心4℃、4 000 r/min、15 min。離心前取200 μL，離心后取5 μL 加20 μL 上樣緩沖液，剩下的分裝到50 mL 的離心管再次離心（4℃、4 000 r/min、 27 min），離心后棄上清，沉淀稱重后存于-80℃冰箱保存。蛋白自誘導(dǎo)表達(dá)按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.2 蛋白破碎

破碎所需的緩沖液與菌體充分混合均勻，放在冰盒上等待破碎。預(yù)冷高壓破碎儀，使其達(dá)到和樣品相當(dāng)?shù)臏囟龋扑榍案鶕?jù)菌液按1 ∶100 加入適量的PMSF。破碎壓力600 左右，破碎2 遍。破碎后取樣30 μL+30 μL 上樣緩沖液用來跑膠，獲取結(jié)果。破碎過的菌液用大型落地離心機(jī)離心（4℃、16 000 r/min 、20 min），取上清30 μL+30 μL 上樣緩沖液用來跑膠驗(yàn)證。離心過的上清液轉(zhuǎn)移至燒杯中，等待硫酸銨沉淀。

1.2.3 硫酸銨沉淀

每毫升分別依次加入0.18 g、0.25 g、0.35 g、0.45 g 硫酸銨，用磁力攪拌器攪拌30 min，4℃離心16 000 r/min30 min，分離上清和沉淀，上清繼續(xù)進(jìn)行硫酸銨沉淀。每次離心后都取上清20 μL加5 μL上樣緩沖液，取1 mg 沉淀加20 μL上樣緩沖液等待跑膠。

1.2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

將制膠板進(jìn)行漏檢、制備8%下層膠（如表1）混勻加至膠板三分之二處、制備5%上層膠（如表1）加滿膠板、插上梳子，等待30~50 min 后即可使用。進(jìn)行加樣、電泳、染色、脫色和觀測(cè)結(jié)果。

表1 垂直電泳膠的配制

1.2.5 純化前透析

將樣品放入8-1.4 k 透析袋中，將裝有蛋白的透析袋放入1.2 L 透析液的燒杯中過夜，次日取出樣品到50 mL 離心管中配平離心（30 min、16 000 r/min、4℃）等待純化。

1.2.6 蛋白純化

1 倍柱體積純水過柱清洗20 mL 磷酸纖維素柱料。分別用40 mL Elution buffer 和60 mL Binding buffer 過柱清洗。樣品過柱后收集溜穿液，并標(biāo)記流穿（FT）。接著依次使用40 mL Binding buffer、40 mL Washing buffer、40 mL Washing buffer、20 mL Elution buffer 和40 mL Elution buffer過柱，分別標(biāo)記為B、W1、W2、E1 和E2。然后使用60 mL Elution buffer、40 mL Binding buffer 和100 mL 過濾純水過柱清洗，最后用20%無水乙醇保存。將收集起來的所有樣品各取200 μL 做丙酮沉淀待跑膠驗(yàn)證，將剩余樣品置于冰上，保存于4℃冰箱[9]。

1.2.7 丙酮沉淀

200 μL樣品加入2 mL 離心管中，每管中加丙酮至2 mL 并混勻。將樣品放在-80℃冰箱冷凍10 min。取出樣品解凍，用快速離心機(jī)14 000 r/min、4℃離心20 min?；厥丈锨?，把離心管放在干燥箱中60℃干燥10 min，干燥后取出加入20 μL上樣緩沖液。

1.2.8 蛋白測(cè)濃度

用移液槍取2 μL樣品蛋白加入Nano-300 微量分光光度計(jì)，通過蛋白對(duì)280 nm 波長(zhǎng)的吸收值獲得蛋白濃度，并記錄。

1.2.9 蛋白濃縮

用濃縮管4 000 r/min、4℃ 濃縮至15 倍。

1.2.10 蛋白酶的活性檢驗(yàn)

PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證蛋白酶的活性，5 個(gè)50 μL測(cè)試體系如表2 所示，95℃持續(xù)30 s，56℃持續(xù)20 s，72℃持續(xù)30 s；循環(huán)30，72℃延伸2 min，最終PCR 機(jī)器中維持溫度在16℃。

表2 目標(biāo)DNA 聚合酶PCR 活性測(cè)試體系 μL

1.2.11 冷凍保存

每毫升加40%的甘油，混勻，液氮冷凍，-80℃冰箱保存得到的聚合酶。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 自動(dòng)誘導(dǎo)和IPTG 誘導(dǎo)重組表達(dá)的比較分析

用不同的溫度、時(shí)間和體積（5 mL 和10 mL）對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果如圖1 所示，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)可知，自動(dòng)誘導(dǎo)28℃ 表達(dá)效果最好。

圖1 誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE 分析

M-7 分別是蛋白質(zhì)Marker，1 和2 是誘導(dǎo)前樣品，3 和4 是IPTG 28℃ 誘導(dǎo)后細(xì)胞樣品，5 是IPTG 20℃ 誘導(dǎo)后細(xì)胞樣品，6 是自動(dòng)誘導(dǎo)25℃誘導(dǎo)后細(xì)胞樣品，7 是自動(dòng)誘導(dǎo)28℃ 誘導(dǎo)后細(xì)胞樣品。星號(hào)標(biāo)記處為目標(biāo)蛋白條帶。

2.2 硫酸銨分級(jí)沉淀蛋白

對(duì)表達(dá)的樣品進(jìn)行破碎后硫酸銨沉淀，硫酸銨沉淀的目的是為了達(dá)到初步純化。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)SDS-PAGE 分析可知，蛋白在0.25 g/mL和0.35 g/mL 硫酸銨沉淀時(shí)表達(dá)效果最好，因此將采用0.25 g/mL 和0.35 g/mL 沉淀進(jìn)行純化。

圖2 破碎和硫酸銨分級(jí)沉淀SDS-PAGE 膠結(jié)果

圖2 從左到右依次：M 是蛋白Marker，1 是對(duì)照，2 是破碎后蛋白，3 是破碎后蛋白上清，4是上樣緩沖液，5 和6 分別是0.18 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，7 和8 分別是0.25 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，9 是上樣緩沖液，10 和11 分別是0.35 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，12 是上樣緩沖液，13 和14 分別是0.45 g 硫酸銨沉淀后的上清和沉淀，星號(hào)標(biāo)記處為目標(biāo)蛋白條帶。

2.3 離子交換層析柱純化

對(duì)硫酸銨沉淀的樣品用DEAE 柱進(jìn)行第一步純化（圖3a），用磷酸纖維素柱進(jìn)行再次純化（圖3b）。根據(jù)純化后丙酮沉淀SDS-PAGE 分析結(jié)果可知，W2、E1 和E2 樣品含有目標(biāo)蛋白，且雜蛋白含量較少。下一步將有目標(biāo)蛋白的樣品透析，并測(cè)蛋白活性和濃度。

圖3 離子交換層析柱純化聚合酶SDS-PAGE 膠結(jié)果

圖3 （a）中M 為蛋白質(zhì)Marker，1-7 分別為離心后上清、離心后沉淀、FT 樣品1、FT 樣品2、E1 樣品、L1 樣品和E2 樣品；圖3（b）中M 為蛋白Marker，1-6 分別為FT 樣品、B1 樣品、W1樣品、W2 樣品、E 1 樣品和E2 樣品。

2.4 PCR 鑒定聚合酶活性

對(duì)小規(guī)模PCR 擴(kuò)增的樣品跑瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。如圖4 所示，本試驗(yàn)表達(dá)及純化的DNA 聚合酶比商用聚合酶的活性好，PCR 產(chǎn)物更多，表達(dá)更明顯。

圖4 PCR 測(cè)定酶的活性

M 為DNA Marker；1-4 為本試驗(yàn)所表達(dá)的聚合酶；5 為商用聚合酶。

3 討論

保真度在DNA 復(fù)制中非常重要的[10]。DNA堿基配對(duì)中的錯(cuò)配會(huì)產(chǎn)生不同類型的突變，有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能失調(diào)，并且有致癌的可能。許多DNA 聚合酶都包含1 個(gè)核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，其作用是檢測(cè)堿基對(duì)是否錯(cuò)配，并進(jìn)一步執(zhí)行移除不正確的核苷酸，然后由正確的核苷酸取代。盡管不同的錯(cuò)配導(dǎo)致不同的結(jié)構(gòu)特性，但DNA 聚合酶仍然能夠均勻地檢測(cè)和區(qū)分它們，并保持DNA復(fù)制的保真度。DNA 聚合酶還是許多誘變過程的關(guān)鍵，并被廣泛用于生物技術(shù)中。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的DNA 聚合酶進(jìn)行表達(dá)，有培養(yǎng)周期短、表達(dá)水平高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11]。有關(guān)DNA 聚合酶的制備技術(shù)一直在不斷的優(yōu)化，主要是提高酶的表達(dá)量、特異性、酶活力等[12-13]。將DNA 聚合酶從重組大腸桿菌中提取以及純化的方法主要有凍溶法和柱層析等方法。此外，有研究用Bio-rex70 離子交換法和聚乙二胺(PEI)沉淀對(duì)DNA 聚合酶進(jìn)行純化[14]。還有研究使用乳糖對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)過破胞和粗提取后，再依次過JK110 離子交換柱和SephadexG-75 凝膠柱獲得純化的聚合酶[15]。

本研究分別從菌體濃度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間3 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化得出最佳誘導(dǎo)條件，即 菌 液 的OD600為0.841 時(shí) 加 入1.5 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)時(shí)間為12 h。優(yōu)化條件可使該聚合酶的大量提取生產(chǎn)成本降低，為大批量生產(chǎn)嵌合DNA 聚合酶奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，通過SDS-PAGE 檢驗(yàn)可得在此誘導(dǎo)條件下獲取的酶純度較高，由此可知經(jīng)過本試驗(yàn)的純化步驟可除去大部分雜蛋白。最后，通過PCR 擴(kuò)增以及瓊脂糖凝膠電泳比較商品聚合酶和本試驗(yàn)提取純化的酶液的活性，結(jié)果顯示兩者活性相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)室提取純化的嵌合式DNA 聚合酶的作用效果優(yōu)于市售商品酶。

4 結(jié)論

（1）本研究測(cè)試了嵌合高保真DNA 聚合酶在不同溫度和時(shí)間下的表達(dá)情況，在28℃自動(dòng)誘導(dǎo)中蛋白表達(dá)量較高。用硫酸銨沉淀進(jìn)行提純，獲得初步純化的嵌合高保真DNA 聚合酶。

（2）采用陰離子和陽離子交換層析柱純化后，獲得較純的嵌合高保真DNA 聚合酶。通過PCR 反應(yīng)對(duì)獲得高保真聚合酶進(jìn)行活性分析，確認(rèn)了上述工藝獲得的高保真聚合酶具有聚合酶活性。