高通量測序分析黃酒糟制香糟自然發(fā)酵過程中微生物群落多樣性

賈 曼，楊 絮，周國燕，郭全友,*，朱 琳，鄭 堯

（1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

黃酒糟是黃酒生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，是黃酒成熟醪壓榨后留下的固形物[1]。以黃酒糟等為主要原料，經(jīng)壓碎、過篩并與香辛料均勻混合后入壇密封，發(fā)酵后制成香糟。香糟鹵是以香糟為主要原料，通過添加天然植物香辛料、食鹽、黃酒等調(diào)味成分[2]，經(jīng)配制、過濾、滅菌、灌裝等工藝開發(fā)而成的液態(tài)調(diào)味品[3]。目前，優(yōu)質(zhì)香糟鹵的生產(chǎn)常以封壇固態(tài)發(fā)酵3 a形成的香糟為原料，發(fā)酵周期長，大大影響了生產(chǎn)效率。此外，香糟鹵固態(tài)發(fā)酵1、2、3 a產(chǎn)品風(fēng)味存在一定差異，而發(fā)酵食品風(fēng)味的形成與發(fā)酵過程中的微生物及其代謝產(chǎn)物密切相關(guān)[4]，且黃酒糟發(fā)酵是在相對不受控制和自發(fā)的方式下進(jìn)行，導(dǎo)致香糟鹵制品風(fēng)味不穩(wěn)定。因此，了解發(fā)酵過程中的微生物群落多樣性將有助于確保最終產(chǎn)品的質(zhì)量，對開發(fā)發(fā)酵劑，改進(jìn)發(fā)酵工藝，縮短發(fā)酵周期至關(guān)重要。

高通量測序技術(shù)代替了傳統(tǒng)純培養(yǎng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-時間溫度梯度凝膠電泳和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳等方法[5]，可一次性對樣品中的幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，快速確定其中微生物的種類和豐度[6]，并廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落的宏基因組研究中[7]，如意大利臘腸[8]、泡菜[9]和豆豉[10]等。基于高通量測序?qū)ξ⑸锒鄻有耘c物種組成研究發(fā)現(xiàn)，酒糟中的細(xì)菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、微球菌屬（Micrococcus）等；真菌主要有酵母屬（Saccharomyces）、根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）等。Wang Xueshan等[11]采用16S rRNA擴(kuò)增子測序技術(shù)分析了白酒糟中的原核生物群落，共鑒定出204 個屬，主要以乳桿菌屬和明串珠菌屬（Leuconostoc）等為主；Song Zhewei等[12]基于高通量測序技術(shù)分析醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵過程中核心微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)畢赤酵母屬（Pichia）和曲霉屬等為優(yōu)勢真菌群落。但是，目前關(guān)于自然發(fā)酵過程中黃酒糟微生物的研究鮮有報道，對黃酒糟發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、多樣性以及動態(tài)變化情況等仍缺乏全面的認(rèn)識。

本研究以發(fā)酵1、2、3 a黃酒糟為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析不同發(fā)酵階段黃酒糟樣品微生物組成，客觀地評價微生物種類、數(shù)量及優(yōu)勢菌群的變化規(guī)律，旨在為篩選功能發(fā)酵菌株和發(fā)酵條件優(yōu)化等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品準(zhǔn)備

黃酒糟取自東江酒業(yè)有限公司。其工藝主要為：黃酒糟→添加香辛料等→攪拌均勻→入壇鹽封→加蓋泥封→室外自然發(fā)酵。同時對發(fā)酵1、2、3 a黃酒糟取3 份平行，分別標(biāo)記為DJ1-1～DJ1-3、DJ2-1～DJ2-3、DJ3-1～DJ3-3。樣品4 ℃貯藏，供后續(xù)分析。

1.1.2 試劑

DNA提取試劑盒 廣州美基生物科技有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 美國NEB公司；DNA Marker 日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠電泳 緩沖液 美國Invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國ABI公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng) 北京百晶生物技術(shù)有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取

取4 ℃中保存的黃酒糟充分破碎攪拌，取200 mg黃酒糟樣品于離心管中，使用美基DNA提取試劑盒（D6356-03）按照說明書提取總基因組DNA樣品，并在進(jìn)一步分析前貯存在-20 ℃。分別用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定提取的DNA數(shù)量和質(zhì)量。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及測序

對細(xì)菌兩個連續(xù)的可變區(qū)V3～V4[13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用正向引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和反向引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）[14]進(jìn)行。將PCR所需的成分配制完后，在PCR儀上于98 ℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于98 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到52 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃保持45 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成1 個循環(huán)。重復(fù)循環(huán)25 次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后，在72 ℃保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整，4 ℃保存。

對真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用正向引物ITS5F（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）和反向引物ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）[15]進(jìn)行。將PCR所需的成分配制完后，在PCR儀上于98 ℃預(yù)變性5 min，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于98 ℃保持30 s使模板變性，然后將溫度降到52 ℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72 ℃保持1 min，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復(fù)循環(huán)28 次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。最后，在72 ℃保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整，4 ℃保存。

擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。委托上海派森諾生物科技有限公司Illumina MiSeq平臺進(jìn)行雙端 測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Illumina平臺對群落DNA片段進(jìn)行雙端（Pairedend）測序，使用分析軟件QIIME2（2019.4）并調(diào)用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過qiime dada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體[16]，相當(dāng)于以100%相似度聚類。完成對所有文庫的去噪后，合并擴(kuò)增序列變體（amplicon sequence variant，ASV）的特征序列和ASV表格，并去除singletons ASVs；序列長度分布統(tǒng)計使用R語言腳本，對全部樣本中所包含的高質(zhì)量序列的長度分布進(jìn)行統(tǒng)計。利用OriginPro 2022和Excel 2019軟件工具繪制各分類水平下的微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)圖，對各樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

α多樣性反映了單個樣品內(nèi)部物種的多樣性，根據(jù)100%相似性水平下的ASV信息，采用α多樣性指標(biāo)的覆蓋率、ASV數(shù)量、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評估。

表1顯示，3 個發(fā)酵階段樣品的覆蓋率均在99.95%以上，表明測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋樣品中細(xì)菌及真菌的種類，真實反映樣品中物種豐度及多樣性；如圖1所示，稀釋曲線平緩，說明測序深度較好，測序數(shù)據(jù)量合理[17]。結(jié)果顯示，無論細(xì)菌還是真菌，發(fā)酵初期ASV數(shù)量和Chao1指數(shù)均最低，即物種豐度最低。發(fā)酵初期組內(nèi)樣品細(xì)菌Chao1指數(shù)差異大，變化范圍為613.91～1017.90，均值為882，發(fā)酵中期和后期Chao1指數(shù)均值為1213和1201，物種豐度呈現(xiàn)向上升后穩(wěn)定的趨勢，發(fā)酵中后期Chao1指數(shù)的浮動趨勢不大，表明樣品中的微生物在逐漸適應(yīng)生長環(huán)境，物種豐度趨于平穩(wěn)。發(fā)酵過程中，細(xì)菌Shannon指數(shù)分別為6.39、6.14和6.55，Simpson指數(shù)變化范圍為0.93～0.95；真菌的Shannon指數(shù)分別為6.71、6.88和6.62，Simpson指數(shù)變化范圍為0.97～0.99，多樣性指數(shù)無明顯變化，表明黃酒糟固態(tài)自然發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，群落復(fù)雜度不變。

圖1 高通量測序中細(xì)菌（A）和真菌（B）的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria (A) and fungi (B) in high-through sequencing

2.2 微生物物種組成分析

2.2.1 基于門水平的發(fā)酵黃酒糟菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)得到的每個ASV在門分類水平的物種分類信息，分析樣本ASV在門分類水平上的群落結(jié)果。由圖2可知，3 組發(fā)酵黃酒糟樣品中細(xì)菌及真菌微生物群落組成相似，但相對豐度存在差異。在門水平下，發(fā)酵黃酒糟樣品一共鑒定出31 個細(xì)菌物種，圖2A顯示豐度水平前10的物種。發(fā)酵黃酒糟中細(xì)菌優(yōu)勢菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）。羅愛國等[18]基于門水平對清香型堡子酒酒糟樣品中的細(xì)菌菌群進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)這4 個菌門為細(xì)菌優(yōu)勢門，與本研究結(jié)果一致。變形菌門是黃酒糟發(fā)酵整個過程中的絕對優(yōu)勢菌門，發(fā)酵第1年其平均相對豐度為71.26%，整個發(fā)酵過程，其相對豐度變化不大，發(fā)酵第2年相對豐度上升至75.27%，于發(fā)酵第3年下降至73.22%。這可能是由于變形菌門的一部分細(xì)菌為好氧型，不能適應(yīng)黃酒糟發(fā)酵過程中缺氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)醇的環(huán)境，因而在發(fā)酵第3年豐度降低。厚壁菌門在發(fā)酵第1年時占較高比例（16.09%），隨發(fā)酵進(jìn)行其相對豐度逐漸降低并趨于穩(wěn)定。擬桿菌門在黃酒糟發(fā)酵過程中呈現(xiàn)小幅度先上升后下降的趨勢，在黃酒糟發(fā)酵第2年相對豐度達(dá)到最高（6.82%）。放線菌門在黃酒糟發(fā)酵過程中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在發(fā)酵第3年相對豐度達(dá)到最高（5.78%）。

圖2 發(fā)酵黃酒糟中細(xì)菌（A）和真菌（B）門水平的群落分類學(xué) 組成和相對豐度分布Fig.2 Phylum-level composition and abundance distribution of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented huangjiu vinasse

在門水平下，發(fā)酵黃酒糟樣品共鑒定出10 個真菌物種。如圖2B所示，發(fā)酵黃酒糟中主要真菌優(yōu)勢菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和蛙糞霉門（Basidiobolomycota）。子囊菌門是黃酒糟發(fā)酵整個過程中的絕對優(yōu)勢菌門，發(fā)酵過程中，其相對豐度分別為63.46%、58.07%、51.68%，呈現(xiàn)逐年下降的趨勢。陳雪等[19]利用高通量測序技術(shù)分析鳳香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)整個發(fā)酵過程中子囊菌門占絕對優(yōu)勢，與本研究結(jié)果一致。擔(dān)子菌門在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵第2年其相對豐度達(dá)到最高（16.23%）。被孢霉門在發(fā)酵第1、2年相對豐度較接近，呈現(xiàn)輕微下降趨勢，在發(fā)酵第3年相對豐度下降至3.10%。蛙糞霉門在黃酒糟發(fā)酵第1、2年相對豐度接近，分別為1.47%、1.56%，在發(fā)酵第3年其相對豐度下降至0.35%。有研究表明，子囊菌門、擔(dān)子菌門等是多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群[20]。

2.2.2 基于屬水平的發(fā)酵黃酒糟菌群結(jié)構(gòu)與熱圖分析

根據(jù)得到的每個ASV在屬分類水平的物種分類信息，分析樣本ASV在屬分類水平上的群落結(jié)果。在屬水平下，發(fā)酵黃酒糟樣品共鑒定出944 個細(xì)菌物種，315 個真菌物種。3 組發(fā)酵黃酒糟樣品中細(xì)菌及真菌微生物群落組成相似，但相對豐度存在差異。由圖3A可知，黃酒糟發(fā)酵過程中排前10的細(xì)菌屬分別為水小桿菌屬（Aquabacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、柄桿菌屬（Caulobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、不黏桿菌屬（Asticcacaulis）、Muribaculaceae、Inhella、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospriaceae_NK4A136_group）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。發(fā)酵初期，以水小桿菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌屬，在發(fā)酵過程中由22.48%升高到24.94%，發(fā)酵結(jié)束時恢復(fù)到21.29%，仍為優(yōu)勢屬；且由圖3B可知，水小桿菌屬于DJ2-3與DJ3-2相對豐度最高，分別為26.52%與25.93%，水小桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生聚β-羥基丁酸酯，積聚在細(xì)菌體內(nèi)，作為碳源和能源的儲備物質(zhì)[21]。短波單胞菌屬隨著發(fā)酵時間延長相對豐度呈現(xiàn)逐年下降的趨勢；由圖3B可知，與其他發(fā)酵階段相比，慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和芽孢桿菌屬在發(fā)酵末期相對豐度較高，如DJ3-1與DJ3-3樣品中慢生根瘤菌屬相對豐度為1.15%與0.95%；芽孢桿菌相對豐度為2.33%與2.35%。芽孢桿菌能影響白酒的風(fēng)味物質(zhì)如酯、醇的形成[22-23]；同時，乳桿菌屬在發(fā)酵中期相對豐度最高，在DJ2-2與DJ2-3樣品中相對豐度分別為1.60%與1.89%，在發(fā)酵第3年其相對豐度降低至0.64%，乳桿菌屬與乳酸乙酯的形成具有密切關(guān)系[24]，其對于有機(jī)酸具有一定的耐受能力[25]，能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長前發(fā)酵期，有利于發(fā)酵有益菌的生長，對香味物質(zhì)增加有利[26-27]。

圖3 發(fā)酵黃酒糟中細(xì)菌屬水平的群落分類學(xué)組成（A）和熱圖（B）Fig.3 Genus-level composition (A) and heatmap (B) of bacterial communities in fermented huangjiu vinasse

由圖4A可知，黃酒糟發(fā)酵過程中排前10的真菌屬分別為畢赤酵母屬（Pichia）、Tausonia、被孢霉屬（Mortierella）、曲霉屬（Aspergillus）、裂殼菌屬（Schizothecium）、尖孢鐮刀菌屬（Fusarium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、外瓶霉屬（Exophiala）、Phialemoniopsis、Tetracladium。劉念等[28]在對濃香型白酒糟醅微生物研究中發(fā)現(xiàn)，酵母屬、曲霉屬等是濃香型白酒糟醅中的主要優(yōu)勢菌。研究表明酵母類真菌在產(chǎn)香、產(chǎn)酒等方面具有較強(qiáng)作用[29]，能夠產(chǎn)生多種風(fēng)味酯并貢獻(xiàn)乙醇和其他有機(jī)酸[30-31]。結(jié)果顯示，畢赤酵母在整個發(fā)酵過程中占絕對優(yōu)勢，結(jié)合圖4B可知，其在發(fā)酵末期相對豐度最高，在DJ3-2與DJ3-3樣品中相對豐度分別為18.43%與17.41%。畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源[32]，發(fā)酵過程中，原料的植物細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的果膠被水解成甲醇，隨著發(fā)酵過程的積累，發(fā)酵后期畢赤酵母豐度達(dá)到最高；畢赤酵母具有高產(chǎn)乙酸乙酯的特性，同時是乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的第2大生產(chǎn)者[33]，能促進(jìn)發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生，增強(qiáng)產(chǎn)品的香氣特征。另外，發(fā)酵中期DJ2-2樣品中Tausonia、亞隔孢殼屬、曲霉屬與球腔菌屬（Mycosphaerella）相對豐度較其他發(fā)酵階段高，分別為9.94%、4.21%、9.38%與2.77%。曲霉屬能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等，是黃酒糟發(fā)酵中淀粉等大分子物質(zhì)分解的主要動力之一[34-35]。被孢霉屬與裂殼菌屬在發(fā)酵過程中相對豐度呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，在發(fā)酵第3年相對豐度均達(dá)到最低值，分別為3.10%、1.55%；發(fā)酵末期DJ3-1樣品中，外瓶霉屬、Knufia和雙足囊菌屬（Dipodascus）相對豐度較高，分別為8.81%、4.17%與2.78%。以上結(jié)果表明，黃酒糟同一批次不同樣品間存在差異，表明了固態(tài)自然發(fā)酵過程的不均一性。

圖4 發(fā)酵黃酒糟中真菌屬水平的群落分類學(xué)組成（A）和熱圖（B）Fig.4 Genus-level composition (A) and heatmap (B) of fungal communities in fermented huangjiu vinasse

同時，由屬水平的菌群結(jié)構(gòu)可以看出，無論是細(xì)菌還是真菌，菌群結(jié)構(gòu)都十分復(fù)雜。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)與微生物的生長和代謝密切相關(guān)[36]。這些微生物催化原料不斷進(jìn)行一系列復(fù)雜的反應(yīng)，可以分解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)，形成糖和氨基酸，從而引發(fā)美拉德反應(yīng)，生成黃酒糟獨特的風(fēng)味前體物質(zhì)；能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分解為小分子肽，并形成重要的香氣成分，例如醛、醇、酯、酮等，進(jìn)而形成糟鹵清爽醇厚的風(fēng)格特征[37-39]。

2.3 β多樣性分析

通過β多樣性分析黃酒糟制香糟發(fā)酵過程中微生物群落組成的差異性，基于Bray-Curtis距離算法對所有樣品進(jìn)行非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析，不同樣品間的差異程度，通過點與點的距離表現(xiàn)在圖中，兩點之間的距離越遠(yuǎn)，表明兩個樣品中微生物群落的差異越大[40]，結(jié)果如圖5所示。對細(xì)菌群落測序結(jié)果進(jìn)行排序分析，其stress值為 0.092＜0.1，排序結(jié)果良好。從圖5A可知，發(fā)酵第2年與發(fā)酵第3年樣品均分布在1、4象限，而發(fā)酵第1年樣品獨自分布在第2、3象限，表明發(fā)酵第1年樣品的細(xì)菌屬組成與其他樣品具有較大差異，綜合α多樣性和菌群結(jié)構(gòu)分析可知，此種差異主要來源于細(xì)菌的相對豐度改變。真菌群落的NMDS分析結(jié)果如圖5B所示，其stress值為 0.075＜0.1，排序結(jié)果良好。其中發(fā)酵第1年與發(fā)酵第2年樣品均分布在第2、3象限，表明這兩年的樣品間具有一定相似性，且與發(fā)酵第3年樣品距離較遠(yuǎn)，可能是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類及醇類等物質(zhì)的累積，不適于某些真菌的生長繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵第3年與發(fā)酵前兩年的真菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異[41]。

圖5 微生物群落的NMDS分析 Fig.5 NMDS analysis of microbial communities in fermented huangjiu vinasse

3 結(jié)論

采用高通量測序分析黃酒糟固態(tài)自然發(fā)酵階段細(xì)菌及真菌群落變化情況，黃酒糟微生物群落的多樣性指數(shù)、分類學(xué)組成的變化和聚類分析等表明，黃酒糟發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。其中，水小桿菌屬、短波單胞菌屬、柄桿菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌屬，這些菌屬在其他酒糟中的相關(guān)報道較少，這表明微生物結(jié)構(gòu)與發(fā)酵原料、發(fā)酵工藝、地理位置和發(fā)酵環(huán)境有很大的關(guān)系。其中芽孢桿菌屬與乳桿菌屬相對豐度位居前13 位，但對整個發(fā)酵過程起著不可忽視的作用。畢赤酵母、Tausonia、被孢霉屬和曲霉屬為優(yōu)勢真菌屬。綜上，黃酒糟發(fā)酵不同階段的微生物群落存在差異，且發(fā)酵過程對微生物相對豐度具有明顯影響，為進(jìn)一步研究黃酒糟的發(fā)酵代謝機(jī)理及菌株篩選奠定了基礎(chǔ)。