多肉植物東云系2 個(gè)品種組培快繁技術(shù)初探

陸 琳 ，張?zhí)鞏| ，柯 燚 ，李 涵 ，苗 振 ，拔利超 ，楊 平 ，李仕柳 ，曹 樺

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650100；2.國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650100；3.玉溪澄花生物科技有限公司，云南 玉溪 652500；4.閔卉（福建）園藝有限公司，福建 寧德 352000；5.玉溪市江川區(qū)鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，云南 玉溪 652600）

近年來(lái)，多肉植物因種類繁多、體態(tài)清雅、形狀奇特、色彩豐富等特點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的喜愛[1]。景天科（Crassulaceae）是多肉植物中最重要的科之一，常見種屬有景天屬（Sedum）、擬石蓮屬（Echeveria）等[2]。景天科擬石蓮屬根據(jù)其葉片和株型的不同，可人為地分為月影系、姬蓮系和東云系等。擬石蓮屬東云系多肉（Echeveria agavoideslines）因其植株矮胖、葉片短肥、葉層緊湊、顏色多樣且較耐陰，成為了近年來(lái)非常流行的一類多肉植物，具有極高的觀賞價(jià)值和收藏價(jià)值[3]。東云Corderoyi 是景天科擬石蓮屬多肉植物，是通過(guò)東云系列的野生種雜交選育得到的優(yōu)良園藝品種[4]。相對(duì)于其他擬石蓮屬植物，東云系多肉特點(diǎn)一是分株較少，2～3 a 的小苗基本無(wú)法分苗，另一特點(diǎn)是葉插成活率很低。目前，市場(chǎng)上較為流行的東云系品種有烏木、天狼星、羅密歐、魅惑之宵等，其繁殖一般采用種子繁殖，但種子繁殖不易，繁殖速度較慢、成本較高[5]，花非常小，授粉困難，且雜交種子播種后性狀分化，獲得目標(biāo)性狀不穩(wěn)定，因此，低繁殖率和葉插率決定了東云系多肉的價(jià)格相對(duì)較高，很難滿足產(chǎn)業(yè)化需求。

組織培養(yǎng)技術(shù)是植物快速繁育和脫毒的常規(guī)手段，其應(yīng)用非常廣泛[6]。實(shí)生苗的子葉、真葉經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)都能產(chǎn)生愈傷組織，而子葉是最好的無(wú)性繁殖材料，愈傷組織分化早、生長(zhǎng)快，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%[7]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖多肉植物是解決多肉植物繁殖量和需求量矛盾的一種快速有效的方法，對(duì)于繁殖名貴珍稀品種、快速繁殖優(yōu)良品種有著特別重要的意義[8]。相較于其他植物，多肉植物組織培養(yǎng)方面的研究起步較晚，最早是對(duì)康平壽[9]、星球和鸞鳳玉[10]3 種多肉植物組培技術(shù)研究，之后有很多學(xué)者對(duì)不同多肉品種的組培快繁技術(shù)進(jìn)行了廣泛的研究，但多集中在東云[3]、紅寶石[11]、姬秋麗[12]等單一品種，多肉植物品種繁多，品系間差異較大，近幾年品種更新很快，已有的多肉組培擴(kuò)繁技術(shù)研究很難跟上其更新速度。

本研究以東云系多肉品種HBG 和阿姆斯特壯為試驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)其外植體選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和煉苗移栽等關(guān)鍵技術(shù)對(duì)比分析，以期總結(jié)出東云系多肉組織培養(yǎng)的快繁體系，為其種苗產(chǎn)業(yè)化、市場(chǎng)化提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為東云系多肉HBG 和阿姆斯特壯，于云南省昆明市呈貢區(qū)斗南盆花市場(chǎng)購(gòu)買（圖1）。

圖1 供試品種Fig.1 Test varieties

1.2 試驗(yàn)方法

田間試驗(yàn)在云南省昆明市云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所溫室（E102°46′、N25°07′）內(nèi)進(jìn)行，海拔1 953 m。組培試驗(yàn)在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所花卉培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組培室溫度（23±2）℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度3 000～5 000 lx。

1.2.1 外植體選擇和預(yù)處理 分別選取HBG 和阿姆斯特壯葉片、嫩芽以及幼嫩花芽作為外植體，用流動(dòng)自來(lái)水沖洗表面，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水清洗3～4 次，再用0.1%升汞（質(zhì)量比），滴入2 滴吐溫消毒5～8 min，期間不時(shí)振蕩，之后無(wú)菌水沖洗4～5 次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，切去切口消毒受傷的部分，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。每個(gè)試驗(yàn)組重復(fù)3 次，15 d 后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 選取3 個(gè)無(wú)菌外植體接種于不同配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0，在溫度（20±2）℃、光照強(qiáng)度3 000～5 000 lx、光照12 h/d、相對(duì)濕度50%～60%的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)20～30 d 葉片基部開始膨大形成愈傷組織，培養(yǎng)55 d后，愈傷組織長(zhǎng)出叢生芽，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將3 個(gè)無(wú)菌外植體通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的小芽切下，接種到不同配比的繼代培養(yǎng)基中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0，在溫度（20±2）℃、光照強(qiáng)度3 000～5 000 lx、光照12 h/d、相對(duì)濕度50%～60%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)4～6 周后，統(tǒng)計(jì)其增殖率和分化率。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將通過(guò)繼代培養(yǎng)得到的小芽接種到不同配比的生根培養(yǎng)基中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0，在溫度（20±2）℃、光照強(qiáng)度3 000～5 000 lx、光照12 h/d、相對(duì)濕度50%～60%的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 周開始生根，統(tǒng)計(jì)其生根率。

1.2.5 煉苗移栽 待生根培養(yǎng)得到的生根苗冠幅長(zhǎng)至1 cm 左右，將其組培瓶移到溫室馴化5～7 d，用鑷子輕輕取出組培瓶苗，取出后用清水洗凈附著的培養(yǎng)基和用消毒剪刀剪去根部的2 種移栽方法對(duì)比，處理后將取出的苗置于陰涼晾3～5 d，栽植于基質(zhì)（泥炭∶珍珠巖=1∶1）中，22 ℃遮光75%～85%，濕度60%～80%，培養(yǎng)10～14 d 后，逐漸增加光照，降低濕度，正常溫室培養(yǎng)。4 周后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Excel 2010 和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體選取部位對(duì)2 種東云系多肉污染率和成活率的影響

本試驗(yàn)分別選取2 種東云系多肉的葉片、嫩芽以及幼嫩花芽作為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)品種間不同部位的外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)的污染率、成活率表現(xiàn)一致，都表現(xiàn)為花芽污染率最低、成活率最高；嫩芽的污染率相對(duì)較高、成活率較低，但與花芽相差不大；葉片作為外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最差，污染率最高、成活率最低（表1）。綜合對(duì)比，外植體優(yōu)選部位為花芽，非花期可選擇嫩芽。

表1 2 種東云系多肉不同部位外植體的污染率和成活率Tab.1 The contamination rate and survival rate of the different explants of two Echeveria agavoides varieties %

2.2 不同激素配比對(duì)2 種東云系多肉誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

不同激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)2 種東云系多肉不同部位外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的效果不同（表2）。從不同部位外植體來(lái)分析，2 種東云系品種都表現(xiàn)為花芽的誘導(dǎo)率最高，嫩芽的誘導(dǎo)率相對(duì)較低，葉片的誘導(dǎo)效果最差，結(jié)合表1 不同部位外植體的污染率和成活率的結(jié)果，東云系多肉取外植體最優(yōu)部位是花芽，非花期可取其嫩芽。

表2 2 種東云系多肉不同部位外植體在不同激素配比中的誘導(dǎo)率Tab.2 Induction rate of differnet explants of two E.agavoides varieties in different hormone ratios

從培養(yǎng)基激素水平誘導(dǎo)效果來(lái)看，2 種東云系品種整體都表現(xiàn)為誘導(dǎo)率隨著6-BA 和NAA 質(zhì)量濃度升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，其中，HBG 花芽在Y-3 配比下誘導(dǎo)率最高，為94.12%，其嫩芽在Y-4 配比下誘導(dǎo)率最高，為76.19%；阿姆斯特壯花芽和嫩芽均在Y-4配比下的誘導(dǎo)率最高，分別為66.67%、56.25%；而后均隨著質(zhì)量濃度升高其誘導(dǎo)率下降，說(shuō)明過(guò)高質(zhì)量濃度的激素水平會(huì)抑制其愈傷組織的形成。加入KT 激素，其誘導(dǎo)效果反而下降，說(shuō)明KT 不適合作為東云系多肉的誘導(dǎo)激素，具體原因有待進(jìn)一步探索。2 種東云系品種間誘導(dǎo)率對(duì)比，HBG 比阿姆斯特壯相對(duì)容易形成愈傷組織，說(shuō)明不同東云系多肉品種其誘導(dǎo)效果有一定差異性。

2.3 不同激素配比對(duì)2 種東云系多肉增殖培養(yǎng)的影響

不同激素配比的增殖培養(yǎng)基對(duì)2 種東云系多肉增殖和分化影響不同（表3）。從培養(yǎng)基激素水平增殖和分化效果來(lái)看，2 種東云系品種整體都表現(xiàn)為增殖率隨著6-BA 和NAA 質(zhì)量濃度升高呈先升高后下降的趨勢(shì)，其中，HBG 在Z-3 配比中分化率最高，為88.00%，在Z-4 配比中增殖率最高，為383.80%；阿姆斯特壯分化率和增殖率均在Z-4 配比下最高，分別為66.00%、317.80%；而后均隨著質(zhì)量濃度升高其分化率和和增殖率下降，說(shuō)明過(guò)高質(zhì)量濃度的激素水平會(huì)抑制其增殖分化。2 種東云系品種間增殖率對(duì)比，HBG 比阿姆斯特壯相對(duì)容易增殖分化，說(shuō)明不同東云系多肉品種其增殖效果有一定的差異性。

表3 2 種東云系多肉在不同激素配比中的增殖率和分化率Tab.3 Proliferation rate and differentiation rate of two E.agavoides varieties in different hormone ratios

2.4 不同激素配比對(duì)2 種東云系多肉生根培養(yǎng)的影響

不同激素配比的生根培養(yǎng)基對(duì)2 種東云系多肉品種生根培養(yǎng)效果有所差異（表4）。從培養(yǎng)基激素水平生根效果來(lái)看，2 種東云系品種整體都表現(xiàn)為生根率隨著NAA 質(zhì)量濃度升高而升高的趨勢(shì)，2 種東云系多肉品種都在G-2 和G-4 配比的生根培養(yǎng)基中達(dá)到基本完全生根。在G-3 配比中加入6-BA 反而降低了其生根效果。

表4 2 種東云系多肉在不同激素配比中的生根率Tab.4 Rooting rates of two E.agavoides varieties in different hormone ratios

2.5 煉苗移栽方式對(duì)2 種東云系多肉組培苗成活率的影響

隨著景天科多肉植物的廣泛應(yīng)用，黑腐病的發(fā)生也越來(lái)越重，嚴(yán)重影響了景天科多肉的產(chǎn)量和品質(zhì)[13]。通過(guò)對(duì)2 種東云系多肉組培生根苗洗凈保留根系和用消毒剪刀剪去根部的2 種移栽方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，保留根系雖然能使組培苗快速恢復(fù)，但因清洗過(guò)程中會(huì)傷到根系，且會(huì)保留少量培養(yǎng)基，移栽的組培苗很容易感染腐爛，成活率較低，HBG 成活率為76.00%，阿姆斯特壯成活率為43.00%；而采用去根處理后，HBG 成活率提高到93.00%，阿姆斯特壯成活率提高到74.00%，大大提高了移栽成活率和效率。

3 結(jié)論與討論

多肉植物的生長(zhǎng)設(shè)施設(shè)備簡(jiǎn)陋、繁殖方法傳統(tǒng)、繁殖數(shù)量有限，管理不精細(xì)、品種參差不齊，造成了與市場(chǎng)日益增長(zhǎng)需求相矛盾的特點(diǎn)[14]。科學(xué)有效地控制溫度、濕度和光照等條件對(duì)多肉植物的影響，不斷完善生產(chǎn)栽培的技術(shù)配套，才能為多肉植物的生長(zhǎng)發(fā)育創(chuàng)造更加適宜的環(huán)境條件[15]。東云系多肉因其品系特性，使用常規(guī)繁殖手段較難擴(kuò)繁，而利用組培快繁技術(shù)能夠快速獲得大量組培苗。外植體的選取部位是組培成功的先決條件，不同部位的外植體其消毒、誘導(dǎo)難易差別很大。陳偉等[11]和王德信等[12]分別對(duì)紅寶石和姬秋麗外植體滅菌方式進(jìn)行了探索，選擇的外植體為葉片或莖尖；郜李彬等[3]選取東云的葉片和幼嫩花芽為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，幼嫩花芽采用流水沖洗結(jié)合酒精、升汞消毒的滅菌方法，取得了較為理想的滅菌效果，污染率僅為7.50%，基本控制了污染現(xiàn)象；但葉片的污染率高達(dá)60%，因此，不宜采用葉片作外植體進(jìn)行誘導(dǎo)。本試驗(yàn)中，采用葉片進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，也出現(xiàn)了污染率達(dá)到70%的結(jié)果，原因是多肉種植時(shí)采用了紅土、腐葉土、珍珠巖等混合基質(zhì)，葉片部位較靠近栽培基質(zhì)，不容易清洗干凈；另外，葉片在長(zhǎng)時(shí)間清洗后，含水量較高，放入培養(yǎng)基后，外植體很難膨大，慢慢出現(xiàn)玻璃化[3]。本研究表明，東云系多肉選取外植體最優(yōu)部位是幼嫩花芽，在非花期時(shí)可選嫩芽。

在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是植株生長(zhǎng)分化所必需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]。不同外植體和不同生長(zhǎng)發(fā)育階段所需的培養(yǎng)基成分也不相同，如在誘導(dǎo)分化愈傷組織及不定芽、繼代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)等階段，對(duì)培養(yǎng)基的要求不盡相同[17]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響組織培養(yǎng)器官分化的關(guān)鍵因素[18]，后繼的誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、芽和根的分化等必須配合使用相應(yīng)的激素進(jìn)行調(diào)節(jié)，是培養(yǎng)基的重要組成成分，更是植物外源激素的來(lái)源[19]。本研究通過(guò)對(duì)2 種東云系多肉品種各階段培養(yǎng)基配方進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，確定東云系多肉愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、生根階段最佳的培養(yǎng)基配方。試驗(yàn)結(jié)果表明，2 種東云系多肉誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最適配方為MS+0.6～0.8 mg/L 6-BA+0.3～0.4 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)，HBG 花芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)94.12%，阿姆斯特壯花芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)66.67%；增殖培養(yǎng)基的最適配方為MS+0.4～0.6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0，在此增殖培養(yǎng)下，HBG 的增殖率和分化率分別為383.80%和88.00%，阿姆斯特壯的增殖率和分化率分別為317.80%和66.67%；生根培養(yǎng)基的最適配方為MS+0.2～0.3 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂，pH 值5.8～6.0，HBG 和阿姆斯特壯生根率都達(dá)到了100%。本研究對(duì)組培生根苗移栽方式結(jié)合多肉品種特性進(jìn)行了優(yōu)化，采用直接剪去生根苗根部后再進(jìn)行扦插，能大大提高其成活率。新上盆或長(zhǎng)勢(shì)較弱的植株不用施肥，待植株長(zhǎng)勢(shì)比較旺盛后每月可施一次液肥或緩釋肥，以確保植株健康生長(zhǎng)[20]。

本研究以東云系多肉品種HBG 和阿姆斯特壯為供試材料，篩選獲得了東云系多肉植物外植體的最佳選取部位、組織培養(yǎng)各階段的最佳培養(yǎng)基配方以及組培苗移栽方式，初步建立了東云系多肉植物組培快繁技術(shù)體系，研究結(jié)果為東云系多肉植物的工廠化育苗提供了參考依據(jù)。