軟木脂對黑曲霉的抑菌活性分析及軟木板防霉特性評價

＊趙威 魏新莉* 張俊 朱愿 李旺 肖朝順

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 湖南 410004 2.江蘇森豪仕軟木有限公司 江蘇 226500）

引言

軟木，采剝自栓皮楮（Quercus suber）或栓皮櫟（Quercus variabilis）的栓皮組織[1]，一直被認(rèn)為是具有天然防霉性能的優(yōu)良材料[2]。但市場上的軟木制品很多是由軟木顆粒構(gòu)成的膠結(jié)軟木板，研究膠結(jié)軟木板的防霉性，對于開發(fā)具有高防霉性能的軟木制品，提高人們生活品質(zhì)，具有十分重要的意義。

軟木的防霉性能研究主要圍繞軟木脂的防霉抑菌性展開，如Correia[3]驗證了軟木脂對人類主要致病菌具有殺菌活性，王慶國[4]驗證了軟木脂對黑曲霉（Aspergillus niger）的抑菌性，也有學(xué)者如Pereira、Rocha等[5-6]發(fā)現(xiàn)天然軟木板蒸煮后的放置階段，有霉菌感染了軟木原料。因此，對軟木材料本身的防霉特性進(jìn)行深入研究，具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。本研究以軟木再構(gòu)材料——膠結(jié)軟木板上的黑曲霉感染情況為研究對象，對比天然軟木板黑曲霉感染情況，來探討軟木板的防霉影響因素，以期為開發(fā)具有優(yōu)異防霉性的軟木制品提供重要的理論依據(jù)和參考。

1.材料與方法

(1)實驗材料與設(shè)備

①實驗材料

天然軟木板：采剝自陜西秦嶺栓皮櫟，經(jīng)壓平、裁切后制成的板狀材料，由森豪仕軟木有限公司提供。加工成尺寸為50mm（長）×20mm（寬）×5mm（厚）的試件備用。

膠結(jié)軟木板：由軟木顆粒（粒徑10～14目）與聚氨酯膠粘劑（固含量100%，pH值6）經(jīng)攪拌混合、模壓、熱定型、出模裁切等工序制得，理論密度0.4g/cm3。加工成尺寸為50mm（長）×20mm（寬）×5mm（厚）的試件備用。

黑曲霉菌種：購自于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

主要試劑：二氯甲烷、無水乙醇、甲醇、甲醇鈉，均為分析純，購自于上海麥克林生化科技有限公司；稀硫酸，0.1mol/L，購自于江陰市精奇化工有限公司。

②實驗設(shè)備

所用實驗設(shè)備如下：恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BSC-250），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；凈化工作臺（SW-CJ-2F），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-54A），上海施都凱儀器設(shè)備有限公司；掃描電子顯微鏡，Tescan Mira4，泰思肯有限公司。

(2)實驗方法

①軟木脂對黑曲霉的抑菌活性實驗

參照學(xué)者Brandcod[7]的方案提取出軟木脂，并準(zhǔn)備四個直徑5mm的濾紙圓片放置在黑曲霉培養(yǎng)基上，其中三個濾紙圓片滴入10μL，濃度54mg/mL的軟木脂醇溶液作為實驗組，一個濾紙圓片滴入10μL無水乙醇作為對照組。在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，經(jīng)過0h、48h、72h后，觀察濾紙圓片上的黑曲霉生長情況，并拍照記錄。

②膠結(jié)軟木板和天然軟木板對黑曲霉的防霉特性評價

按照GB/T 18261-2013《防霉劑對木材霉菌及變色菌防治效力的實驗方法》，對膠結(jié)軟木板和天然軟木板進(jìn)行防霉特性評價。首先，將涂有黑曲霉的培養(yǎng)基在溫度25℃、相對濕度85%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，使培養(yǎng)基逐漸長滿黑曲霉菌絲體；然后，將一組軟木板試件放置在長滿黑曲霉菌絲體的培養(yǎng)基上，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中放置28d，記錄霉菌感染面積并計算比例，獲得霉菌表面被害值，防霉等級評定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

③增濕處理后膠結(jié)軟木板和天然軟木板對黑曲霉的防霉特性評價

為了模擬極端潮濕環(huán)境，將軟木板試件分別浸沒在20℃水中24h、48h、72h進(jìn)行增濕處理，按照GB/T 18261-2013《防霉劑對木材霉菌及變色菌防治效力的實驗方法》對膠結(jié)軟木板和天然軟木板進(jìn)行防霉性能評價。

④微觀形貌觀察

觀察防霉特性評價后的軟木板試件，對比黑曲霉感染后軟木板試件表面的變化，采用掃描電子顯微鏡（SEM）拍照觀察。

2.結(jié)果與分析

(1)軟木脂對黑曲霉的抑菌活性

為了觀察軟木細(xì)胞的主要成分軟木脂的抑菌活性，提取出軟木脂，進(jìn)行黑曲霉抑菌活性對比，結(jié)果如圖1所示，三個黑色圈區(qū)域是實驗組區(qū)間，在實驗的前48h表現(xiàn)出了優(yōu)異的抑菌活性，未發(fā)現(xiàn)黑曲霉感染；白色圈區(qū)域是對照組區(qū)間，實驗開始不久就出現(xiàn)并長滿黑曲霉；當(dāng)實驗進(jìn)行到72h時，透明的軟木脂變得渾濁，表明菌絲體出現(xiàn)在實驗組區(qū)間。說明軟木脂對黑曲霉具有較好抑菌活性，但隨著時間的推移，黑曲霉也會逐漸將軟木脂覆蓋。

圖1 軟木脂的抑菌活性實驗

(2)膠結(jié)軟木板和天然軟木板對黑曲霉的防霉特性

膠結(jié)軟木板和天然軟木板對黑曲霉的防霉特性實驗如圖2所示，在溫度25℃、相對濕度85%的環(huán)境放置28d后，兩組軟木板試件均沒有菌絲和霉點的生長，根據(jù)防霉等級評定標(biāo)準(zhǔn)，被害值為0。說明即使長期處于高濕環(huán)境中，膠結(jié)軟木板和天然軟木板仍然保持了優(yōu)異的防霉特性。天然軟木板具有防霉性的主要原因是軟木細(xì)胞結(jié)構(gòu)的封閉性[8]，使得霉菌沒有足夠的水分滿足生長要求；另外軟木的成分主要是較為復(fù)雜的高級脂肪酸及少量蠟質(zhì)、萜烯樹脂等[9]，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，尤其是軟木脂特有的抑菌作用[10]，在軟木板的防霉特性上起到重要作用。膠結(jié)軟木板由軟木顆粒再構(gòu)而成，但是其化學(xué)成分的穩(wěn)定性和抑菌性保留下來，而且聚氨酯膠粘劑的添加讓被破壞的胞壁重新黏合，恢復(fù)了部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)的封閉性。

圖2 軟木試件對黑曲霉的防霉特性評價

(3)增濕處理對膠結(jié)軟木板和天然軟木板防霉特性的影響

由于軟木細(xì)胞自身的封閉性，軟木內(nèi)部很難浸入大量水分，通過對軟木試件進(jìn)行增濕處理，能夠快速提高其內(nèi)部含水量。對增濕后的膠結(jié)軟木板和天然軟木板防霉特性進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)增濕時間不同，膠結(jié)軟木試件表面感染面積比例不變（＜1/4），被害值等級為1，如圖3所示，膠結(jié)軟木板增濕的時間和進(jìn)入軟木試件內(nèi)部的水量對霉菌的感染面積沒有影響。天然軟木板組進(jìn)行了增濕處理后，試件表面被害值仍為0，沒有發(fā)現(xiàn)表面霉菌生長，仍表現(xiàn)出優(yōu)異的防霉能力。

圖3 增濕軟木試件對黑曲霉的防霉特性評價

對增濕處理膠結(jié)軟木板進(jìn)行被黑曲霉感染后微觀形貌觀察，如圖4所示。從圖4（a）可以看到分生孢子分布在軟木顆粒間的縫隙。產(chǎn)生霉變的原因是增濕處理使得水分進(jìn)入顆粒之間的縫隙中，顆粒間的縫隙為霉菌提供了霉菌生長的空間和水分。圖4（b）顯示出黑曲霉的孢子附著在細(xì)胞腔內(nèi)，未能生長成為分生孢子，推測軟木酯和聚氨酯膠黏劑對軟木顆粒的細(xì)胞壁具有一定固定和保護作用。

圖4 增濕膠結(jié)軟木板黑曲霉感染情況

3.結(jié)論

膠結(jié)軟木板和天然軟木板均具有優(yōu)異的防霉性，近乎封閉的軟木細(xì)胞結(jié)構(gòu)和軟木脂是軟木防霉性的基礎(chǔ)。在高濕環(huán)境下，膠結(jié)軟木板再構(gòu)結(jié)構(gòu)的縫隙可以為霉菌的生長提供環(huán)境和水分，從而造成膠接軟木板被黑曲霉感染。軟木脂和聚氨酯膠粘劑對軟木顆粒具有保護作用，可減弱黑曲霉對軟木顆粒的感染。