環(huán)狀RNA MYO9A_043通過下調(diào)CPEB4表達發(fā)揮抑制小鼠心臟成纖維細胞纖維化表型的作用*

陳澤潤， 李藝， 梁俁， 蘇金鳳， 高原， 歐濤， 李暉，徐金東， 方咸宏， 單志新，△

環(huán)狀RNA MYO9A_043通過下調(diào)表達發(fā)揮抑制小鼠心臟成纖維細胞纖維化表型的作用*

陳澤潤1， 李藝1， 梁俁2， 蘇金鳳3， 高原1， 歐濤3， 李暉4，徐金東4， 方咸宏2， 單志新1，4△

［1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510280；2南方醫(yī)科大學附屬廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）心內(nèi)科，廣東 廣州 510080；3華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006；4南方醫(yī)科大學附屬廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）醫(yī)學研究部，廣東 廣州 510080］

研究環(huán)狀RNA MYO9A_043（circular RNA MY09A_043， circMY09A_043）對小鼠心肌纖維化的調(diào)控作用和機制。利用重組腺病毒circMYO9A_043介導其在C57BL/6乳小鼠心臟成纖維細胞（mouse cardiac fibroblasts， mCFs）中過表達，通過RT-qPCR和Western blot實驗檢測纖維化相關基因I型膠原α1鏈（collagen type I alpha 1 chain，）、III型膠原α1鏈（collagen type III alpha 1 chain，）和平滑肌肌動蛋白α2（smooth muscle actin alpha 2，）的表達。利用劃痕實驗檢測mCFs的遷移能力。利用RNA測序分析和RT-qPCR驗證circMYO9A_043對mCFs中胞質(zhì)多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，）等基因的下調(diào)作用。利用腺病毒介導mCFs過表達，檢測對纖維化相關基因表達的影響。通過RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation， RIP）實驗檢測與纖維化相關基因的結(jié)合作用。進一步通過放線菌素D處理實驗，檢測mCFs中對、和mRNA的穩(wěn)定作用。利用腺病毒可以有效介導circMYO9A_043在mCFs中過表達。circMYO9A_043可顯著下調(diào)、和表達，抑制mCFs的遷移能力（<0.05）。circMYO9A_043可顯著降低mCFs中的表達（<0.01），過表達可逆轉(zhuǎn)circMYO9A_043對纖維化相關基因表達的抑制作用。RIP實驗顯示與mCFs中纖維化相關基因的mRNA有顯著結(jié)合作用（<0.01），而放線菌素D處理實驗結(jié)果顯示可顯著增強上述基因mRNA的穩(wěn)定性（<0.05）。circMYO9A_043通過下調(diào)的表達而抑制mCFs纖維化表型。

心肌纖維化；心臟成纖維細胞；環(huán)狀RNA MYO9A_043；胞質(zhì)多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4

心肌纖維化是以細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）的過度積累為主要特征的病理過程，其可導致心功能障礙并引起心力衰竭［1］。心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts）又稱作心肌間充質(zhì)細胞，是心肌細胞中最常見的細胞類型［2-3］。在生理狀態(tài)下，成纖維細胞可以通過分泌膠原等物質(zhì)，調(diào)節(jié)細胞和非細胞成分之間的機械、化學和電信號，而疾病狀態(tài)下，成纖維細胞中平滑肌肌動蛋白α2（smooth muscle actin alpha 2，）等收縮基因表達增加，并通過增加膠原等物質(zhì)的分泌從而促進心肌纖維化［4-5］。盡管這些變化最初是一種重要的損傷修復，但從長期來看，成纖維細胞的過度活化，膠原的過度積累，最后將導致心功能障礙。

環(huán)狀RNA（circular RNA， circRNA）最開始是在20世紀70年代在植物類病毒發(fā)現(xiàn)的，而circRNA一詞是由桑格在1976年在描述類病毒的結(jié)構(gòu)時提出的，隨后幾年人們利用電子顯微鏡證實了環(huán)狀RNA的存在［6］。最初人們認為這種環(huán)狀RNA是異常的剪接產(chǎn)物［7］，然而隨著科學的進步及測序技術的發(fā)展，circRNA逐漸受到人們的關注［8］。circRNA是由前體mRNA反向剪接而成，是閉合環(huán)狀的單鏈RNA［9］。circRNA的生成受到多種因素的影響，如套索驅(qū)動環(huán)化、內(nèi)含子配對和RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動環(huán)化等［10-13］。circRNA有多種生物學功能，常見的生物學功能有參與親本基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、吸附miRNA、與蛋白質(zhì)相互作用、翻譯多肽或者蛋白等［13-16］。

越來越多的研究顯示，circRNA在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用［17-20］。我們檢測到來自宿主基因的circRNA MYO9A_043 （circMYO9A_043； hsa_circ_0036167）在心衰病人心肌中表達增加，但其對心肌纖維化的作用尚不清楚。本研究中，我們利用原代分離乳小鼠心臟成纖維細胞（mouse cardial fibroblasts，mCFs），通過體外實驗探討circMYO9A_043對心臟成纖維細胞纖維化表型的調(diào)節(jié)作用及可能機制。

材料和方法

1　實驗動物

乳小鼠購自廣州中醫(yī)藥大學，動物許可證號為SCXK（粵）2013-0034。

2　主要試劑

血清和細胞培養(yǎng)液（Bio Ind）；胰酶（Gibco）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；2× SYBR Green Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；Trizol（Invitrogen）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白緩沖液（Thermo）；化學發(fā)光液（Millipore）；PVDF膜（Whatman）；RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation， RIP）試劑盒（廣州伯信生物科技有限公司）；抗胞質(zhì)多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4， CPEB4）、GAPDH和III型膠原α1鏈（collagen type III alpha 1 chain， COL3A1）抗體（Proteintech）；抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA；由基因編碼）和I型膠原α1鏈（collagen type I alpha 1 chain， COL1A1）抗體（Abcam）；RT-qPCR引物由廣州睿博公司合成。

3　主要方法

3.1mCFs的原代分離、傳代培養(yǎng)和處理將乳小鼠置于75%的乙醇中浸泡消毒，沿著乳鼠腋下輕輕剪開其皮膚暴露胸腔，用鑷子取出其完整的心臟，接著對取出的心臟進行修剪，修剪結(jié)束后轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中。然后用胰酶對組織塊進行消化，經(jīng)過數(shù)次消化后離心棄上清，重懸細胞沉淀后轉(zhuǎn)移到T75細胞培養(yǎng)瓶穩(wěn)定培養(yǎng)。分離得到的mCFs置于細胞培養(yǎng)箱，傳代培養(yǎng)到第2代，隨后進行鋪板和實驗處理。

3.2重組腺病毒的制備人circMYO9A_043由1 147個核苷酸組成，包含了來自宿主基因的第7～15外顯子序列。按我們報道的方法［20］，構(gòu)建circMYO9A_043重組腺病毒載體，并在HEK293細胞中進行重組腺病毒包裝。

3.3mRNA表達譜芯片分析在mCFs進行腺病毒介導circMYO9A_043的過表達，利用Trizol法提取RNA后進行mRNA表達譜分析，芯片的雜交和結(jié)果分析由上?？党晒緟f(xié)助完成。

3.4RT-qPCR檢測用PBS清洗mCFs細胞板，Trizol法提取RNA，取1 000 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。取1 μL cDNA，加入SYBR Grenn Mix及對應引物，于定量PCR儀上進行circMYO9A_043和相關基因的mRNA表達水平檢測（以GAPDH為內(nèi)參照），用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達水平。所用引物序列見表1。

表1　RT-qPCR引物序列

Col1a1： collagen type I alpha 1 chain； Col3a1： collagen type III alpha 1 chain； Acta2： smooth muscle actin alpha 2/α-smooth muscle actin； CPEB4： cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4.

3.5Western blot檢測用PBS清洗培養(yǎng)mCFs的孔板，棄PBS后加入蛋白裂解液。裂解結(jié)束后將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管，置于離心機于13 000×的轉(zhuǎn)速下離心15 min，測各蛋白樣品的濃度并分裝。蛋白定量后變性，上樣，SDS-PAGE，脫脂牛奶封閉，相應的蛋白條帶分別用相應的Ⅰ抗（COL1A1抗體，1∶1 000；COL3A1抗體，1∶1 000；CPEB4抗體，1∶1 000；α-SMA抗體，1∶2 500；GAPDH抗體，1∶5 000）置于4 ℃冰箱孵育過夜。14～16 h后用對應種屬的Ⅱ抗（1∶2 500）室溫條件孵育55 min，最后進行曝光。

3.6細胞劃痕實驗將mCFs接種于細胞板，培養(yǎng)24 h后，取出細胞板并進行劃痕，劃痕時應盡量垂直。劃痕結(jié)束后，棄掉原培養(yǎng)液，PBS清洗后加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，分別于0 h和24 h進行拍照，用ImageJ軟件分析并計算細胞遷移率。

3.7RIP實驗用PBS清洗細胞，加入裂解液約30 min后收集細胞。利用RIP試劑盒去除DNA后將細胞裂解樣品分為CPEB4組、IgG組和Input組，分別加入5 μg的Flag抗體（CPEB4與Flag標簽融合表達）和IgG抗體，垂直混勻器4 ℃孵育16 h，隨后加入磁珠進行免疫沉淀（約3 h結(jié)束）。所得的洗脫液用苯酚-氯仿-異戊醇提取RNA，最后進行RT-qPCR檢測。

3.8放線菌素D處理mCFs實驗用2.5 mg/L放線菌素D處理mCFs不同時間（0、4、8、12和24 h）。處理結(jié)束后用PBS清洗細胞，提取其中的總RNA，用RT-qPCR檢測mCFs中和基因的mRNA水平。

4　統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析在GraphPad軟件上進行。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間的數(shù)據(jù)比較用檢驗；多組間的數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni校正的檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　circMYO9A_043具有抑制mCF纖維化表型的作用

人circMYO9A_043由1 147個核苷酸組成，包含了來自宿主基因的第7～15外顯子序列（圖1A）。RT-qPCR結(jié)果顯示，利用腺病毒可有效介導circMYO9A_043在mCFs中表達，同時能夠顯著下調(diào)纖維化相關基因和的mRNA表達（<0.05或<0.01），見圖1B。Western blot結(jié)果顯示，在過表達circMYO9A_043的成纖維細胞中，纖維化相關蛋白COL1A1、COL3A1和α-SMA的水平也一致下調(diào)（<0.01），見圖1C。細胞劃痕實驗顯示，在mCFs中過表達circMYO9A_043可顯著抑制細胞的遷移能力（<0.05），見圖1D。

Figure 1.　Overexpression of circMYO9A_043 （OE-circMYO9A-043） inhibited the fibrotic phenotype of mouse cardial fibroblasts （mCFs）. A： circMYO9A_043 sequence is derived from exon 7 to exon 15 of MYO9A gene； B： OE-circMYO9A_043 inhibited the mRNA expression of Col1a1， Col3a1 and Acta2 in mCFs； C： OE-circMYO9A_043 inhibited protein expression of COL1A1， COL3A1 and α-SMA in mCFs； D： OE-circMYO9A_043 inhibited the migration ability of mCFs （cell scratch assay）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vector group.

2　circMYO9A_043抑制mCFs中CPEB4表達

基因表達譜分析結(jié)果顯示，在mCFs中過表達circMYO9A_043可引起基因表達譜的改變，其中分別有150和152個基因呈現(xiàn)2倍以上的降低或升高表達變化（圖2A）。RT-qPCR驗證結(jié)果顯示，在過表達circMYO9A_0434的mCFs中，與蛋白翻譯活性相關的CUGBP Elav樣家族成員4（CUGBP Elav-like family member 4，）、、Nanos C2HC型鋅指蛋白1（Nanos C2HC-type zinc finger 1，）和真核生物翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白2（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 2，）基因顯著下調(diào)（圖2B），與基因表達譜分析結(jié)果一致。Western blot結(jié)果顯示，在過表達circMYO9A_043的mCFs中，CPEB4蛋白表達水平顯著下調(diào)（<0.01），見圖2C。RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，在mCFs中過表達能夠一致地增加纖維化相關基因和的mRNA和蛋白表達水平，見圖2D、E。細胞劃痕實驗顯示，過表達可顯著增加mCFs的遷移能力（<0.01），見圖2F。

Figure 2.　Overexpression of CPEB4（OE-CPEB4） enhanced the fibrotic phenotype of mCFs. A： the scatter plot showed the representative dysregulated mRNAs in mCFs with OE-CPEB4 （red： the over 2-fold up-regulated mRNAs； green： the over 2-fold down-regulated mRNAs）； B： circMYO9A_043 inhibited the mRNA expression of CELF4， CPEB4， NANOS1 and EIF4EBP2 in mCFs； C： circMYO9A_043 inhibited the protein expression of CPEB4 in mCFs； D and E ： OE-CPEB4promoted the mRNA and protein expression of fibrosis-related genes in mCFs； F： OE-CPEB4 promoted the migration ability of mCFs （cell scratch assay）. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vector group.

3　CPEB4可逆轉(zhuǎn)circMYO9A_043對mCFs中纖維化相關蛋白表達的抑制作用

利用腺病毒在mCFs中分別介導過表達circMYO9A_043和，Western blot結(jié)果顯示，過表達可逆轉(zhuǎn)circMYO9A_043對纖維化相關蛋白COL1A1、COL3A1和α-SMA表達的抑制作用（<0.05或<0.01），見圖3。

Figure 3.　Effects of circMYO9A_043 overexpression （OE-circMYO9A_043） and CPEB4 overexpression （OE-CPEB4） on the fibrosis-related protein expression in mCFs. OE-CPEB4 could reverse the inhibitory effect of circMYO9A_043 on the expression of fibrosis-related proteins in mCFs. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vector group； #P<0.05， ##P<0.01 vs OE-circMYO9A_043 group.

4　CPEB4增加mCFs中纖維化相關基因mRNA的穩(wěn)定性

CPEB4能夠與靶mRNA 3'端非翻譯區(qū)（3'-untranslated region， 3'UTR）上的富含AU元件（AU-rich element， ARE；如UUUUAU）結(jié)合，通過促進mRNA的多聚腺苷酸化而發(fā)揮促進mRNA穩(wěn)定性和翻譯的作用，模式圖如圖4A所示。RIP和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，CPEB4可以特異性結(jié)合和的mRNA，見圖4B。進一步的放線菌素D處理實驗結(jié)果顯示，在mCFs中過表達可顯著增加和mRNA的穩(wěn)定性（<0.05），見圖4C。

Figure 4.　Overexpression of CPEB4（OE-CPEB4） enhanced Col1a1， Col3a1 and Acta2 mRNA stability in mCFs. A： schematic representation of CPEB4 binding on AU-rich element （UUUUUAU） in mRNA 3'-untranslated region （UTR）； B： RIP assay and RT-qPCR revealed the interaction between CPEB4 and Col1a1/Col3a1/Acta2 mRNA； C： the mRNA expression of Col1a1， Col3a1 and Acta2 measured after treatment with actinomycin D. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs IgG group；*P<0.05 vs vector group.

討論

課題組以往的工作已經(jīng)證實，來自宿主基因以胞質(zhì)分布為主的circ_0036176在心肌纖維化時表達升高，體外實驗證實其具有抑制心臟成纖維細胞纖維化表型的作用［21］。本研究顯示，來自基因以胞核分布為主的circMYO9A_043同樣具有抑制mCFs纖維化表型的作用，這表明宿主基因來源相同的不同circRNA可能具有相同的生物學功能。

CPEB4屬于CPEB家族，其C端區(qū)域由2個含鋅指的序列特異性RNA結(jié)合蛋白和2個RNA識別基序組成［22-24］。CPEB4介導許多生理和病理過程，可以調(diào)節(jié)mRNA的翻譯，控制有絲分裂和減數(shù)分裂的細胞周期進程［25］。CPEB4參與多種疾病的發(fā)生，包括腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病等［26］。研究顯示，CPEB4可以通過增加p21 mRNA的穩(wěn)定性進而調(diào)控腎癌的進展［27］。在一項肝臟纖維化的研究中顯示，CPEB4可增加PFKFB3的表達，誘導糖酵解從而發(fā)揮促進肝臟纖維化的過程［28］。但目前尚未見CPEB4參與心肌纖維化過程調(diào)控的研究報道。我們通過體外實驗證實CPEB4能夠促進mCFs中纖維化相關基因表達，提高細胞的遷移能力，而成纖維細胞的遷移能力參與心肌纖維化的過程［29］，因此本研究證實了CPEB4具有促進纖維化的作用。

本研究通過對CPEB4的功能實驗研究，揭示了CPEB4促進mCFs中纖維化相關基因、和表達的調(diào)節(jié)機制。在mCFs中CPEB4通過特異與、和的mRNA結(jié)合，促進其多聚腺苷酸化，增加mRNA穩(wěn)定性，進而促進COL1A1、COL3A1和α-SMA蛋白表達，從而發(fā)揮促進mCFs纖維化表型的作用。

綜上所述，本研究明確了在體外實驗中circMYO9A_043可以下調(diào)mCFs中基因的表達，進而降低纖維化相關基因、和的mRNA穩(wěn)定性及COL1A1、COL3A1和α-SMA蛋白表達來發(fā)揮抑制成纖維細胞纖維化表型的作用。在后續(xù)的研究中，我們將進一步探究circMYO9A_043下調(diào)mCFs中CPEB4表達的分子機制，并在整體動物水平驗證circMYO9A_043通過下調(diào)CPEB4表達發(fā)揮抑制小鼠心肌纖維化的作用機制。

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circMYO9A_043 inhibits fibrotic phenotype of mouse cardiac fibroblasts by down-regulatingexpression

CHEN Zerun1， LI Yi1， LIANG Yu2， SU Jinfeng3， GAO Yuan1， OU Tao3， LI Hui4， XU Jindong4， FANG Xianhong2， SHAN Zhixin1，4△

（1，，510280，；2，，，，510080，；3，，510006，；4，，，，510080，）

To study the effect of circular RNA MYO9A-043 （circMYO9A_043） on the fibrotic phenotype of mouse cardiac fibroblasts （mCFs）， and to explore the potential mechanism.The recombinant circMYO9A_043 adenovirus was prepared for overexpressing circMYO9A_043 in neonatal C57BL/6 mCFs. The expression levels of myocardial fibrosis-related genes， collagen type I alpha 1 chain （）， collagen type III alpha 1 chain （） and smooth muscle actin alpha 2 （）， were determined by RT-qPCR and Western blot. Wound-healing assay was conducted to evaluate the migration ability of mCFs. The down-regulation of cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4 （） by circMYO9A_043 in mCFs was identified through RNA sequencing analysis and RT-qPCR. After the overexpression of， the mRNA and protein expression levels of，andwere determined in mCFs. The interactions betweenand//mRNA were detected by RNA binding protein immunoprecipitation （RIP） assay and RT-qPCR. Additionally， an actinomycin D treatment was performed to identify the effect ofon the stability of，andmRNA.Efficient adenovirus-mediated overexpression of circMYO9A_043 was achieved in mCFs. The overexpression of circMYO9A_043 significantly inhibited the expression of，andgenes in mCFs and the migration ability of mCFs （<0.05）. However， overexpression ofcould reverse the inhibitory effect of circMYO9A_043 on the expression of fibrosis-related genes in mCFs. The RIP assay revealed specific interactions betweenand//Acta2 mRNA （<0.01）. Results from the actinomycin D treatment showed thatcould enhance the mRNA stability of，andin mCFs （<0.05）.The circMYO9A_043 inhibits the fibrotic phenotype of mCFs by down-regulating the expression of.

myocardial fibrosis； cardiac fibroblasts； circular RNA MYO9A_043； cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4

1000-4718（2023）07-1225-08

2023-05-04

2023-06-26

020-83827812-51157； E-mail： shanzhixin@gdph.org.cn

R363； R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.07.009

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 82070254； No. 82200325）；廣東省自然科學基金資助項目（No. 2022A1515012522； No. 2022A1515012175； No. 2021A1515220122； No. 2023A1515010201； No. 2021A1515111173）；廣州市基礎與應用基礎研究項目（No. 202201011627）；廣東省人民醫(yī)院心血管專項（No. 2020XXG003）；廣東省人民醫(yī)院國自然培育項目（No. KY0120220028）

（責任編輯：余小慧，李淑媛）