人參皂苷Rg3對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的影響及作用機(jī)制研究

褚文麗，亢澤峰，李書嬌，侯昕玥，陳水齡

脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是眼內(nèi)新生血管的一種常見表現(xiàn)形式，指來自脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的新生血管病理性增生并穿過Bruch 膜向內(nèi)發(fā)展，進(jìn)入視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）層，或視網(wǎng)膜感覺神經(jīng)層與RPE 層之間[1]。CNV 是濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）的主要病理改變，因其血管通透性高，易引起黃斑部反復(fù)出血、滲出、瘢痕形成，從而導(dǎo)致中心視力嚴(yán)重下降，甚至失明[2]。CNV 的發(fā)生發(fā)展是多細(xì)胞、多信號(hào)通路協(xié)同參與的復(fù)雜過程，其中低氧環(huán)境誘發(fā)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor，HIF-1α）相關(guān)信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是最終導(dǎo)致CNV 形成的核心通路之一[3]。中藥單體人參皂苷Rg3 具有抗新生血管的藥理作用，近年被應(yīng)用于眼部新生血管性疾病的研究[4]。本研究通過532 nm 激光誘導(dǎo)建立大鼠CNV 模型，予以人參皂苷Rg3 干預(yù)，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性CNV進(jìn)展的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～8 周齡雄性SPF 級(jí)BN 大鼠36 只（36 只眼），體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006]，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院動(dòng)物房，維持（25±2）℃恒溫，自由進(jìn)食飲水。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)所用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定。

1.2 藥品、試劑與儀器

參一膠囊（吉林亞泰制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20030044，110804-201504），康柏西普眼用注射液（成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，S20130012），兔抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）抗體、兔抗HIF-1α抗體（美國Abcam 公司，1316、2185），cDNA 第一鏈合成試劑盒（美國Thermo Scientific 公司，K1622）。532 nm 倍頻Nd YAG 激光治療機(jī)（德國LuMenis 公司，Novus Spectra），共聚焦激光眼底血管造影儀（德國Heidelberg公司，HRA2-TSP-00666），微量注射器（瑞士Hamilton 公司，1700），全自動(dòng)熒光定量PCR儀（美國ABI公司，7500）。

1.3 激光光凝建立大鼠CNV模型

大鼠均選右眼為實(shí)驗(yàn)眼，在裂隙燈下用532 nm倍頻Nd YAG激光治療機(jī)圍繞視盤并在距視盤1.5～2.0 視盤直徑（papillary diameter，PD）位置等距離光凝10個(gè)點(diǎn)，激光光凝參數(shù)：波長532 nm，功率300 mW，光斑直徑50 μm，爆破時(shí)間為0.05 s，當(dāng)看到有氣泡產(chǎn)生時(shí)，提示Bruch膜被擊穿，作為有效點(diǎn)。

1.4 分組與給藥

參一膠囊由人參皂苷Rg3 單一活性成分組成，故將參一膠囊內(nèi)容物粉末溶于蒸餾水中配置人參皂苷Rg3藥液。按照臨床等效劑量計(jì)算，配置3.65、7.20、14.40 mg/kg3 個(gè)劑量，灌胃前加熱至適溫，以4 ℃保存。

將造模成功的30 只大鼠隨機(jī)分為5 組，包括模型組（model group，MG）、人參皂苷Rg3低劑量組（LRg3）、人參皂苷Rg3 中劑量組（M-Rg3）、人參皂苷Rg3 高劑量組（H-Rg3）、陽性對(duì)照藥康柏西普組（conbercept group，CB），另將未做任何處理的大鼠設(shè)為對(duì)照組（control group，CG），每組6 只。L-Rg3、M-Rg3、H-Rg3 組分別予3.65、7.20、14.40 mg/kg 的低、中、高人參皂苷Rg3 藥液灌胃，每次灌胃量為2 mL，每日1 次；CB 組予玻璃體腔注射康柏西普注射液5 μL，共計(jì)1 次；CG、MG 組大鼠灌胃2 mL 蒸餾水，每日1 次。各組均干預(yù)7 d 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)眼的觀察。

CB組大鼠玻璃體腔注射方法：聚維酮碘液于大鼠結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)眼，0.9%氯化鈉注射液沖洗，使用胰島素針距角鞏膜緣后約2 mm 處垂直穿刺鞏膜進(jìn)入，隨后拔出換10 μL 微量進(jìn)樣器，與眼軸成45°方向朝視盤方向刺入玻璃體腔約2 mm，緩慢推注5 μL康柏西普注射液，留針片刻撥出，涂抹氧氟沙星眼膏預(yù)防感染。

1.5 FFA觀察眼底情況

大鼠麻醉后，實(shí)驗(yàn)眼使用復(fù)方托品酰胺滴眼液充分散瞳，進(jìn)行紅外眼底成像，將10%熒光素鈉注射液以120 mg/kg的劑量腹腔注射，觀察熒光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA）晚期（＞5 min）CNV 熒光素滲漏情況。取FFA 晚期像計(jì)算CNV 生成率（CNV 生成率=熒光滲漏激光斑數(shù)/激光斑總數(shù)×100%），用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計(jì)算滲漏激光斑的熒光素滲漏平均光密度（mean density，MD）值，評(píng)價(jià)CNV的發(fā)展和滲漏程度。

1.6 RT-qPCR 法檢測(cè)HIF-1α、VEGF mRNA 表達(dá)水平

麻醉處死大鼠后，分離獲取大鼠脈絡(luò)膜組織，裂解組織提取總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）。反應(yīng)體系：2×SYRB Green Mix 10 μL+上游引物1 μL+下游引物1 μL，cDNA 1 μL，超純水補(bǔ)齊至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 °C 延伸30 s，循環(huán)39 次。采用2-△△Ct的方法進(jìn)行計(jì)算各目的基因蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參蛋白進(jìn)行對(duì)照。引物設(shè)計(jì)與構(gòu)建由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成（表1）。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物信息

1.7 Western Blot法檢測(cè)HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)

處死大鼠后，分離獲取大鼠脈絡(luò)膜組織，提取總蛋白，按照蛋白定量試劑盒操作測(cè)定總蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量，依次經(jīng)凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別將兔抗HIF-1α抗體（稀釋比例1∶1,000）、兔抗VEGF抗體（稀釋比例1∶1,000）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（稀釋比例1∶1,000）在4 ℃搖床上孵育過夜。次日洗膜后，按照羊抗兔二抗（稀釋比例1∶4,000）室溫孵育1 h。顯影后使用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，測(cè)定條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)量/同一樣本內(nèi)參蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對(duì)CNV大鼠眼底情況的影響

CG組大鼠視網(wǎng)膜血管熒光素鈉充盈良好，視網(wǎng)膜血管以視盤為中心呈放射狀分布，脈絡(luò)膜血管呈網(wǎng)狀分布，未見熒光滲漏。其余各組光凝后早期可見光斑區(qū)呈網(wǎng)狀強(qiáng)熒光，晚期可見圓盤狀熒光輕度滲漏，邊界不清（圖1）。

MG 組大鼠CNV 生成率達(dá)66.70%，L-Rg3、MRg3、H-Rg3 組依次為63.30%、60.00%、56.70%，CB組為56.70%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。6 組間大鼠熒光素滲漏MD值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=83.940，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組MD 值升高（t=17.846，P=0.000）；與MG 組比較，MRg3、H-Rg3、CB 組MD 值降低（tM-Rg3=5.032，tH-Rg3=6.593，tCB=9.618，均P=0.000）；與H-Rg3 組比較，CB組MD 值升高（t=3.025，P=0.011），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.2 人參皂苷Rg3 對(duì)CNV 大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的影響

6 組大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α mRNA 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=80.480，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組HIF-1α mRNA 表達(dá)升高（t=16.280，P=0.000）；與MG組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB組HIF-1α mRNA 表達(dá)降低（tM-Rg3=8.692，tH-Rg3=12.070，tCB=14.510，均P=0.000）；與CB 組比較，HRg3 組HIF-1α mRNA 表達(dá)升高（t=2.431，P=0.031），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 各組大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)（±s，n=3）

表2 各組大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)（±s，n=3）

注：* 與CG 組比較，P＜0.05；# 與MG 組比較，P＜0.05；△ 與H-Rg3 組比較，P＜0.05；CG 對(duì)照組；MG 模型組；L-Rg3 人參皂苷Rg3 低劑量組；M-Rg3 人參皂苷Rg3 中劑量組；H-Rg3 人參皂苷Rg3 高劑量組；CB 康柏西普組；CNV 脈絡(luò)膜新生血管；HIF-1α 缺氧誘導(dǎo)因子-1α；VEGF血管內(nèi)皮生長因子

組別CG MG L-Rg3 M-Rg3 H-Rg3 CB F值P值mRNA 蛋白VEGF 0.12±0.03 0.92±0.03*0.94±0.04 0.68±0.06#0.52±0.03#0.36±0.10＃△104.220 0.000 HIF-1α 1.00±0.00 2.79±0.24*2.38±0.11 1.83±0.12#1.46±0.05#1.19±0.15#△80.480 0.000 VEGF 1.00±0.00 3.65±0.27*3.22±0.30 2.42±0.30#1.81±0.21#1.21±0.06#△69.000 0.000 HIF-1α 0.07±0.06 0.91±0.08*0.87±0.10 0.59±0.03#0.39±0.04#0.39±0.09?！?1.290 0.000

6組大鼠脈絡(luò)膜VEGF mRNA 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.000，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組VEGF mRNA 表達(dá)升高（t=14.500，P=0.000）；與MG 組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB 組VEGF mRNA 表達(dá)降低（tM-Rg3=6.730，tH-Rg3=10.068，tCB=13.351，均P=0.000）；與CB 組比較，H-Rg3 組HIF-1α mRNA 表達(dá)升高（t=3.283，P=0.007），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.3 人參皂苷Rg3 對(duì)CNV 大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的影響

6 組大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.486，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組HIF-1α 蛋白表達(dá)升高（t=14.406，P=0.000）；與MG 組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB 組HIF-1α 蛋白表達(dá)降低（tM-Rg3=5.488，tH-Rg3=8.918，tCB=8.918，均P=0.000）；與CB 組比較，H-Rg3 組HIF-1α蛋白表達(dá)比較（P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2、圖2）。

圖2 各組大鼠脈絡(luò)膜HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)

6組大鼠脈絡(luò)膜VEGF蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=104.220，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組VEGF 蛋白表達(dá)升高（t=17.938，P=0.000）；與MG 組比較，M-Rg3、H-Rg3、CB 組VEGF蛋白表達(dá)降低（tM-Rg3=5.382，tH-Rg3=8.969，tCB=12.557，均P=0.000）；與CB 組比較，H-Rg3 組VEGF 蛋白表達(dá)升高（t=3.588，P=0.004），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2、圖2）。

3 討論

AMD 是工業(yè)化國家65 歲以上人群視力喪失的主要原因之一，是一種涉及遺傳、環(huán)境、年齡等多種危險(xiǎn)因素相互作用的復(fù)雜慢性疾病[5]。臨床上AMD主要分為干性（或稱萎縮性、非新生血管性）和濕性（或稱滲出性、新生血管性）兩型，干性AMD 主要以視力緩慢下降、后極部出現(xiàn)玻璃膜疣、黃斑區(qū)色素上皮增生、甚至出現(xiàn)地圖樣萎縮為主要表現(xiàn)；濕性AMD 則以視力減退較為迅速、黃斑區(qū)CNV 生長、病灶區(qū)出血、后期機(jī)化形成灰白樣瘢痕病灶為典型表現(xiàn)，是造成90%以上AMD 患者視力喪失的原因[6]。亢澤峰[7-8]在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，將濕性AMD歸屬于“瞳神絡(luò)病”范疇，提出其基礎(chǔ)病因?yàn)椤澳拷j(luò)不通”，核心病機(jī)為“絡(luò)虛不榮”，以“調(diào)氣血、護(hù)氣陰、通目絡(luò)”治則指導(dǎo)臨床，研究[9]證實(shí)取得良好的效果。CNV 的病變?cè)诮j(luò)，與經(jīng)絡(luò)臟腑的虛衰密切相關(guān)[10]，腎精虧虛，氣血不足，本虛標(biāo)實(shí)，因氣累血，因虛致瘀，由虛致虛實(shí)夾雜。治療上“急則治其標(biāo)”以開滯導(dǎo)郁瀉余為主，“緩則治其本”則以益氣養(yǎng)血為要，絡(luò)虛通補(bǔ)，或加以活血理氣，或辛味通絡(luò)。總之，益氣扶正治法應(yīng)貫穿治療濕性AMD的全過程。

玻璃體腔反復(fù)注射VEGF 抑制劑是目前治療新生血管性AMD 的主要方法，其通過直接結(jié)合VEGF受體或游離的VEGF 分子發(fā)揮作用，從而降低血管通透性和新生血管增殖[11-12]。但注射頻率高、部分患者對(duì)藥物應(yīng)答較慢甚至不應(yīng)答、產(chǎn)生藥物耐受等問題，導(dǎo)致抗VEGF治療仍面臨多重挑戰(zhàn)[13-14]。中醫(yī)藥治療AMD 具有悠久的歷史，在改善患者視功能、降低患者復(fù)發(fā)率及改善患者的全身癥狀方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。人參屬五加科草本植物，藥性甘、微苦，歸肺、脾、心經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津、安神益智的功效[15]。人參含有皂苷、多糖、氨基酸、脂肪酸等多種化學(xué)成分，其中皂苷是人參各種藥理作用和生物活性的主要活性成分，目前已確定結(jié)構(gòu)的人參單體皂苷達(dá)50 余種[16]。人參皂苷Rg3 屬四環(huán)三萜皂苷，分子式為C42H72O13，是人參抗腫瘤的活性成分，以其為單一活性成分的參一膠囊是我國批準(zhǔn)上市的第一個(gè)抗腫瘤新生血管抑制劑。現(xiàn)代研究[17]證實(shí)，人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化與凋亡、抑制腫瘤血管生成以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，對(duì)肺癌、大腸癌、前列腺癌等均有一定抑制作用。近年來，還有研究[18-19]證實(shí)，人參皂苷Rg3 應(yīng)用于抗眼部新生血管方面能夠抑制CNV的生成。

目前在CNV 發(fā)病機(jī)制及其防治策略研究中，VEGF 是研究最多的促血管生成因子，而缺氧是誘導(dǎo)VEGF 過度表達(dá)的重要因素。低氧環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1α 等因子表達(dá)，過度表達(dá)的HIF-1α 進(jìn)入細(xì)胞核，HIF-1β與HIF-1α相結(jié)合形成HIF-1轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合VEGF 基因的3′端和5′端，誘導(dǎo)VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，從而促使新生血管形成。本研究鑒于缺氧等因素在CNV 形成過程中重要作用，初步探索人參皂苷Rg3 對(duì)激光誘導(dǎo)的大鼠CNV 進(jìn)展的干預(yù)作用，并探討其作用機(jī)制。通過532 nm激光誘導(dǎo)建立大鼠CNV模型，給予中藥單體人參皂苷Rg3不同劑量灌胃治療7 d，并設(shè)康柏西普玻璃體腔注藥組為陽性對(duì)照，觀察其對(duì)大鼠CNV模型的影響。通過FFA 結(jié)果顯示M-Rg3、H-Rg3 組光斑熒光滲漏強(qiáng)度均低于MG、L-Rg3 組，說明人參皂苷Rg3 具有抑制實(shí)驗(yàn)性CNV 形成的作用。通過檢測(cè)各組視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜復(fù)合組織中HIF-1α 和VEGF的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示L-Rg3組與MD 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，M-Rg3、H-Rg3 組較MG 組顯著減少，但高于CB 組，說明人參皂苷Rg3 抑制大鼠CNV的形成，需要達(dá)到一定的灌胃劑量，即7.20 mg/kg，且在短期內(nèi)CB 組優(yōu)于人參皂苷Rg3 組。臨床上玻璃體腔注射康柏西普具有作用時(shí)間短、需要反復(fù)給藥、價(jià)格昂貴等局限性，因此積極探索人參皂苷Rg3有可能作為有效抑制CNV 的潛在藥物，與抗VEGF治療聯(lián)合應(yīng)用，或者單獨(dú)用藥，對(duì)CNV 的治療具有重要的意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在CNV 生成早期，人參皂苷Rg3 能夠抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性CNV 熒光素滲漏，從而延緩CNV 的發(fā)生發(fā)展，其作用機(jī)制可能與下調(diào)HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)，抑制HIF-1α 信號(hào)通路的激活有關(guān)，但其臨床有效性和安全性有待進(jìn)一步研究。