蒸汽爆破預(yù)處理聯(lián)合殼聚糖酶制備殼三糖

郭超然，趙紅軍，蘇海鵬，黃海燕，孫建安，毛相朝

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

在自然資源和環(huán)境方面，世界正面臨前所未有的挑戰(zhàn)[1]。近年來(lái)，綠色高效的生產(chǎn)方式取得了很大的進(jìn)展，特別是在可持續(xù)利用生物質(zhì)生產(chǎn)有價(jià)值產(chǎn)品的領(lǐng)域[2]，而其中的生物技術(shù)具有環(huán)境友好性、高催化效率、底物專一性好和催化條件溫和等優(yōu)勢(shì)，是一種非常有前景的方法[3]。

殼寡糖已廣泛應(yīng)用于制藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品等領(lǐng)域[4-5]，如在人體健康領(lǐng)域，其具有抗腫瘤、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力等功能，而在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，可用作生物農(nóng)藥發(fā)揮抗蟲(chóng)害作用[6]。研究表明，殼寡糖的生物功能與聚合度（degree of polymerization，DP）密切相關(guān)[7]。例如，殼三糖能明顯改善HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗作用，而殼二糖和殼四糖無(wú)明顯改善效果[8]。但是目前缺乏特定的單一聚合度殼寡糖的制備方法，殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）可以酶解殼聚糖生成殼寡糖，大多數(shù)殼聚糖酶已被證明是通過(guò)內(nèi)切方式產(chǎn)生不同聚合度的殼寡糖混合物[9]。因此，利用殼聚糖酶從殼聚糖特異性制備特定聚合度的殼寡糖引起了研究人員的關(guān)注。

殼聚糖具有廣泛且高度有序的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，使其在水中的溶解度較差，酶解效率較低[10]。因此，通常需要預(yù)處理手段降低殼聚糖結(jié)晶度以提高殼聚糖酶對(duì)殼聚糖的可及性，從而促進(jìn)殼聚糖的酶解[11]。目前廣泛使用的是利用稀酸溶液溶解殼聚糖的方法，但這造成了環(huán)境的污染、產(chǎn)物生物活性降低、純化難度大、成本高等問(wèn)題，在應(yīng)用上存在一定的局限性。因此，需要探索綠色的粉狀殼聚糖預(yù)處理手段，以減輕環(huán)境壓力和提高生產(chǎn)有效性。在預(yù)處理手段中，蒸汽爆破因其環(huán)境友好性以及其快速破壞結(jié)晶生物質(zhì)的潛力引起了人們的關(guān)注[12]。在這一物理化學(xué)過(guò)程中，生物質(zhì)暴露于高壓（0.5～2.5 MPa）飽和蒸汽中，隨后瞬間釋放壓力和降低溫度，破壞材料結(jié)晶結(jié)構(gòu)，克服生物質(zhì)降解的關(guān)鍵障礙，從而促進(jìn)進(jìn)一步水解，成為更高價(jià)值的產(chǎn)物[13]。蒸汽爆破已成為一種有創(chuàng)新性、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)和高效的生物質(zhì)處理技術(shù)，如采用蒸汽爆破技術(shù)可提高木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶消化率、促進(jìn)木聚糖提取和木質(zhì)素釋放等[14-16]，但未見(jiàn)有蒸汽爆破應(yīng)用于殼聚糖上的報(bào)道。

此外，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）因其生物安全性（generally recognized as safe，GRAS）以及良好的生化和生理特性而被認(rèn)為是理想異源蛋白表達(dá)宿主菌株[17]。由于相對(duì)較高的生長(zhǎng)速度、清晰的遺傳背景以及在工業(yè)發(fā)酵中的穩(wěn)定性，枯草芽孢桿菌成為適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的首選菌株。因此，在枯草芽孢桿菌中高效表達(dá)殼聚糖酶對(duì)其工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。已有研究在大腸桿菌中成功表達(dá)了來(lái)自Butyrivibrio sp.MC2013 的殼聚糖酶Csn-But[18]。為了實(shí)現(xiàn)殼三糖的高效制備，本研究在枯草芽孢桿菌中對(duì)殼聚糖酶Csn-But 進(jìn)行高效異源表達(dá)，采用蒸汽爆破預(yù)處理聯(lián)合酶催化提高酶解效率，并通過(guò)控制底物濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物聚合度的調(diào)控。以期為難以降解的不溶性生物材料的環(huán)境友好型生物催化轉(zhuǎn)化開(kāi)辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

KOD 高保真酶（5 U/μL）：日本TOYOBO 公司；DNA 無(wú)縫連接試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：美國(guó)QIAGEN 公司；不同分子量（Mw）殼聚糖：上海麥克林生化有限公司；不同聚合度（DP2～DP6）殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品：青島博智匯力生物科技有限公司；薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）板：德國(guó)Merck 公司。

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞：北京擎科生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌WB800 感受態(tài)細(xì)胞為中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自制，分別用于載體的構(gòu)建和殼聚糖酶的異源表達(dá)。

殼聚糖酶Csn-But（GenBank：MK482734）的DNA序列由北京華大基因科技有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋（JI80TW）：致微（廈門）儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（BCM-1000）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；便攜式均質(zhì)機(jī)（HB-958b）：中山市上品電器有限公司；蒸汽爆破裝置（QB-200B ICSE）：河南溫柔新材料科技有限公司；恒溫?fù)u床（QYC2112）：上海福馬設(shè)備有限公司；電泳儀（DYY-6C）：北京六一儀器公司；冷凍離心機(jī)（5804R）：德國(guó)艾本德股份公司；高效液相色譜儀（LC-20AT）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（1290 Infinity II UHPLC/6460 QqQ MS）：美國(guó)安捷倫公司；酶標(biāo)儀（MULTISKANF FC）、傅里葉變換衰減全反射紅外光譜儀（Nicolet iS10）：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；掃描電鏡（TESCAN VEGA3）：日本日立公司。

1.3 殼聚糖酶Csn-But 的異源表達(dá)

以密碼子優(yōu)化的殼聚糖酶DNA 序列作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，設(shè)計(jì)上游引物（5'-GTAACACATGCCTCAGCTGCAATGCGTAAAGAAAAAAACAAA-3'）和下游引物（5'-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTAGCGATAGCTTTCA-3'）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：25 μL 2×Buffer，10 μL H2O，10 μL 脫氧核糖核酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，DNTP），上下游引物各1.5 μL，1 μL KOD 高保真酶，1 μL 目的片段（1 ng/μL）。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性（94 ℃10 min）、40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（98 ℃10 s，58 ℃30 s，68 ℃80 s）、最終延伸（68 ℃10 min）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后對(duì)目的片段進(jìn)行回收，目的片段與載體pP43NMK（+）通過(guò)DNA 無(wú)縫連接酶連接后，通過(guò)42 ℃熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)瓊脂糖凝膠核酸電泳和DNA 測(cè)序進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證。選擇測(cè)序正確的重組質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB800 感受態(tài)細(xì)胞，在LB 培養(yǎng)基（卡那霉素抗性）中于220 r/min，30 ℃發(fā)酵30 h。在8 500×g 轉(zhuǎn)速條件下，4 ℃離心20 min 后，保留上清液，即為粗酶液。

1.4 殼聚糖酶活性測(cè)定

通過(guò)3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法檢測(cè)還原糖的含量來(lái)測(cè)定殼聚糖酶活性[19]。200 μL 反應(yīng)體系包含pH5 的2%膠體殼聚糖和20 μL粗酶液，在55 ℃孵育15 min 后，加入300 μL DNS 試劑，沸水浴10 min 顯色。12 000×g 離心2 min 后，在540 nm處測(cè)定上清液吸光值，利用D-氨基葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算還原糖含量。1 單位（U）的殼聚糖酶活性定義為在上述標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol 還原糖所需的酶量。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次。

1.5 蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖

試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[20]的方法，取等量（100 g）的粉狀殼聚糖樣品在QB-200B ICSE 蒸汽爆破裝置中用不同蒸汽壓力（0、1.6、1.8、2.0、2.2 MPa 和2.4 MPa）進(jìn)行蒸汽爆破處理4 min，然后迅速減壓。蒸汽爆破處理后的樣品60 ℃干燥至恒重。

1.6 表征蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖

掃描電鏡：樣品噴金后，在掃描電子顯微鏡下觀察。在20.0 kV 電壓下，分別在500×和5 000×兩個(gè)放大倍率下進(jìn)行捕獲。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（attenuated total reflection Flouriert ransformed infrared spectroscopy，ATR-FTIR）：模式范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描100 次。

1.7 酶解蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖

采用便攜式均質(zhì)機(jī)在pH5 檸檬酸緩沖液中對(duì)不同蒸汽壓力預(yù)處理的樣品進(jìn)行均質(zhì)，以保持均勻性。水解反應(yīng)體系包含6.66 U/mL Csn-But、2%殼聚糖、20 mmol/L pH5 檸檬酸緩沖液，在55 ℃下分別水浴24 h 和48 h（反應(yīng)過(guò)程中持續(xù)攪拌）后，沸水浴10 min終止反應(yīng)，DNS 法測(cè)定還原糖含量，并根據(jù)還原糖含量評(píng)估最佳蒸汽壓力條件。Csn-But 水解最佳處理效果的殼聚糖，并在不同時(shí)間點(diǎn)（0、30 min 和1、2、4、8、12、18、24、48、72 h）取樣檢測(cè)還原糖含量，得到最佳預(yù)處理?xiàng)l件下的水解曲線。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次。

1.8 特定聚合度殼寡糖的可控制備

1.8.1 殼聚糖酶Csn-But 水解殼寡糖產(chǎn)物分析

殼聚糖酶Csn-But 以殼寡糖[（GlcN）2～（GlcN）6]為底物在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)不同時(shí)間（0.5、1.0、2.0、4.0 h）后，立即沸水浴10 min 終止反應(yīng)。在異丙醇∶氨水=2∶1（體積比）作為展開(kāi)劑的薄層色譜板上分離。用0.1%茚三酮溶液溶解在乙醇中噴涂，然后在110 ℃下加熱5 min 顯色。

1.8.2 底物濃度對(duì)產(chǎn)物聚合度的影響

將Csn-But（6.66 U/mL）在55 ℃下水解不同濃度（2%、4%和6%）的經(jīng)過(guò)2.4 MPa 壓力蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖48 h，過(guò)程中持續(xù)攪拌。反應(yīng)經(jīng)沸水浴10 min 后終止，12 000×g 離心2 min 后，通過(guò)0.22 μm聚醚砜濾膜過(guò)濾得到殼寡糖樣品，在以下條件下采用高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜進(jìn)行分析：正離子模式，流動(dòng)相為乙腈∶水=2∶1（體積比），掃描速度為5 200 u/s。在全掃描質(zhì)譜分析中，記錄m/z 5～1 000 范圍內(nèi)數(shù)據(jù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖酶Csn-But 在枯草芽孢桿菌中的高效異源表達(dá)

目的基因Csn-But 通過(guò)同源無(wú)縫連接載體pP43NMK 后，成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 中并進(jìn)行擴(kuò)增，將提取的質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化法成功轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌WB800 中進(jìn)行表達(dá)。為了評(píng)價(jià)Csn-But 的表達(dá)水平，測(cè)定了重組枯草芽孢桿菌胞外和胞內(nèi)殼聚糖酶活性。胞內(nèi)殼聚糖酶活性和胞外相比，可忽略不計(jì)。在胞外酶活測(cè)定中，枯草芽孢桿菌表達(dá)的Csn-But 活性為89.78 U/mL，高于大腸桿菌中表達(dá)Csn-But 的活性（19.08 U/mL），表明枯草芽孢桿菌是合適的殼聚糖酶Csn-But 高效表達(dá)工程菌株[21]。

2.2 殼聚糖經(jīng)過(guò)蒸汽爆破處理后的結(jié)構(gòu)變化分析

利用掃描電鏡觀察蒸汽爆破預(yù)處理后粉狀殼聚糖的形態(tài)變化，殼聚糖掃描電鏡圖像見(jiàn)圖1。

圖1 殼聚糖掃描電鏡圖像Fig.1 SEM images of powdery chitosan

由圖1 可知，蒸汽爆破處理引起了明顯的形態(tài)學(xué)變化。如圖1a1和圖1a2所示，未處理的粉狀殼聚糖表面致密有序，結(jié)構(gòu)相對(duì)光滑和平整，這限制了殼聚糖酶的可及性[22]，使酶無(wú)法直接高效酶解粉狀殼聚糖。樣品在經(jīng)過(guò)蒸汽爆破處理后呈現(xiàn)出粗糙和無(wú)序的形態(tài)，并且蒸汽爆破后樣品的粗糙度隨著蒸汽爆破壓力的增加而增強(qiáng)。由圖1b1和圖1b2可知，經(jīng)1.6 MPa 處理的樣品表面出現(xiàn)輕微卷曲裂紋和纖維網(wǎng)絡(luò)松動(dòng)的特征。如圖1d1和圖1d2所示，當(dāng)壓力增加到2.0 MPa 時(shí)，處理后的樣品出現(xiàn)纖維組織的緊密裂紋。由圖1f2可知，經(jīng)2.4 MPa 蒸汽爆破處理后，殼聚糖表面顯示多刺的纖維狀細(xì)枝排列且表面明顯被撕裂。綜上所述，蒸汽爆破預(yù)處理對(duì)殼聚糖的結(jié)構(gòu)帶來(lái)脈沖沖擊，導(dǎo)致分離和暴露的纖維含有多個(gè)空腔和撕裂，這與纖維素經(jīng)蒸汽爆破處理后變化相似[23]。

ATR-FTIR 對(duì)不同壓力蒸汽爆破處理后樣品的表征，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 未處理和蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖的傅里葉變換衰減全反射紅外光譜Fig.2 ATR-FTIR spectra of powdery chitosan untreated and treated with steam explosion

由圖2 可知，殼聚糖的所有特征峰（O—H、C—H和C—O 拉伸振動(dòng)）均被觀察到，其中3 277 cm-1處的吸收峰為氫鍵OH 拉伸或NH 振動(dòng)[24-25]，說(shuō)明蒸汽爆破預(yù)處理后殼聚糖的化學(xué)鍵未被破壞。其中殼聚糖的光譜在2 871 cm-1處出現(xiàn)C—H 拉伸振動(dòng)，在1 651cm-1處出現(xiàn)的波段對(duì)應(yīng)于酰胺I 的C O。在1 599 cm-1和1 378 cm-1附近觀測(cè)到的特征振動(dòng)帶一般屬于酰胺II的N—H 彎曲振動(dòng)和酰胺III 的C—N 拉伸振動(dòng)[26]。不同壓力下蒸汽爆破處理的樣品在3 400～3 200 cm-1范圍內(nèi)，由于氫鍵O—H 拉伸和N—H 振動(dòng)導(dǎo)致條帶強(qiáng)度減弱，酰胺II 的特征峰強(qiáng)度降低，說(shuō)明氨基間氫鍵斷裂。隨著處理強(qiáng)度從0 增加到2.4 MPa，處理后的粉狀殼聚糖樣品中對(duì)稱NH3+彎曲區(qū)域1 418 cm-1附近的帶強(qiáng)度減小，這可能是NH3+分子間氫鍵的損失。這些結(jié)果表明，蒸汽爆破處理后殼聚糖的化學(xué)鍵沒(méi)有被破壞，但有效地破壞了氫鍵網(wǎng)絡(luò)。

2.3 Csn-But 對(duì)蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖酶解

為了進(jìn)一步評(píng)估蒸汽爆破預(yù)處理的效果，用殼聚糖酶Csn-But 對(duì)預(yù)處理樣品進(jìn)行酶解，其結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同蒸汽爆破壓力條件下粉狀殼聚糖的酶解Fig.3 Enzymatic hydrolysis of powdery chitosan under different steam explosion pressures

由圖3 可知，蒸汽爆破預(yù)處理可促進(jìn)粉狀殼聚糖的轉(zhuǎn)化，當(dāng)壓力從1.6 MPa 提高到2.4 MPa 時(shí)，殼聚糖酶Csn-But 的酶解性能顯著提高。相比于對(duì)照組（0 MPa），2.4 MPa 壓力蒸汽爆破處理組的粉狀殼聚糖酶解48 h的還原糖含量提高了5.4 倍，證明蒸汽爆破預(yù)處理粉狀殼聚糖有助于粉狀殼聚糖的直接轉(zhuǎn)化，從而實(shí)現(xiàn)了殼寡糖綠色環(huán)保生產(chǎn)，突破傳統(tǒng)酸處理法造成的水資源消耗和產(chǎn)物酸味嚴(yán)重的瓶頸。

殼聚糖酶Csn-But 水解蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖的進(jìn)程曲線見(jiàn)圖4。

圖4 殼聚糖酶Csn-But 水解蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖的進(jìn)程曲線Fig.4 Time course profile of chitosanase Csn-But hydrolyzing powdery chitosan treated with steam explosion

由圖4 可知，在初始階段（0～12 h），還原糖含量迅速增加，48 h 后達(dá)到相對(duì)平衡，最高含量為2.0 mg/mL。

2.4 殼三糖的可控制備

2.4.1 殼聚糖酶Csn-But 水解模式分析

通過(guò)TLC 分析Csn-But 以各種聚合度寡糖為底物的水解產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 Csn-But 與聚合度2～6 殼寡糖反應(yīng)Fig.5 Csn-But reacting with（GlcN）2-6

由圖5 可知，分別以殼二糖[（GlcN）2]、殼三糖[（GlcN）3]和殼四糖[（GlcN）4]為底物與殼聚糖酶反應(yīng)2 h，沒(méi)有其他產(chǎn)物生成，說(shuō)明該酶不能水解殼二糖、殼三糖和殼四糖。而殼五糖[（GlcN）5]被水解生成殼二糖和殼三糖，殼六糖[（GlcN）6]被有效水解為DP2～DP4 的殼寡糖，水解試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Csn-But 為內(nèi)切型切割模式的殼聚糖酶。隨機(jī)內(nèi)切的切割模式有助于獲得高聚合度殼寡糖，可因底物濃度等反應(yīng)因素所抑制或調(diào)節(jié)而發(fā)生改變[27]。

2.4.2 產(chǎn)物聚合度的調(diào)控

底物濃度是影響產(chǎn)物組成的重要因素。通過(guò)殼聚糖酶Csn-But 水解不同濃度（2%、4%、6%）蒸汽爆破預(yù)處理的粉狀殼聚糖可控生產(chǎn)特定聚合度殼寡糖。水解產(chǎn)物的組成見(jiàn)圖6。

圖6 不同殼聚糖濃度2%、4%、6%的水解產(chǎn)物Fig.6 Hydrolysates obtained from different chitosan contents of 2%，4% and 6%

由圖6a 可知，Csn-But 水解低濃度（2%）蒸汽爆破預(yù)處理的粉狀殼聚糖產(chǎn)生殼二糖（m/z 363.1）、殼三糖（m/z 524.2），殼四糖（m/z 685.1）和四聚體（m/z 727.1）與來(lái)自2%底物的水解產(chǎn)物相比，水解高濃度底物形成的產(chǎn)物組成有明顯變化。由圖6 可知，隨著底物濃度的增加，雖然產(chǎn)物混合物的聚合度沒(méi)有變化，但殼二糖和殼四糖的比例逐漸降低，殼三糖逐漸成為主要的產(chǎn)物。由圖6c 可知，在6%底物濃度下，殼三糖成為產(chǎn)物的主要成分。單一聚合度殼三糖的生產(chǎn)也將大大降低殼寡糖精制后期產(chǎn)品分離純化的時(shí)間和操作成本。以往的研究也表明，通過(guò)調(diào)控酶解過(guò)程，可控制生產(chǎn)特定聚合度的殼寡糖，如在不同底物濃度下，當(dāng)酶添加量較低時(shí)，可以得到殼二糖作為優(yōu)勢(shì)產(chǎn)物[27]。

3 討論與結(jié)論

殼聚糖酶Csn-But 在生物安全性（GRAS）菌株枯草芽孢桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。此外，Csn-But 酶解2.4 MPa 蒸汽爆破預(yù)處理粉狀殼聚糖殼寡糖含量提高了5.4 倍。酶切模式分析表明殼聚糖酶Csn-But 為內(nèi)切型殼聚糖酶，并且有望通過(guò)控制蒸汽爆預(yù)處理底物的濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)單一聚合度殼三糖的生產(chǎn)。與傳統(tǒng)方法相比，這種綠色預(yù)處理技術(shù)可以減少原本酸處理導(dǎo)致的環(huán)境污染和產(chǎn)品分離難題。蒸汽爆破預(yù)處理粉狀殼聚糖的轉(zhuǎn)化率較低，需要進(jìn)一步優(yōu)化和控制蒸汽爆破過(guò)程，提高酶的轉(zhuǎn)化率。