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    乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖加工特性及其耐缺氧和抗疲勞作用影響

    2023-08-08 01:05:32姜敬維李玟君李建湘宋青云李玉蝶汪海燕李瑋
    食品研究與開發(fā) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:鼠李糖抗疲勞葡聚糖

    姜敬維,李玟君,李建湘,宋青云,李玉蝶,汪海燕,李瑋*

    (1.陸軍勤務(wù)學(xué)院,重慶 401331;2.湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430068)

    我國高原地區(qū)面積遼闊,約占土地面積1/6[1]。高原低氧環(huán)境會(huì)造成人體頭痛、胸悶,甚至產(chǎn)生高原肺水腫等缺氧應(yīng)激及疲勞應(yīng)激反應(yīng)[2]。相關(guān)研究表明,在高原缺氧環(huán)境下,官兵的運(yùn)動(dòng)能力和軍事作業(yè)效能比平原地區(qū)下降20%~40%,顯著影響高原部隊(duì)的戰(zhàn)斗力[3]。開發(fā)高原功能食品、預(yù)防或減輕高原反應(yīng)、增強(qiáng)高原適應(yīng)力并提高高原地區(qū)部隊(duì)作戰(zhàn)能力,對(duì)有效維護(hù)高原地區(qū)軍民身體健康,提升我國高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力具有積極的影響。

    β-葡聚糖廣泛存在于大麥和青稞等麥科作物中,在青稞胚芽中的含量尤其豐富[4-5]。目前針對(duì)青稞β-葡聚糖的研究主要集中在降血糖[6]、降血脂[7]、膽固醇調(diào)節(jié)機(jī)制[8-9]及應(yīng)用等方面,青稞β-葡聚糖干預(yù)缺氧應(yīng)激及疲勞應(yīng)激的相關(guān)研究較少。本文以產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌—植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,LP)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus,LB)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus,LR)分別對(duì)青稞進(jìn)行發(fā)酵,研究乳酸菌對(duì)青稞中提取出的β-葡聚糖的加工特性的影響,通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立抗氧化抗疲勞復(fù)合應(yīng)激模型,研究不同乳酸菌發(fā)酵制備的青稞β-葡聚糖對(duì)小鼠抗缺氧疲勞功效的影響,為開發(fā)高原功能食品、服務(wù)高原地區(qū)軍民提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與設(shè)備

    青稞粉(昆侖17 號(hào)):產(chǎn)自西藏自治區(qū)昌都市;昆明小鼠(雄性,SPF 級(jí)):華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,SCXK(鄂)2016-0009,體質(zhì)量(20.4±2.2)g。植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌:湖北工業(yè)大學(xué)保藏;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒(BC0175)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測(cè)試劑盒(BC0025)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測(cè)試劑盒(BC1535)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒(BC0685)、乳酸(lactic acid,LA)檢測(cè)試劑盒(BC2235):南京建成生物工程研究所;鈉石灰:武漢鴻睿康試劑有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、耐高溫α-淀粉酶(380 U/mg):阿拉丁試劑公司;其他試劑均為分析純。

    X3R 型高速冷凍離心機(jī):美國Thermo Fisher Scientific 公司;DHR-1 流變儀:美國TA 儀器公司;1260 Infinity II 高效液相色譜儀:美國Agilent 科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品制備

    參考陳瑜等[10]和譚翠[11]的方法,稱取一定量青稞粉于500 mL 燒杯中,加入體積比為1∶2 蒸餾水,并在室溫25 ℃下浸泡24 h。用紗布瀝干水分后,置于蒸鍋中常壓下蒸煮20 min,并分裝于250 mL 三角瓶中,冷卻后分別接入植物乳桿菌(LP)、保加利亞乳桿菌(LB)和鼠李糖乳桿菌(LR),選擇接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為單因素,以β-葡聚糖的提取率為試驗(yàn)指標(biāo),進(jìn)行L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn),具體因素與水平如表1 所示。以3 種乳酸菌最優(yōu)工藝得到的純化后青稞β-葡聚糖為樣品(以LPG、LBG、LRG 表示)進(jìn)行分析測(cè)試,以未發(fā)酵的青稞提取的β-葡聚糖做對(duì)照組(NFG)。

    表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

    1.2.2 青稞β-葡聚糖的提取

    參考謝昊宇等[12]和賈瑩[13]的方法,青稞全粉加稀堿提取2 次,收集上清液(4 000 r/min 離心15 min),耐高溫α-淀粉酶除淀粉,等電點(diǎn)法去除蛋白質(zhì)(調(diào)節(jié)pH值至4.5,95 ℃水浴靜置30 min,收集上清液,醇沉(真空減壓濃縮,緩慢加入乙醇溶液使最終濃度為60%,4 ℃下靜置20 h,離心收集沉淀,沉淀復(fù)溶,冷凍干燥得到青稞β-葡聚糖粗多糖。

    1.2.3 青稞β-葡聚糖的純化

    取10 mg/mL 粗多糖溶液50 mL,緩慢加入27 g 硫酸銨,邊加邊攪拌后置于4 ℃條件下,靜置10 h;4 000 r/min離心10 min,收集沉淀;將沉淀溶于20 mL 純水中,加熱溶解,冷卻后,緩慢加入60 mL 無水乙醇,邊加邊攪拌,使各溶液體系中乙醇最終濃度達(dá)到75%,置于4 ℃冰箱靜置10 h;重復(fù)離心3 次、收集沉淀、純水溶解,加熱溶解、冷卻后,將溶液采用截留分子量為3 500 Da的有機(jī)膜進(jìn)行處理,并按2 h/次的速率更換外層水溶液,直至樣品溶液與0.5 mol/L BaCl2溶液滴加混合時(shí),不產(chǎn)生任何沉淀;將樣液于12 000 r/min 下高速離心20 min,去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒,收集上清液,濃縮后進(jìn)行冷凍干燥得青稞β-葡聚糖純品。

    1.2.4 分子量測(cè)定

    配制濃度為1 mg/mL 的β-葡聚糖,過0.22 μm 水相膜待測(cè),采用高效液相凝膠色譜聯(lián)合折光示差和多角度光散射檢測(cè)器測(cè)定其重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)、分子量分布系數(shù)(Mw/Mn)。色譜柱:OHpak SB-806 M HQ 和SB-805 HQ,8 mm×30 cm;流動(dòng)相:0.1 mol/L NaCl 溶液,流速:0.5 mL/min,柱溫:25 ℃;溶液的示差折光指數(shù)增量為0.138 mL/g;進(jìn)樣量:20 μL。

    1.2.5 青稞β-葡聚糖的加工特性

    青稞β-葡聚糖的溶解性、起泡能力、起泡穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性和乳化性參考賈瑩[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。

    1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    將小鼠隨機(jī)分為5 組,每組18 只并編號(hào),供給實(shí)驗(yàn)食物及飲水。環(huán)境溫度(25±2)℃,相對(duì)濕度(70±2)%。其中4 組每天固定時(shí)間以300 mg/(kg·d)的劑量將NFG、LPG、LBG、LRG 水溶液連續(xù)給藥7 d,每天1 次,每次0.4 mL;另一組為對(duì)照組,給予等體積生理鹽水,記為空白組(CK),每組數(shù)據(jù)取6 次平行均值。

    1.2.6.1 耐缺氧實(shí)驗(yàn)

    末次給藥后1 h,每組取6 只小鼠進(jìn)行常壓密閉缺氧試驗(yàn)。常壓密閉缺氧試驗(yàn)容器為40cm×40 cm×40 cm玻璃真空干燥器,內(nèi)置豎隔板分成兩室,底部放置鈉石灰,每次放入2 只小鼠,分別進(jìn)入一室,加蓋密封。記錄兩只小鼠的放置時(shí)間,以及小鼠劇烈抽搐、呼吸停止時(shí)間。每次試驗(yàn)結(jié)束,更換鈉石灰,記錄小鼠的存活時(shí)間。

    1.2.6.2 耐疲勞實(shí)驗(yàn)

    末次給藥后1 h,每組取6 只小鼠進(jìn)行游泳(耐疲勞)試驗(yàn)。小鼠稱重,記錄體質(zhì)量,將小鼠尾部固定體質(zhì)量4%的鉛片,置入65 cm×50 cm×40 cm 池中進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn),水溫控制在(28±1)℃,水深30 cm,并記錄每只小鼠的游泳時(shí)間,以頭部沉沒水中6 s 為試驗(yàn)終點(diǎn),記錄小鼠的存活時(shí)間。

    1.2.6.3 指標(biāo)檢測(cè)

    末次給藥后1 h,將小鼠置入游泳箱內(nèi)進(jìn)行不負(fù)重游泳訓(xùn)練,時(shí)間為60 min,水溫控制在(28±1)℃;游泳后30 min 進(jìn)行眼球取血,按照試劑盒的使用說明測(cè)定小鼠體內(nèi)LDH 和SOD 的活性以及MDA、LA 和BUN的含量。

    將小鼠脫頸處死,取其肝臟,使用生理鹽水進(jìn)行清洗,并用濾紙除濕,按照試劑盒說明,測(cè)定肝臟內(nèi)肝糖原含量。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    對(duì)所測(cè)得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析,并采用Origin 2019 計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析,顯著性水平取0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖提取率的影響

    試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

    表2 LP、LB、LR 發(fā)酵提取β-葡聚糖正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of orthogonal extraction of β-glucan by LP,LB and LR fermentation

    由表2 可知,植物乳桿菌(LP)提取青稞β-葡聚糖的最佳組合為A2B1C3,即接種量為5%,發(fā)酵時(shí)間為12 h,發(fā)酵溫度為32 ℃,提取得到的β-葡聚糖含量為(5.07±0.19)%;保加利亞乳桿菌(LB)提取青稞β-葡聚糖的最佳工藝組合為A3B3C2,即接種量為7%,發(fā)酵時(shí)間為36 h,發(fā)酵溫度為30 ℃,提取得到的β-葡聚糖含量為(5.14±0.22)%;鼠李糖乳桿菌(LR)提取青稞β-葡聚糖的最佳工藝組合為A3B2C1,即接種量為7%,發(fā)酵時(shí)間為24 h,發(fā)酵溫度為28 ℃,提取得到的β-葡聚糖含量為(5.05±0.16)%。

    2.2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖分子量分布的影響

    采用高效液相凝膠色譜聯(lián)合折光示差和多角度光散射檢測(cè)器測(cè)定發(fā)酵前后β-葡聚糖粗提物的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和分子量分布系數(shù)(Mw/Mn),結(jié)果見表3。

    表3 不同乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖的分子量參數(shù)Table 3 Molecular parameters of β-glucan extracted by different lactic acid bacterias

    由表3 可知,LPG 和LBG 的Mw/Mn 均高于NFG,說明植物乳桿菌和保加利亞乳酸菌發(fā)酵能顯著改善青稞β-葡聚糖的分子量分布。LRG 的Mw/Mn 最小,為1.00,說明鼠李糖乳桿菌制得的青稞β-葡聚糖中多糖均一性較高。

    在發(fā)酵過程中,乳酸菌的酶解反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)天然青稞β-葡聚糖分子量的降解[9-10]。研究表明β-葡聚糖分子量的降低與微生物發(fā)酵關(guān)系密切。由于發(fā)酵過程中乳酸菌的酶解反應(yīng)促使β-葡聚糖聚合物分子鏈斷裂,從而導(dǎo)致樣品分子量的降低[11-12]。

    2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖加工特性的影響

    天然多糖的起泡性能和乳化性能與多糖自身攜帶的親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)有關(guān)[13-17],其中良好的起泡性能和乳化性能可豐富食品加工體系的多樣性[18]。β-葡聚糖的溶解性、起泡性和乳化性與其來源、分子量、結(jié)構(gòu)、濃度等因素有關(guān),是衡量其加工特性的重要指標(biāo)[19-20]。青稞β-葡聚糖的溶解度、起泡性和乳化性等理化性質(zhì)如圖1 所示。

    圖1 乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖的加工特性參數(shù)Fig.1 The parameters of β -glucan extracted by lactic acid bacteria

    如圖1 所示,LPG、LBG、LRG 與NFG 相比均具有良好的溶解性、乳化性和起泡穩(wěn)定性,LBG 的溶解性和起泡能力均高于LPG、LRG 和NFG,LRG 的起泡穩(wěn)定性高于LPG、LBG 和NFG,LPG、LBG 和LRG 的乳化性均顯著高于NFG,LPG、LBG 和LRG 的乳化穩(wěn)定性與NFG 相比無顯著差異。

    2.4 發(fā)酵工藝對(duì)青稞β-葡聚糖耐缺氧和抗疲勞功效的影響

    不同乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖對(duì)小鼠耐缺氧、抗疲勞功效的影響如圖2 所示。

    圖2 乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖對(duì)小鼠缺氧存活時(shí)間和游泳存活時(shí)間的影響Fig.2 Effects of lactic acid bacteria fermentation extraction of βglucan on mouse survival time

    由圖2 可知,喂食β-葡聚糖組與CK 組相比,明顯延長密閉缺氧小鼠的存活時(shí)間,證明β-葡聚糖具有耐缺氧的功效,其中LPG、LBG 和LRG 與NFG 相比,密閉缺氧存活時(shí)間延長了26.6%、42.3%和36.4%,延長效果均顯著,說明乳酸菌發(fā)酵能顯著提升β-葡聚糖小鼠耐缺氧的存活時(shí)間。喂食β-葡聚糖組與CK 組相比,明顯延長游泳小鼠的存活時(shí)間,證明β-葡聚糖具有抗疲勞的功效,其中LPG、LBG 和LRG 與NFG 相比缺氧存活時(shí)間延長了22.6%、40.3%和42.4%,證明乳酸菌能顯著提升β-葡聚糖的抗疲勞效果。

    2.5 青稞β-葡聚糖對(duì)小鼠缺氧、疲勞應(yīng)激生理指標(biāo)的影響

    小鼠抗疲勞能力與肝糖原含量直接相關(guān),乳酸脫氫酶(LDH)水平的高低直接反映體內(nèi)持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)的代謝能力,而SOD 有助于清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基;LA、BUN、MDA 與運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的代謝廢物有關(guān)[21-23]。不同乳酸菌發(fā)酵取得的β-葡聚糖對(duì)小鼠乳酸LDH、LA、肝糖原等指標(biāo)的影響如表4 所示。

    表4 乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖對(duì)小鼠生理指標(biāo)的影響Table 4 Effects of β-glucan extracted by lactic acid bacteria fermentation on physiological indexes of mice

    由表4 可知,LPG、LBG、LRG、NFG 與CK 相比,乳酸脫氫酶的含量明顯提升,證明β-葡聚糖能提升小鼠體內(nèi)LDH 的含量。其中LBG 組是CK、NFG 組的2.07 倍和1.38 倍,且高于LPG 和LRG 組16.74%和15.24%。LPG、LBG、LRG、NFG 與CK 相比,血尿素氮的含量明顯降低,證明β-葡聚糖能降低小鼠體內(nèi)BUN 的含量。LPG、LBG、LRG 和CK 相比,肝糖原的含量明顯升高,其中LRG 組是CK、NFG 組的1.54 和1.31 倍,LRG 組LA 含量比CK 組降低38.76%。LPG、LBG、LRG、NFG與CK 相比,SOD 的含量明顯提升,其中LBG 與CK、NFG 相比提高了124.93%和55.20%,LRG 與CK、NFG相比提高了77.54%和22.50%。LPG、LBG、LRG、NFG與CK 相比,MDA 的含量降低。證明β-葡聚糖能降低小鼠體內(nèi)MDA 的含量,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后得到的β-葡聚糖比未發(fā)酵得到的β-葡聚糖的MDA 含量要低。其中LBG 組最低。

    3 結(jié)論

    植物乳桿菌和保加利亞乳酸菌發(fā)酵能顯著改善青稞β-葡聚糖的分子量分布鼠李糖乳桿菌制得的青稞β-葡聚糖中多糖均一性較高,保加利亞乳桿菌發(fā)酵后得到的β-葡聚糖起泡能力和溶解性都顯著高于植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及未發(fā)酵組,而鼠李糖乳桿菌發(fā)酵得到的β-葡聚糖起泡穩(wěn)定性顯著高于植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和未發(fā)酵組。

    乳酸菌發(fā)酵能顯著提升β-葡聚糖小鼠耐缺氧的存活時(shí)間和游泳存活時(shí)間,添加LBG 的鼠糧組的小鼠乳酸脫氫酶(LDH)含量均高于LPG 和LRG 組,添加LRG 的鼠糧組血尿素氮的含量遠(yuǎn)低于普通鼠糧組和空白組,添加LPG 的鼠糧組肝糖原的含量遠(yuǎn)高于普通鼠糧組和空白組,添加LBG 的鼠糧組能顯著降低小鼠體內(nèi)MDA、提升SOD。LRG 對(duì)小鼠血乳酸含量的影響比其他組降低更顯著。

    綜上,3 種乳酸菌發(fā)酵后得到的青稞β-葡聚糖均能有效改善小鼠耐缺氧和抗疲勞的效果。這種改善效果可能與β-葡聚糖的分子量大小高度相關(guān),植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和鼠李糖乳桿菌提升β-葡聚糖抗疲勞效果無顯著性差異;植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌提升β-葡聚糖耐缺氧效果無顯著性差異。

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