復(fù)合益生菌抗斑馬魚感染及對(duì)炎癥的抑制作用

◎ 郭亞娟，喻 勤，嚴(yán)建剛，高業(yè)成，李曉敏，毛新亮

（1.完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528400；2.廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山 528400）

益生菌對(duì)人體有多種健康作用，其作用機(jī)制有干擾潛在病原體、改善屏障功能、免疫調(diào)節(jié)等[1]。研究表明，大腸桿菌、陰道加德納氏菌和白色假絲酵母是導(dǎo)致陰道炎的主要病原菌[2-3]，而益生菌在改善女性常見陰道感染方面具有顯著效果，口服益生菌具有降低陰道炎復(fù)發(fā)率的作用[4]，但這些實(shí)驗(yàn)多在小鼠、人體上實(shí)施，試驗(yàn)周期長、成本昂貴。而斑馬魚具有繁殖快、周期短等特點(diǎn)，且其胚胎和幼魚透明，轉(zhuǎn)基因魚的使用更有助于熒光顯微鏡對(duì)特定免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)可視化觀察[5]，已廣泛用于病原微生物感染模型的研究[6-7]。本文利用斑馬魚模型，研究嗜酸乳桿菌La-14和鼠李糖乳酪桿菌HN001復(fù)合益生菌對(duì)常見陰道炎致病菌及炎癥的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型AB品系斑馬魚，自然交配繁殖。年齡為受精后4～5 d，用于腸腔分布試驗(yàn)、對(duì)斑馬魚無可見有害作用水平的測定以及抗感染試驗(yàn)；轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光MPX品系斑馬魚，自然交配繁殖，年齡為受精后4 d，用于改善炎癥功效試驗(yàn)。用28 ℃養(yǎng)魚用水（每200 mg速溶海鹽用1 L反滲透水溶解，pH值為6.5～8.5，硬度為50～100 mg·L-1CaCO3，電導(dǎo)率為450～550 μS·cm-1）飼養(yǎng)斑馬魚，杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認(rèn)證（認(rèn)證編號(hào)：001458）的要求。

1.2 材料與試劑

萃妍益生菌固體飲料（主要成分為赤蘚糖醇、低聚果糖、嗜酸乳桿菌La-14、蔓越莓粉、透明質(zhì)酸鈉、鼠李糖乳酪桿菌HN001）由完美（廣東）日用品有限公司提供，乳酸菌總數(shù)不低于1.0×1010CFU·g-1，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制濃度為200 mg·mL-1的母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

大腸桿菌（Escherichia coli）凍干菌種，編號(hào)為GDMCC 1.708=ATCC 35401，來源于廣東省微生物菌種保藏中心；白色假絲酵母（Candida albicans）凍干菌種，編號(hào)為GDMCC 2.194=ATCC 10231，來源于廣東省微生物菌種保藏中心；陰道加德納氏菌（Gardnerella vaginalis）凍干菌種，編號(hào)為GDMCC 1.1347=ATCC 14018，來源于廣東省微生物中心。

CM-DiI（紅色熒光）：批號(hào)2277732，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CM-DiI（綠色熒光）：批號(hào)2174897，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）：批號(hào)70115000，中國Biosharp公司；二甲基亞砜（DMSO）：批號(hào)BCCD8942，瑞士Sigma公司；甲基纖維素：批號(hào)B2006074，中國上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SZX7顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Vert.A1 CCD相機(jī)，上海土森視覺科技有限公司；AZ100電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡，日本Nikon公司；IM-300顯微注射儀，日本Narishige公司；PC-10拉針儀，日本Narishige公司；CP214精密電子天平，美國OHAUS公司；TD5A臺(tái)式大容量低速離心機(jī)，長沙英泰儀器有限公司；DensiCHEK Plus電子比濁儀，美國生物梅里埃公司；6孔板，無錫耐思生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 復(fù)合益生菌在斑馬魚腸腔分布實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取100尾受精后5 d的野生型AB品系斑馬魚置于培養(yǎng)皿中。用紅色熒光CM-DiI標(biāo)記復(fù)合益生菌，并溶于養(yǎng)魚用水中，濃度為2 000 μg·mL-1，培養(yǎng)皿容量為30 mL，并于2 h、4 h、24 h分別隨機(jī)選取3尾斑馬魚，用熒光顯微鏡拍照。根據(jù)斑馬魚腸腔熒光情況，判斷復(fù)合益生菌是否活著到達(dá)其腸腔內(nèi)。

1.4.2 復(fù)合益生菌抗斑馬魚感染實(shí)驗(yàn)

參考付式杰等[8]方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，具體操作方法如下。根據(jù)前期濃度摸索結(jié)果，復(fù)合益生菌對(duì)正常斑馬魚的無可見有害作用水平（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）為1 000 μg·mL-1，以NOAEL劑量的1/4、1/2和1設(shè)定低、中、高劑量組，即復(fù)合益生菌質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1、500 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1。

（1）抗大腸桿菌感染實(shí)驗(yàn)。將受精后4 d的野生型AB品系斑馬魚置于6孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）隨機(jī)放置30尾。將復(fù)合益生菌按照預(yù)設(shè)濃度溶解在養(yǎng)魚水中，模型對(duì)照組斑馬魚僅用養(yǎng)魚用水處理，每個(gè)孔體積為3 mL。28 ℃連續(xù)處理18 h后，各實(shí)驗(yàn)組均注射用紅色熒光CM-Dil標(biāo)記的大腸桿菌到斑馬魚腸腔內(nèi)，換液繼續(xù)28 ℃處理3 h，建立斑馬魚大腸桿菌感染模型，根據(jù)斑馬魚腸腔是否有紅色熒光判斷造模是否成功。

（2）抗白色假絲酵母聯(lián)合陰道加德納氏菌感染實(shí)驗(yàn)。將受精后4 d的野生型AB品系斑馬魚置于6孔板中，每孔（實(shí)驗(yàn)組）隨機(jī)放置30尾。將復(fù)合益生菌按照預(yù)設(shè)濃度溶解在養(yǎng)魚水中，模型對(duì)照組斑馬魚僅用養(yǎng)魚用水處理，每個(gè)孔體積為3 mL。28 ℃連續(xù)處理18 h后，各實(shí)驗(yàn)組均注射用紅色熒光CM-DiI標(biāo)記的白色假絲酵母和綠色熒光CM-DiI標(biāo)記的陰道加德納氏菌到斑馬魚腸腔內(nèi)，并換液繼續(xù)28 ℃處理3 h，建立斑馬魚白色假絲酵母聯(lián)合陰道加德納氏菌感染模型，根據(jù)腸腔內(nèi)是否有紅色熒光和綠色熒光判斷造模是否成功。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)挑選10尾斑馬魚用熒光顯微鏡拍照，用NIS-Elements D 3.20高級(jí)圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚腸腔內(nèi)致病菌的熒光強(qiáng)度F以及抑菌率，用于評(píng)價(jià)復(fù)合益生菌抗感染功效。抑菌率計(jì)算公式為

1.4.3 復(fù)合益生菌改善斑馬魚炎癥實(shí)驗(yàn)

參考付式杰等[8]方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，具體操作方法如下。將受精后4 d的轉(zhuǎn)基因中性粒細(xì)胞綠色熒光MPX品系斑馬魚置于6孔板中，每組（正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和低、中、高劑量組）隨機(jī)放置30尾，共150尾。將復(fù)合益生菌溶解在養(yǎng)魚水中，濃度與1.4.2復(fù)合益生菌抗斑馬魚感染實(shí)驗(yàn)相同，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組斑馬魚僅用養(yǎng)魚用水處理，每個(gè)孔體積為3 mL。28 ℃連續(xù)處理18 h后，除正常對(duì)照組外，其余各實(shí)驗(yàn)組均注射大腸桿菌到斑馬魚腸腔內(nèi)，建立斑馬魚炎癥感染模型，并換液繼續(xù)28 ℃處理3 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)挑選10尾斑馬魚用熒光顯微鏡拍照，用NIS-Elements D 3.20高級(jí)圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚腸腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量（N）和炎癥抑制率，用于評(píng)價(jià)復(fù)合益生菌炎癥抑制率。炎癥抑制率計(jì)算公式為

1.4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示結(jié)果，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析，各用Dunnett’s-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合益生菌在斑馬魚腸腔分布實(shí)驗(yàn)

復(fù)合益生菌是一種活菌制劑[9]，所以評(píng)價(jià)其是否可活著到達(dá)腸腔就非常有必要。如圖1所示，斑馬魚經(jīng)水溶給予CM-Dil紅色熒光標(biāo)記的復(fù)合益生菌2 h、4 h和24 h后，其腸腔的熒光逐漸增強(qiáng)，說明2 h時(shí)，復(fù)合益生菌已經(jīng)進(jìn)入斑馬魚腸腔，4 h時(shí)腸腔已布滿益生菌，24 h時(shí)復(fù)合益生菌含量較4 h更明顯。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，復(fù)合益生菌可活著到達(dá)斑馬魚腸腔，并在腸腔穩(wěn)定存活。CHEN等[10]研究水溶給予斑馬魚乳雙歧桿菌實(shí)驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)在水溶喂食2 h后，益生菌可進(jìn)入腸腔，6 h、24 h可充滿整個(gè)腸腔，且可存活24 h以上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。

圖1 斑馬魚腸腔內(nèi)復(fù)合益生菌熒光示意圖

2.2 復(fù)合益生菌抗斑馬魚感染作用

斑馬魚腸腔內(nèi)大腸桿菌、白色假絲酵母、陰道加德納氏菌熒光情況見圖2，圖中實(shí)線輪廓是主要分析區(qū)域。用NIS-Elements D 3.20高級(jí)圖像處理軟件分析圖2并采集數(shù)據(jù)，分析復(fù)合益生菌對(duì)致病菌的抑菌率，具體結(jié)果見表1。由表1可知，與模型對(duì)照組相比，斑馬魚經(jīng)水溶給予復(fù)合益生菌24 h后，致病菌的熒光強(qiáng)度均有所降低。復(fù)合益生菌對(duì)大腸桿菌、白色假絲酵母和陰道加德納氏菌均具有抑菌能力，其中對(duì)大腸桿菌的抑菌效果較好，250 μg·mL-1低濃度組已顯示抑菌作用，抑菌率為31.39%（P＜0.05），隨著濃度升高，抑菌率有升高趨勢，最高為35.56%（P＜0.01），但組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，在白色假絲酵母聯(lián)合陰道加德納氏菌感染實(shí)驗(yàn)中，只有高劑量組1 000 μg·mL-1具有抑菌作用，對(duì)白色假絲酵母菌、陰道加德納氏菌的抑菌率分別為33.34%（P＜0.05）、37.20%（P＜0.05），但總體抑菌率與對(duì)大腸桿菌的抑菌率接近。

表1 斑馬魚腸腔內(nèi)致病菌熒光強(qiáng)度以及復(fù)合益生菌對(duì)致病菌的抑菌率結(jié)果表

圖2 斑馬魚腸腔內(nèi)致病菌熒光強(qiáng)度典型圖

BERTUCCINI等[11]研究嗜酸乳桿菌La-14和鼠李糖乳酪桿菌HN001在體外對(duì)陰道加德納氏菌、大腸桿菌的抑菌效果，結(jié)果顯示其有較強(qiáng)的抑菌作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，但體外研究結(jié)果顯示其對(duì)大腸桿菌的抑菌能力隨著濃度升高而增強(qiáng)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，可能是由于斑馬魚腸腔面積限制了復(fù)合益生菌的定植，待達(dá)到一定效果時(shí)，即使增加濃度也無法提高抑菌率。

2.3 復(fù)合益生菌改善斑馬魚炎癥作用

斑馬魚腸腔內(nèi)中性粒細(xì)胞分布情況見圖3，圖中實(shí)線輪廓是主要分析區(qū)域。用NIS-Elements D 3.20高級(jí)圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚腸腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量，具體結(jié)果見表2。

表2 斑馬魚腸腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量以及復(fù)合益生菌對(duì)斑馬魚腸腔炎癥抑制率結(jié)果表

圖3 斑馬魚腸腔內(nèi)中性粒細(xì)胞熒光強(qiáng)度典型圖

中性粒細(xì)胞是一種多核白細(xì)胞，可通過多種機(jī)制消除病原體，在炎癥過程中將遷移并聚集在炎癥部位，是首先到達(dá)炎癥部位的白細(xì)胞，其數(shù)量變化可用來評(píng)估炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱[12]。由表2可知，正常對(duì)照組腸腔內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)量極顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.001），說明建模成功，250 μg·mL-1、500 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1組的炎癥抑制率分別為53.00%（P＜0.01）、81.00%（P＜0.001）、84.00%（P＜0.001），隨著濃度升高，炎癥抑制率有上升趨勢，但實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著。這與復(fù)合益生菌抗大腸桿菌感染效果一致，推測其有可能是通過抗大腸桿菌感染達(dá)到抗炎功效。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌La-14和鼠李糖乳酪桿菌HN001復(fù)合益生菌具有較高的安全性，且可以活著到達(dá)斑馬魚腸腔，并發(fā)揮抗大腸桿菌感染、白色假絲酵母聯(lián)合陰道加德納氏菌感染作用以及改善大腸桿菌引起的炎癥，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。