可變剪切事件在鱉甲煎丸抑制肝癌細胞增殖過程中的作用機制及變化*

楊 利,林洪升,李 屏,韋 巍,孔茵芝,謝楊益,李明芬,3,潘愛萍△

(1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗診斷教研室,南寧 530022;2.廣西中醫(yī)藥大學研究生學院,南寧 530200;3.廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學分子生物學重點實驗室,南寧 530022)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的腫瘤類型,也是目前最常見的致死性惡性腫瘤。流行病學顯示我國的HCC患者5年生存率小于15%[1]。雖然早期的HCC可以通過肝切除、移植和消融等治療方案取得了較好的治療效果,但HCC是一種高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的腫瘤,早期診斷較難,導致了HCC治療選擇的局限性和低生存率[2]。鱉甲煎丸是由二十三味中藥組成的中成藥,源于《金匱要略·瘧病脈證并治》,具有活血化瘀、軟堅散結(jié)的功效[3]。越來越多的研究表明鱉甲煎丸具有誘導腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫功能、抑制腫瘤血管生成等作用?？勺兗羟惺且环N可增加蛋白質(zhì)多樣性的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,國內(nèi)有學者認為異?？勺兗羟惺录赡茉谀[瘤發(fā)展和治療中發(fā)揮作用[4]。本研究旨在探討鱉甲煎丸是否通過增強可變剪切進而抑制HCC的發(fā)展,為HCC的診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞來源

人肝癌細胞株SMMC-7721 受贈于廣西中醫(yī)藥大學生化教研室。

1.1.2動物

60只SPF級SD雄性大鼠(許可證號:SYXK桂2013-0005),體重(200±30)g,飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物學實驗室,進食配制基礎(chǔ)飼料。

1.1.3藥品

鱉甲煎丸藥劑購自武漢中聯(lián)公司(批號:160400),其組成包括炙鱉甲、赤硝各十二分(各90 g),蜣螂六分(45 g),芍藥、牡丹、土鱉蟲各五分(各37.5 g),蜂巢四分(30 g),炒烏扇、柴胡、黃芩、鼠婦蟲、干姜、大黃、桂枝、厚樸、石韋、紫葳、炙阿膠各三分(各22.5 g),瞿麥、桃仁各二分(各15 g),葶藶、半夏、人參各一分(各7.5 g)。

1.1.4實驗試劑和儀器

DMEM細胞培養(yǎng)基(批號:8169175)和細胞培養(yǎng)所添加的胎牛血清(批號:1828728)均購自美國Thermo Scientific公司,CCK-8試劑盒(批號:6972-75-8)購自日本同仁公司?？俁NA提純試劑盒(批號:74104)購自德國Qiagen公司。測序平臺Illumina Hiseq2500購自美國Illumina公司,酶聯(lián)免疫檢測儀(Multiskan FC)購自美國Thermo Scientific公司,恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma)購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1血清制備

鱉甲煎丸含藥血清按參考文獻[5]的方法進行制備。1 g/kg的給藥劑量配制鱉甲煎丸生理鹽水混懸液,給予大鼠灌胃給藥(10 mL/kg),每天2次,連續(xù)3 d,第4天給藥2 h后腹主動脈取血,常溫靜置2 h后離心分離血清,56 ℃滅活30 min,經(jīng)0.45 μm和0.22 μm微孔濾膜過濾除菌,置于-20 ℃下保存。將同等體積鱉甲煎丸懸液替換成生理鹽水,空白血清制備方法和流程與鱉甲煎丸含藥血清制備相同。

1.2.2細胞干預分組和培養(yǎng)

實驗組采用10%鱉甲煎丸含藥血清和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人肝癌細胞株SMMC-7721;對照組采用10%空白血清和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人肝癌細胞株SMMC-7721。培養(yǎng)條件均為5% CO2、37 ℃恒溫條件。

1.2.3人肝癌細胞SMMC-7721的增殖活性檢測

CCK-8法檢測鱉甲煎丸對肝癌細胞的抑制作用。在96孔板中加入約1×104個細胞懸液,每組設(shè)3個復孔,將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h,細胞貼壁后向培養(yǎng)板中加入100 μL制備血清(鱉甲煎丸含藥血清或空白血清)和100 μL胎牛血清。 干預24、48、72 h后,每孔加入20 μL CCK-8液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標儀檢測450 nm處的吸光度(A)值,重復3次。

1.2.4細胞總RNA的提取

將約1×106個細胞懸液接種至培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)過夜待其貼壁,將細胞培養(yǎng)基更換為含10%鱉甲煎丸含藥血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,RNeasy mini Kit試劑盒提取細胞總RNA。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組測序和分析

細胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析由深圳海一時代基因科技有限公司完成。

1.2.6差異表達基因的鑒定和分析

從兩組差異表達基因中篩選出與實驗組可變剪切事件相關(guān)的基因,采用ualcan對其進行肝癌患者生存分析,kmplot進行風險因素分析。

1.2.7GO富集分析和KEGG pathway富集分析

采用David數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析,網(wǎng)頁工具metascape進行KEGG pathway富集分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組細胞增殖活性比較

實驗組細胞的增殖活性較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(F=66.662,P=0.003),見圖1。

圖1 鱉甲煎丸含藥血清對肝癌細胞增殖活性的影響

2.2 兩組可變剪切事件分析

兩組測序后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分別與人基因組進行比對,實驗組中5 736個基因發(fā)生了可變剪切,共20 447個剪切體,對照組中 5 533 個基因發(fā)生可變剪切,共18 955個剪切體。兩組均檢測到7種可變剪切事件類型,對照組以外顯子跳躍(SE)、第1個外顯子可變剪切(AFE)為主,分別為6 348(33.49%)、 6 105(32.21%),其他5種類型占比為1.57%～9.79%。實驗組主要發(fā)生的可變剪切事件類型仍為AFE、SE,分別為6 921個(33.85%)、6 775個(33.13%),其他5種類型比例為1.49%～9.27%,見圖2。

ALE:最后1個外顯子可變剪切;MXE:外顯子互斥;RI:內(nèi)含子保留;A3SS:外顯子3′端的可變剪切;A5SS:外顯子5′的可變剪切。

2.3 兩組發(fā)生可變剪切事件基因和差異表達基因分析

兩組間4 675個基因的可變剪切事件重合。實驗組中有1 061個基因不重合,對照組中有858個基因不重合,96個基因差異表達明顯,且存在多個抗腫瘤相關(guān)基因,分別為ARHGAP8、ATP5L2、BIRC7、CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19、TNRC18、TPT1,見圖3。

圖3 與實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因

2.4 差異表達基因 KEGG pathway富集分析和GO富集分析

GO富集分析顯示,實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因在分子功能(MF)方面,參與了GTPase活性的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、細胞形態(tài)調(diào)節(jié);在細胞組成(CC)方面,組成細胞質(zhì)、外泌體、中心黏附;生物過程(BP)方面,主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、GTPase激活劑活性、肌動蛋白絲結(jié)合,見圖4。KEGG pathway富集分析的前20個結(jié)果顯示,實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因主要在肌動蛋白骨架組織、細胞黏附調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)型胞吐作用等方面富集,見圖5。

圖5 實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因KEGG pathway富集分析

2.5 差異表達基因與肝癌患者的生存分析

ualcan數(shù)據(jù)庫分析顯示,CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19 4個差異表達基因的表達量影響肝癌患者的生存時間(P<0.05),其余基因的高表達和低表達對肝癌患者生存時間無明顯影響(P>0.05)。

2.6 差異表達基因與病毒、酒精所致肝癌患者的生存分析

在不同肝炎病毒感染所致的肝癌中,ARHGAP8、HES5、INPP4B、TPT1起到保護因素的作用,見表1;酒精攝入所致的肝癌中,ATP5L2、HES5、INPP4B、TNRC18、TPT1起到保護因素的作用,見表2。

表1 差異表達基因與肝炎病毒感染所致肝癌患者的風險因素分析

表2 差異表達基因與酒精攝入所致肝癌患者的風險因素分析

3 討 論

目前肝癌是全世界腫瘤所致死亡的第二主要原因,而我國肝癌病例占全球病例總數(shù)的一半以上[5]。流行病學研究表明,我國80%以上肝癌因乙型/丙型肝炎病毒感染和酗酒所致[6]。HCC是最常見的原發(fā)性肝癌,80%的原發(fā)性肝癌病理診斷為HCC癌。因此研究HCC的預防和診治迫在眉睫。

有學者認為鱉甲煎丸具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)人免疫功能、抑制纖維化等作用[3,7]。本研究的前期實驗發(fā)現(xiàn),加入10%鱉甲煎丸含藥血清共同培養(yǎng)的SMMC-7721肝癌細胞增殖受到明顯抑制,特別是培養(yǎng)72 h后。有研究顯示,鱉甲煎丸抑制SMMC-7721肝癌細胞增殖,提高肝癌細胞的凋亡率,其抑制過程涉及許多miRNA、mRNA 和信號通路,其中代謝通路及信號通路中的核心基因PNMT和ST8SIAG是其發(fā)揮作用的重要通路[7]。但腫瘤細胞的增殖、凋亡受多因素的影響,多種細胞因子和信號轉(zhuǎn)導通路參與其中,組成了一個復雜多變的分子生物網(wǎng)絡系統(tǒng)。

可變剪切是轉(zhuǎn)錄后的一種重要調(diào)控機制,可調(diào)節(jié)mRNA亞型的翻譯并誘導蛋白質(zhì)的多樣性,從而擴展基因編碼能力[8]。人類基因組中大約95%的基因經(jīng)歷可變剪切事件[9]。越來越多的研究表明,可變剪切與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、治療、預后相關(guān),如從HCC患者中檢測到的異?？勺兗羟谢?包括p53拮抗蛋白MDM2、E3泛素連接酶、細胞表面黏附鈣黏著17蛋白等被證明是潛在的肝癌致癌基因[9-11]。也有研究表明剪切因子SRSF2在肝癌中頻繁上調(diào),與肝癌患者預后不良有關(guān)[12]。高通量測序技術(shù)的發(fā)展和肝癌樣品RNA序列數(shù)據(jù)的快速積累,為研究HCC全基因組可變剪切模式提供豐富的資源,也為肝癌提供潛在的特異性診斷與治療靶標[13]。

本研究結(jié)果顯示,兩組均檢測到7種可變剪切事件類型,其中SE和AFE發(fā)生數(shù)量最多,且每一種可變剪切事件中,實驗組發(fā)生數(shù)量均大于對照組。這些結(jié)果驗證了國內(nèi)學者認為可變剪切事件與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、治療、預后密切相關(guān)的結(jié)論[9,11]。對差異表達基因進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)這些基因參與了MF、CC等諸多過程,包括GTPase活性的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、組蛋白結(jié)合等;KEGG pathway富集分析結(jié)果進一步提示,實驗組可變剪切事件相關(guān)的差異表達基因與肌動蛋白骨架組織、細胞黏附調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)型胞吐作用密切相關(guān)。說明鱉甲煎丸在肝癌細胞發(fā)生的可變剪切事件涉及多種多樣的生物學過程,其從多方面調(diào)控肝癌細胞的增殖。

在實驗組調(diào)控的可變剪切事件中,鑒定出9個差異表達基因,其中CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19影響肝癌患者的生存時間。CASP9是調(diào)控線粒體凋亡通路中必不可少的關(guān)鍵性分子[14]。有學者研究表明CASP9在HCC中表達明顯下調(diào),其高表達預示著HCC患者預后良好[15]。HES5在HCC中具有抗腫瘤的功能。在小鼠模型中,HES5能抑制MYC依賴的肝癌發(fā)生,而促進AKT依賴的肝癌形成和干細胞特征,而細胞培養(yǎng)的功能分析表明,HES5可降低肝癌細胞的侵襲和增殖[16]。INPP4B在人肝癌中是一種腫瘤抑制基因。高表達INPP4B可以抑制肝癌細胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換過程,此外,INPP4B可抑制肝癌細胞PI3K/AKT信號的激活[17]。SLC6A19作為谷氨酰胺轉(zhuǎn)運體,在癌癥的給藥治療中也發(fā)揮著重要作用[18]。綜合課題組的研究結(jié)果和相關(guān)文獻的報道,推測鱉甲煎丸通過可變剪切事件引起肝癌細胞CASP9、HES5、INPP4B、SLC6A19基因差異表達,進而在抑制肝癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在我國乙型肝炎病毒感染和酒精攝入是肝癌高發(fā)的危險因素之一。在對鱉甲煎丸調(diào)控可變剪切事件中密切相關(guān)的9個基因進行風險因素分析發(fā)現(xiàn),不同肝炎病毒所致的肝癌中,ARHGAP8、HES5、INPP4B、TPT1起保護作用;在酒精攝入所致的肝癌中,ATP5L2、HES5、INPP4B、TNRC18、TPT1起保護作用。鱉甲煎丸對于我國肝癌常見的風險因素具有潛在的調(diào)節(jié)和保護作用。

綜上所述,可變剪切事件可能涉及鱉甲煎丸治療肝癌相關(guān)的基因和主要的生物學過程。因此,進一步挖掘可變剪切事件及其相關(guān)基因在肝癌中扮演的角色,對深入探討鱉甲煎丸抑癌機制和鑒定新的肝癌靶點具有重要的意義。