三聚氰胺對雄性小鼠睪丸組織能量代謝及氧化應激的影響

夏鳳瓊 王明棟

(1.貴州省骨科醫(yī)院檢驗科,貴州 貴陽 550004;2.貴陽市公共衛(wèi)生救治中心檢驗科,貴州 貴陽 550003)

21世紀工業(yè)化迎來前所未有的發(fā)展,但環(huán)境污染及食品污染問題卻嚴重威脅著人們的健康,導致生育能力逐年下降。不孕不育這個問題因此慢慢進入大眾視野,引發(fā)全球關注。在過去的40年里,全球范圍內的男性精液質量逐年下降,導致越來越多的育齡夫婦不能夠自然生育[1],而超過半數(shù)的原因來自于男方[2],中國育齡男性精液質量和生育能力呈現(xiàn)出下降趨勢[3]。2008年的“三鹿奶粉事件”[4-5]讓三聚氰胺進入公眾視野,掀起世界乳制品的巨大波瀾。由此,專家學者對三聚氰胺這種含氮雜環(huán)有機化合物進行了一系列的研究。研究發(fā)現(xiàn),三聚氰胺具有吸入毒性、較低的急性皮膚毒性、眼睛刺激及皮膚刺激[6-8],對腎臟也有一定的毒性作用[9],對雞[10]、鴨[11]、魚[12]、豬[13]的肝臟有一定的毒性作用,甚至能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬神經(jīng)元的凋亡[14]。也有研究[15]顯示,動物長期暴露于三聚氰胺會導致胚胎毒性,還可引起小鼠精子DNA損傷[16]。但是,有關三聚氰胺的雄性小鼠睪丸生精細胞的能量代謝及氧化應激方面的研究還較少。因此本研究以健康雄性昆明種小鼠為研究對象,用不同劑量的三聚氰胺通過灌胃對小鼠進行染毒,以睪丸組織酶活性及氧化應激的檢測來探討三聚氰胺對雄性小鼠能量代謝及氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇6～8周齡及體重25～30 g的健康雄性昆明種小鼠50只。實驗動物均購自于第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學實驗動物中心(許可證號SCXK(渝)2001-0005)。

1.2藥品和主要試劑 三聚氰胺購自美國Sigma 公司,環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,山梨醇脫氫酶(Sorbitol dehydrogenase,SDH)試劑盒及乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)試劑盒購自美國R&D公司,考馬斯亮藍測定試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide Dimutese,SOD)及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3分組及染毒方法 將雄性小鼠隨機分為五組,每組10只,即陰性對照組(生理鹽水),陽性對照組(環(huán)磷酰胺),三聚氰胺低、中、高劑量組。低、中、高劑量組分別按照400 mg/kg、800 mg/kg 、1 600 mg/kg 體重每天定時經(jīng)口灌胃三聚氰胺混懸液1次,陰性對照組按照0.1 mL/10 g體重每天經(jīng)口灌胃生理鹽水1次,陽性對照組按照40 mg/kg體重每天腹腔注射環(huán)磷酰胺1次,各實驗組均連續(xù)給藥5 d。染毒期間小鼠自由飲食飲水。

1.4標本采集方法 頸椎脫臼處死小鼠后立即剪開腹腔,取出雙側睪丸置于-80℃保存用于檢測睪丸組織酶活性。

1.5ELISA法檢測小鼠睪丸勻漿LDH 、SDH的活性 取-80℃保存的睪丸在冰面上剝離被膜,準確稱量,按質量(g)∶體積(mL)比為1∶9滴加生理鹽水進行組織勻漿,制成10%的勻漿液,4℃下高速離心(10 000 prm,離心10 min),取上清。按照LDH及SDH試劑盒說明書進行測定。

1.6睪丸組織勻漿中蛋白質含量、SOD及MDA含量的測定 取一定量的10%睪丸組織勻漿,用生理鹽水按1∶9稀釋成1%的組織勻漿,按說明書進行測定睪丸勻漿中蛋白質濃度、SOD活性及MDA的含量。

2 結 果

2.1三聚氰胺對小鼠睪丸勻漿LDH、SDH活性的影響 隨著染毒劑量的增加,SDH的活性下降,與陰性對照組相比,各劑量組差異均顯著(P<0.05/P<0.01);LDH的活性也下降,與陰性對照組相比,高劑量組差異顯著(P<0.05)。各劑量組SDH、LDH檢測結果與陽性對照組相比差異均不顯著(P>0.05)。見表1。

表1 三聚氰胺對各實驗組小鼠睪丸組織LDH、SDH活性的影響

2.2三聚氰胺對小鼠睪丸組織SOD活性及MDA含量的影響 各染毒組SOD活性下降,與陰性對照組相比,差異均顯著;與陽性對照組相比,差異均不顯著(P>0.05)。三聚氰胺各實驗組MDA含量有升高趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 三聚氰胺對各實驗組小鼠睪丸組織SOD活性、MDA含量的影響

3 討 論

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CP)是目前常用的一種烷化劑類抗腫瘤藥物,臨床常用于各種自身免疫性疾病、惡性腫瘤的化療及類風濕關節(jié)炎的治療,與此同時,CP也可對男性生精功能造成損害[17]。因此,本研究以環(huán)磷酰胺作為陽性對照,與陰性對照組比較,三聚氰胺各劑量組睪丸組織抗氧化能力及能量代謝酶活性均降低,與楊群芳的報到一致[17],表明本研究所建立的動物模型是成功的。

精子在發(fā)生和成熟過程中需要足夠的能量供應。SDH、LDH在維持睪丸組織結構的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。SDH可以將山梨醇轉化為果糖,在精子的糖代謝中很重要;LDH是參與糖酵解的重要酶,催化丙酮酸轉化為乳酸,是參與生精細胞糖代謝的主要酶類[18]。本次實驗中,SDH、LDH的活性均降低,提示三聚氰胺可能引起小鼠睪丸生精細胞能量生成不足,阻礙能量供給,最終可能會導致小鼠生殖能力的下降。SDH、LDH活性降低原因可能有:三聚氰胺直接作用于睪丸組織;產生脂質過氧化作用引起細胞膜損傷,能量代謝酶從胞內流出,導致其活性下降;也可能是三聚氰胺引發(fā)腎損害導致厭食引起小鼠產能不足[19]。

氧化應激在許多外源性化學物質的毒性作用機制中扮演著十分重要的角色。當機體的氧化—抗氧化平衡被打破時便會產生氧化應激。SOD是氧自由基的清除劑,是體內最主要的抗氧化酶之一[20],在維持自由基代謝平衡中起重要作用。如果SOD活性降低,體內過多的自由基積累將影響精子的生成,引起小鼠生殖能力的下降。MDA對細胞具有嚴重的損傷作用,是自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應的主要代謝產物,常被用來間接反應機體自由基代謝的變化及脂質過氧化的標志[21]。本次研究中,三聚氰胺各劑量組及陽性對照組SOD活力相比陰性對照組均降低顯著,且三聚氰胺各劑量組的SOD活力與陽性對照組相比差異無顯著性。說明三聚氰胺可能引起小鼠睪丸的抗氧化能力的降低,干擾小鼠睪丸的氧化─抗氧化系統(tǒng)的平衡。本研究中,各實驗組之間MDA含量差異無統(tǒng)計學意義,并且陽性對照組也未出現(xiàn)相應變化,可能原因有試劑盒保存溫度不當或者檢測方法的局限性。

綜上所述,三聚氰胺對雄性小鼠有一定的生殖毒性作用。本研究所用劑量的三聚氰胺使雄性小鼠睪丸組織能量代謝酶的活性降低,抗氧化能力下降,干擾小鼠睪丸組織能量代謝過程及氧化─抗氧化系統(tǒng)的平衡。