敲低FAM83D調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用及機(jī)制*

張 嵐,王靜依,劉述江,葉禮翠,吳欣瑜

(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院/核工業(yè)四一六醫(yī)院婦產(chǎn)科,成都 610057)

宮頸癌是發(fā)病率居首位的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,深入研究疾病的分子機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物,對(duì)于精準(zhǔn)制訂診療策略具有指導(dǎo)意義[1-2]。腫瘤干細(xì)胞是具有自我更新、多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞,在惡性腫瘤發(fā)生、耐藥、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮重要作用,是近年來(lái)研究癌癥分子機(jī)制的熱門靶點(diǎn)[3-4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)通路是調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞特性的重要信號(hào)通路,該通路激活后增加下游Sox2、Oct4基因的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞維持自我更新、多向分化的腫瘤干細(xì)胞特性[5-7]。序列相似性83蛋白質(zhì)家族成員D(family with sequence similarity 83,member D,FAM83D)是新發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因,在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等多種婦科惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[8-9];另有相關(guān)基礎(chǔ)研究證實(shí),FAM83D的促癌作用與激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)[10-11],但該基因是否在宮頸癌中調(diào)控腫瘤干細(xì)胞尚不清楚。本研究將主要通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析敲低FAM83D調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本

選取2020年1月至2022年3月在本院手術(shù)切除的宮頸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織。共納入65對(duì)組織標(biāo)本,對(duì)應(yīng)患者均經(jīng)術(shù)后病理診斷為宮頸癌,術(shù)前均未接受放化療,平均年齡(59.39±9.23)歲,平均體重指數(shù)(22.83±5.52)kg/m2。

1.1.2細(xì)胞株

宮頸癌細(xì)胞株Hela、Siha、C33A及正常宮頸上皮細(xì)胞株H8均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技公司。

1.1.3主要儀器與試劑

陰性對(duì)照(NC)干擾小RNA(siRNA)、FAM83D siRNA購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,NC短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒、FAM83D shRNA慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)科技公司,總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司,兔來(lái)源FAM83D、Oct4、Sox2特異性一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,β-catenin通路激動(dòng)劑SKL2001購(gòu)自美國(guó)MCE公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

Hela、Siha、C33A、H8細(xì)胞均在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng),每2天更換1次培養(yǎng)基,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面80%后用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi),用于FAM83D及干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的檢測(cè)。

將接種在培養(yǎng)板內(nèi)的Hela細(xì)胞分為5組:si-NC組轉(zhuǎn)染NC siRNA,si-FAM83D組轉(zhuǎn)染FAM83D siRNA,二甲基亞砜(DMSO)+si-NC組在含有體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的條件下轉(zhuǎn)染NC siRNA,DMSO+si-FAM83D組在含有體積分?jǐn)?shù)0.1% DMSO的條件下轉(zhuǎn)染FAM83D siRNA,SKL2001+si-FAM83D組在含有20 μmol/L SKL2001(含0.1% DMSO)的條件下轉(zhuǎn)染FAM83D siRNA。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,連續(xù)處理24 h,用于mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

將接種在培養(yǎng)皿內(nèi)的Hela細(xì)胞進(jìn)行分組:NC-shRNA組感染NC shRNA慢病毒,FAM83D-shRNA組感染FAM83D shRNA慢病毒,感染復(fù)數(shù)為10,感染24 h后更換為完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)72 h,而后將細(xì)胞用于瘤球形成實(shí)驗(yàn)。在瘤球形成實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,同時(shí)加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的DMSO或20 μmol/L SKL2001,作為DMSO+NC-shRNA組、DMSO+FAM83D-shRNA組、SKL2001+FAM83D-shRNA組。

1.2.2熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)檢測(cè)基因mRNA表達(dá)水平

取宮頸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織各約10 mg,以及接種在培養(yǎng)板內(nèi)的Hela、Siha、C33A、H8細(xì)胞和分組處理的Hela細(xì)胞。采用總RNA提取試劑盒提取組織及細(xì)胞中的總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)組織及細(xì)胞中的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、合成cDNA,最后采用熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè),PCR反應(yīng)體系如下:cDNA 1 μL、熒光定量檢測(cè)反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL,去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min預(yù)變性;95 ℃ 15 s,特異性退火溫度(FAM83D 60 ℃、Oct4 58 ℃、Sox2 62 ℃)25 s,延伸72 ℃ 30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct),以β-actin為內(nèi)參,按照公式2-ΔΔCt計(jì)算FAM83D、Oct4、Sox2 mRNA表達(dá)水平。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取石蠟包埋的宮頸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織,制作病理切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù),然后孵育FAM83D一抗(1∶200稀釋)、Oct4一抗(1∶150稀釋)、Sox2一抗(1∶200稀釋),磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍后孵育二抗(1∶200稀釋),PBS清洗3遍后加入卵白素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色,封片后在顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取分組處理的Hela細(xì)胞,加入裂解液后提取細(xì)胞蛋白,用二喹啉甲酸法(BCA)檢測(cè)蛋白水平后取30 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳,而后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶室溫孵育1～2 h,用叉頭框蛋白A2(FOXA2)一抗(1∶1 000)、β-catenin一抗(1∶500)或β-actin一抗(1∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜,次日室溫孵育二抗(1∶1 000)1 h。最后將硝酸纖維素膜放入凝膠成像系統(tǒng),用電化學(xué)發(fā)光法顯影得到FAM83D、Oct4、Sox2及β-actin條帶,以β-actin條帶灰度值為內(nèi)參,計(jì)算FAM83D、Oct4、Sox2蛋白表達(dá)水平。

1.2.5瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞特性

取慢病毒感染的Hela細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸后接種在培養(yǎng)板內(nèi),加入1∶50稀釋的B27、20 ng/mL成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子(EGF),每2天更換1次培養(yǎng)基,培養(yǎng)10 d后觀察長(zhǎng)徑>30 μm的腫瘤細(xì)胞球并計(jì)數(shù),細(xì)胞球形成率=球形結(jié)構(gòu)數(shù)/初始種植細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0軟件及Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及制圖,宮頸癌組織與癌旁組織比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn);細(xì)胞多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t法,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析;以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌組織和癌旁組織FAM83D和干細(xì)胞標(biāo)志基因及其蛋白表達(dá)水平比較

宮頸癌組織中FAM83D、Oct4及Sox2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見表1。相關(guān)性分析顯示:宮頸癌組織中FAM83D mRNA與Oct4、Sox2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.351、-0.332,P<0.05)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示:宮頸癌組織中FAM83D、Oct4、Sox2的染色強(qiáng)度均較癌旁組織增強(qiáng),見圖1。

圖1 宮頸癌組織和癌旁組織FAM83D、Oct4及Sox2的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色)

2.2 宮頸癌細(xì)胞株與正常宮頸上皮細(xì)胞株中FAM83D和干細(xì)胞標(biāo)志基因及其蛋白表達(dá)水平比較

宮頸癌細(xì)胞株Hela、Siha、C33A中FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于正常宮頸上皮細(xì)胞株H8,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);并且,Hela細(xì)胞中FAM83D、Oct4、Sox2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均高于Siha、C33A細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2、圖2。

a:P<0.05,與H8細(xì)胞比較;b:P<0.05,與Hela細(xì)胞比較。

表2 宮頸癌細(xì)胞株與正常宮頸上皮細(xì)胞株中FAM83D、 Oct4及Sox2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 敲低FAM83D對(duì)Hela細(xì)胞干細(xì)胞特性的調(diào)控作用

si-FAM83D組Hela細(xì)胞中FAM83D、Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。FAM83D-shRNA組Hela細(xì)胞中FAM83D mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平,以及細(xì)胞球形成率均低于NC-shRNA組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

A:FAM83D、Oct4及Sox2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較;B:FAM83D、Oct4及Sox2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較;a:P<0.05,與si-NC組比較。

A:FAM83D mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較;B:細(xì)胞球形成率比較;a:P<0.05,與NC-shRNA組比較。

2.4 敲低FAM83D對(duì)Hela細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的調(diào)控作用

si-FAM83D組Hela細(xì)胞中β-catenin mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均低于si-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

A:β-catenin mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較;B:β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較;a:P<0.05,與si-NC組比較。

2.5 β-catenin通路激動(dòng)劑SKL2001對(duì)敲低FAM83D抑制Hela細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響

DMSO+si-FAM83D組Hela細(xì)胞中Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于DMSO+si-NC組(P<0.05);SKL2001+si-FAM83D組Hela細(xì)胞中Oct4、Sox2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于DMSO+si-FAM83D組(P<0.05),見圖6A、B。

A:Oct4、Sox2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較;B:Oct4、Sox2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較;C:細(xì)胞球形成率比較;a:P<0.05,與DMSO+si-NC組或DMSO+NC-shRNA組比較;b:P<0.05,與DMSO+si-FAM83D組或DMSO+FAM83D-shRNA組比較。

DMSO+FAM83D-shRNA組Hela細(xì)胞的細(xì)胞球形成率低于DMSO+NC-shRNA組,SKL2001+FAM83D-shRNA組Hela細(xì)胞的細(xì)胞球形成率高于DMSO+FAM83D-shRNA組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖6C。

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)是近些年備受關(guān)注的惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制之一,該學(xué)說(shuō)認(rèn)為惡性腫瘤組織中存在一部分具有自我更新及多向分化潛能的癌細(xì)胞亞群,同時(shí)具有癌細(xì)胞特性和干細(xì)胞特性,可能既是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的起始細(xì)胞,也是惡性腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及耐藥的根源[12-14]。因此,闡明腫瘤干細(xì)胞特性的調(diào)控機(jī)制有助于深入認(rèn)識(shí)惡性腫瘤的分子機(jī)制,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

FAM83D基因是一種新發(fā)現(xiàn)的原癌基因,該基因編碼的蛋白質(zhì)定位于紡錘體,是促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵蛋白。有研究報(bào)道,子宮內(nèi)膜癌[8]、卵巢癌[9]、乳腺癌[15-16]、肝癌[17-18]等惡性腫瘤組織中FAM83D的高表達(dá)與腫瘤病理進(jìn)展及生存預(yù)后不良有關(guān),提示FAM83D在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起促進(jìn)作用。本研究對(duì)宮頸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織的檢測(cè)也證實(shí)宮頸癌中FAM83D表達(dá)水平明顯升高。另有基礎(chǔ)研究報(bào)道,FAM83D對(duì)多種癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均具有促進(jìn)作用,并且與激活Wnt/β-catenin通路[10-11]、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路[19-20]等信號(hào)通路有關(guān)。在受到FAM83D調(diào)控的信號(hào)通路中,Wnt/β-catenin通路對(duì)宮頸癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性的維持具有促進(jìn)作用。

基于上述認(rèn)識(shí),本研究就FAM83D對(duì)宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的調(diào)控作用及機(jī)制進(jìn)行了探索。(1)通過(guò)檢測(cè)臨床標(biāo)本中干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)水平證實(shí),宮頸癌組織中Oct4、Sox2 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織,且與FAM83D mRNA表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān),提示FAM83D可能在宮頸癌組織中參與癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的調(diào)控。(2)設(shè)計(jì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,在Hela、Siha、C33A 3種宮頸癌細(xì)胞中FAM83D及干細(xì)胞標(biāo)志基因Oct4、Sox2的表達(dá)均高于正常宮頸上皮細(xì)胞,與宮頸癌組織中相應(yīng)基因表達(dá)的變化趨勢(shì)一致。Hela細(xì)胞中FAM83D、Oct4、Sox2表達(dá)增加最明顯,在該細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA敲低FAM83D的表達(dá)后,細(xì)胞中Oct4、Sox2表達(dá)明顯降低;感染shRNA慢病毒敲低FAM83D的表達(dá)后,細(xì)胞球形成率明顯降低。以上結(jié)果表明敲低FAM83D對(duì)宮頸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性具有抑制作用。

Wnt/β-catenin通路是目前已知參與惡性腫瘤干細(xì)胞特性調(diào)控的信號(hào)通路[21-23],也是受到FAM83D調(diào)控的信號(hào)通路。本研究在Hela細(xì)胞中證實(shí),敲低FAM83D的表達(dá)后,β-catenin表達(dá)水平明顯降低,表明FAM83D基因參與宮頸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的調(diào)控。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析Wnt/β-catenin通路在FAM83D調(diào)控宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性中的作用,在敲低FAM83D表達(dá)的同時(shí)聯(lián)合使用β-catenin激動(dòng)劑SKL2001后,敲低FAM83D降低干細(xì)胞標(biāo)志基因Oct4、Sox2表達(dá)及細(xì)胞球形成率的作用明顯被削弱,表明敲低FAM83D抑制宮頸癌細(xì)胞干細(xì)胞特性的作用部分與抑制Wnt/β-catenin通路有關(guān)。

綜上所述,宮頸癌組織及細(xì)胞株中FAM83D表達(dá)水平增加;敲低FAM83D明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性,并且這一抑制作用與抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。