神經干細胞來源外泌體對腦缺血再灌注損傷大鼠星形膠質細胞TGF-β1信號轉導與炎癥因子的影響

陳珊 朱俊德 趙雪 劉若靜 龍婷婷

貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室（貴陽 550025）

腦卒中作為中樞神經系統腦血流循環(huán)障礙性疾病，是世界上公認的第三大致死性疾病［1］。目前臨床常用的溶栓藥物治療僅在腦卒中后最初4～4.5 h 有效［2］，隨著近年來神經干細胞治療的興起，為臨床治療腦卒中這類難治性疾病提供了新的希望。大量證據表明NSCs 通過旁分泌方式釋放外泌體（exosomes，Exos）發(fā)揮著重要的神經保護作用［3］，Exos 具有獨特的結構特征和生物學功能，直徑約30～200 nm。給予嚙齒動物外源神經干細胞來源的外泌體可以維持免疫豁免權，通過蛋白質和遺傳信息交換的方式，促進受體動物免疫系統的調節(jié)、組織損傷的修復、抑制炎癥反應等［4］。轉化生長因子-β1（TGF-β1）可激活星形膠質細胞表面相關受體，影響星形膠質細胞增生過程，反應性星形膠質細胞增生是慢性和廣泛性中樞神經系統獲得性免疫炎癥的顯著特征［5］。目前已知NSCs 來源的外泌體（neural stem cell-derived exosomes，NSC-Exos）在神經系統疾病治療過程中具有保護作用，但其在MCAO損傷大鼠中對星形膠質細胞TGF-β1 信號轉導及相關炎癥因子的影響尚不明確，因此本研究旨在探討這一變化，以期為NSC-Exos 治療缺血性腦卒中提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物清潔級雄性SD 大鼠40 只，體質量250～280 g，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（黔）2018-0001，倫理委員會批準（編號：2200094）。環(huán)境溫度（22±0.5）℃，濕度55%～60%，12 h 周期晝夜更替，大鼠自由攝取食物和水。

1.1.2 主要試劑兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、微管相關蛋白2（MAP-2）抗體，Alexa Fluor 488 標記羊抗兔、Alexa Fluor 555 標記羊抗兔二抗，DAPI 染色液購于美國CST 公司；外泌體紅色熒光標記染料PKH26 購自上海宇玫博生物公司；兔抗大鼠白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）抗體購自美國Peprotech 公司；TGF-β1 抗體，β-actin 抗體，過氧化物酶標記羊抗兔二抗及蛋白裂解液RIPA 購自武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組采用隨機數字表法將40 只SD大鼠分為Sham 組、MCAO 組、磷酸緩沖鹽溶液對照（PBS）組和NSC-Exos 治療組。Sham 組僅分離右側頸部動脈，不予液體注射；MCAO 組行MCAO 模型手術，缺血90 min 后再灌注，不予液體注射；PBS組行MCAO 手術，缺血90 min 后再灌注，大鼠清醒2 h 后，右側側腦室注射10 μL PBS 緩沖液；NSCExos 治療組大鼠行MCAO 手術，缺血90 min 后再灌注，大鼠清醒2 h 后，右側側腦室注射10 μL 含10 μg NSC-Exos 的PBS 混懸液［6-7］。

1.2.2 右側MCAO 模型構建及側腦室注射采用經典線栓法［8］制備MCAO 模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）麻醉大鼠，暴露右側頸總動脈和頸外動脈，結扎頸外動脈，分離迷走神經，在頸總動脈近心端夾閉血管，頸外動脈遠心端剪一小口，將線栓經切口推至頸總動脈，沿頸總動脈、頸內動脈順行向上插入至大腦中動脈，插入深度約（18± 2.0）mm，阻斷90 min 后退出線栓，逐層縫合傷口。參照大鼠腦立體定位圖譜［9］，以前囟為坐標零點，向后囟方向前進0.5 mm，右側旁開1.5 mm 進行標記，顱骨鉆打開標記部位顱骨，進針深度3.5 mm，以1 μL/min速度勻速注射10 μL的PBS緩沖液（PBS 組）或NSC-Exos 溶液（NSC-Exos 組）。

1.2.3 Zea Longa 評分根據神經功能行為學缺陷Zea Longa 評分［8］判斷術后大鼠是否建立MCAO模型。評判標準：無神經功能缺損癥狀，0 分；健側前爪不能完全伸展，1 分；出現偏癱，行走時向健側旋轉或轉圈，2 分；輕推大鼠或大鼠行走時向偏癱側倒下，3 分；無自主活動或喪失意識，4 分。將評分1～3 分的大鼠確定為模型成功鼠。

1.2.4 腦梗死體積測定腦組織以2 mm 為厚度制備冠狀切片，加入2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液37 ℃避光孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定30 min 后拍照觀察。應用Image Pro Plus 6.0 軟件分析，梗死面積=對側半球面積-患側正常腦組織面積；相對梗死體積=微梗死體積/總體積=（S1+S2+…SN）*H/（S1總+S2總+…SN總）*H*100%，SN表示每片腦片的梗死面積，H 為腦片厚度。

1.2.5 Nissl 染色石蠟切片脫蠟至水，按照試劑盒說明書步驟進行染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。高倍鏡（× 400）下隨機觀察海馬CA3 區(qū)域不重疊的3 個視野，計算神經元數目，神經元存活率=存活神經元數目/總細胞數×100%。

1.2.6 GFAP 免疫熒光化學染色石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，枸櫞酸鈉緩沖液水浴加熱修復抗原，5% BSA 室溫孵育2 h，滴加兔抗大鼠GFAP（1∶250，批號80788）抗體4 ℃過夜孵育，次日加入Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔二抗（1∶500，批號4412）室溫孵育2 h，DAPI 染核20 min，封片固定。于高倍鏡（× 400）視野下在海馬CA3 區(qū)域，每張切片隨機取3 個視野計數，陽性細胞表達率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.7 PKH26探針標記及MAP-2共定位檢測按照PHK26 試劑盒說明書配制染色工作液（批號UR52302），200 μg 外泌體加入50 μL 工作液充分混勻，加入10 mL無菌PBS緩沖液，4 ℃，120 000×g離心70 min，無菌PBS 重懸沉淀即得PKH26 探針標記的外泌體混懸液。MAP-2 免疫熒光化學染色步驟所需一抗為兔抗大鼠MAP-2（1∶250，批號8707）抗體，二抗為Alexa Fluor 555 標記的羊抗兔二抗（1∶500，批號4413）。

1.2.8 TUNEL與MAP-2免疫熒光化學染色按照TUNEL 試劑盒（批號KGA7071-1）說明書操作，最后用DAPI 染液染核10 min，鏡下觀察。用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行圖像分析，高倍鏡（× 400）下每張切片在海馬CA3 區(qū)域隨機取3 個視野，分別計數MAP-2 和TUNEL 雙陽性細胞數和總細胞數。凋亡指數=雙陽性細胞數/總細胞數×100%，3 個視野的細胞凋亡指數平均值代表每只大鼠的神經元凋亡指數。

1.2.9 Western blot右側海馬組織加入RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，BCA方法進行蛋白定量，電泳、轉膜，5%BSA 封閉。加入兔抗大鼠IL-6（1∶1 000，批號500-P73）、IL-1β（1∶1 000，批號500-P80）、TGF-β1（1∶1 000，批號BA0290）、β-actin（1∶5 000，批號BM3873）抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入過氧化物酶標記羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000，批號BA1003），室溫孵育2.5 h，顯色并拍照，Image Pro Plus 6.0 軟件計算條帶相對灰度值。

1.3 統計學方法計量資料采用均數±標準差表示，符合正態(tài)分布的數據，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊時，采用LSD 法進行多重比較；方差不齊則采用Dunnett T3 法進行檢驗。運用SNK 檢驗評估統計學顯著性，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Zea Longa 評分結果Sham 組大鼠未見異常神經功能缺損；與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組大鼠缺血再灌注后Zea Longa 評分增高（P＜0.05），大鼠出現偏癱癥狀，行走時向健側傾倒或轉圈；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos 組大鼠評分顯著降低（P＜0.05）；MCAO 組與PBS 組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠Zea Longa 評分、腦組織相對梗死體積和神經元存活率比較Tab.1 Comparison of Zea Longa score,relative infarct volume of brain tissue and neuronal cell survival in each group of rats ±s

表1 各組大鼠Zea Longa 評分、腦組織相對梗死體積和神經元存活率比較Tab.1 Comparison of Zea Longa score,relative infarct volume of brain tissue and neuronal cell survival in each group of rats ±s

組別Sham組MCAO組PBS組NSC-Exos組F值P值Zea Longa評分0.00±0.00 2.60±0.52 2.70±0.48 1.80±0.42 92.210＜0.001相對梗死體積（%）0.00±0.00 48.67±4.04 48.88±3.32 33.61±4.07 144.600＜0.001神經元存活率（%）89.06±4.60 17.94±3.05 18.70±3.62 36.87±6.59 154.300＜0.001

2.2 腦組織相對梗死體積結果TTC 染色后血流正常供應區(qū)域腦組織呈現粉紅色，缺血梗死灶為白色（圖1）。與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組大鼠腦組織出現明顯白色梗死灶，相對梗死體積增大（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos組大鼠相對梗死體積顯著減少（P＜0.05）；MCAO組與PBS 組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 大鼠腦組織TTC 染色結果Fig.1 TTC staining results of brain tissue in rats

2.3 Nissl 染色結果Sham 組大鼠海馬CA3 區(qū)域細胞排列規(guī)整，形態(tài)飽滿圓潤，尼氏小體深染分布均勻；與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組可見大量壞死神經元（P＜0.05），細胞形態(tài)不規(guī)則，尼氏小體淡染甚至消失；與MCAO 組和PBS 組大鼠相比，NSC-Exos 組可見少量壞死神經元，細胞形態(tài)較圓潤飽滿，尼氏小體分布較均勻（P＜0.05）；MCAO 組與PBS 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

圖2 大鼠海馬CA3 區(qū)域Nissl 染色結果Fig.2 Nissl staining results of CA3 region in hippocampus of rats

2.4 GFAP 免疫熒光化學染色結果Sham 組大鼠海馬CA3 區(qū)域GFAP 陽性細胞伸出細長突起，向四周擴散，發(fā)綠色熒光（圖3）；與Sham 組相比，MCAO組和PBS 組大鼠GFAP 強陽性表達（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos 組大鼠GFAP 陽性細胞表達率顯著下降（P＜0.05）；MCAO 組與PBS組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 海馬CA3 區(qū)GFAP 免疫熒光化學染色結果Fig.3 GFAP immunofluorescence chemical staining results in CA3 region of hippocampus

表2 各組大鼠海馬CA3 區(qū)GFAP 陽性細胞表達率、MAP-2陽性細胞凋亡指數比較Tab.2 Comparison of GFAP positive cell expression rate and MAP-2 positive cell apoptosis index in hippocampal CA3 region of rats in each group ±s，%

表2 各組大鼠海馬CA3 區(qū)GFAP 陽性細胞表達率、MAP-2陽性細胞凋亡指數比較Tab.2 Comparison of GFAP positive cell expression rate and MAP-2 positive cell apoptosis index in hippocampal CA3 region of rats in each group ±s，%

組別Sham 組MCAO 組PBS 組NSC-Exos 組F 值P 值GFAP 陽性表達率5.09±1.26 20.85±0.44 20.40±1.56 16.50±0.42 147.800＜0.001 MAP-2 凋亡指數5.04±0.20 45.41±3.21 43.78±4.92 19.58±0.49 131.900＜0.001

2.5 神經元細胞成功攝取NSC-ExosPKH26 熒光探針標記的NSC-Exos（紅色）定位于MAP-2 陽性神經元（粉色）的胞漿中，且有少量Exos 與細胞核存在重疊現象，MAP-2 是神經元特異性的細胞骨架蛋白，能夠作為神經元細胞表型標記物，結果表明經側腦室注射的NSC-Exos 可被神經元細胞成功攝取。見圖4。

圖4 PKH26 探針與MAP-2 陽性神經元細胞在CA3 區(qū)域共定位表達Fig.4 Co-localized expression results of PKH26 and MAP-2 positive neuronal cells in CA3 region

2.6 海馬CA3 區(qū)域神經細胞凋亡結果Sham 組大鼠海馬CA3 區(qū)少量表達MAP-2 和TUNEL 共定位陽性細胞（圖5）。與Sham 組相比，MCAO 組和PBS組CA3 區(qū)域MAP-2 與TUNEL 陽性共定位細胞增多（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos組共定位陽性細胞表達率顯著下降（P＜0.05）；MCAO 組與PBS 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.7 海馬組織IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白的變化與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組海馬組織中促炎因子IL-6、IL-1β表達升高，抗炎因子TGF-β1表達低下（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos 組海馬組織中IL-6、IL-1β 蛋白表達降低，TGF-β1 蛋白表達增強（P＜0.05）。MCAO 組與PBS組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6、表3。

圖6 海馬組織中IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白表達Fig.6 Expression of protein IL-6，IL-1β and TGF-β1 in hippocampus

表3 各組海馬組織中IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白表達的比較Tab.3 Comparison of expression of IL-6，IL-1β and TGF-β1 in hippocampal tissue of each group ±s

表3 各組海馬組織中IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白表達的比較Tab.3 Comparison of expression of IL-6，IL-1β and TGF-β1 in hippocampal tissue of each group ±s

組別Sham 組MCAO 組PBS 組NSC-Exos 組F 值P 值IL-6 1.00±0.17 2.24±0.15 2.32±0.01 1.70±0.06 80.590＜0.001 IL-1β 1.00±0.21 7.99±0.32 8.33±1.43 4.68±0.24 62.490＜0.001 TGF-β1 1.00±0.03 0.74±0.03 0.70±0.04 0.93±0.02 67.120＜0.001

3 討論

Exos 是活細胞分泌到細胞外液中的囊泡樣物質，體積微小，粒徑達到納米級別［10］，已被證實在多種疾病損傷中發(fā)揮修復作用。研究報道Exos 可被親脂性熒光標記染料PKH26 標記［11］，并且穩(wěn)定插入受體細胞膜脂質區(qū)域，對靶細胞的存活率和其他生理特性無明顯影響。因此，本研究采用大鼠MCAO 模型復制臨床缺血性腦卒中疾病，將NSC-Exos 標記PKH26 探針后，注射到MCAO 大鼠側腦室內，結果顯示大鼠神經功能行為學缺損癥狀顯著減輕，且逆轉了損傷側CA3 區(qū)域神經細胞的病理形態(tài)學損傷。鏡下觀察到PKH26 探針與MAP-2 陽性細胞在大鼠海馬CA3 區(qū)域共定位表達，表明外泌體可成功被神經細胞攝取，實驗所得結果與其他研究［12］一致。

在星形膠質細胞TGF-β 信號通路的研究中，星形膠質細胞被認為是中樞神經系統感染中神經炎癥的關鍵調節(jié)因子，其在腦梗死區(qū)邊緣延伸突起包圍正在發(fā)展的梗塞區(qū)，從而抑制神經元的可塑性以及腦梗死區(qū)新生軸突和血管的形成［13］。因此，星形膠質細胞增生可能對卒中恢復產生不利影響［14］。本研究中給予NSC-Exos 治療后，損傷大鼠海馬CA3 區(qū)域的GFAP 陽性細胞表達率顯著降低，而GFAP 上調是星形膠質細胞激活的標志，因此實驗結果提示NSC-Exos 可抑制星形膠質細胞增生。

星形膠質細胞長時間激活會導致神經細胞凋亡和系列炎性因子的產生［15］，例如IL-6、IL-1β 和TGF-β1 等。IL-6、IL-1β 是與缺血性腦卒中病情加重相關的兩種重要前炎癥反應細胞因子，也是多個損傷通路的下游信號分子［16］，研究表明［17］外泌體能明顯抑制Caspase-1 的激活，從而阻止GSDMD的切割和膜GSMDM 孔的形成，通過抑制神經細胞焦亡引起的炎癥反應，減少IL-6、IL-1β 等分泌，有效促進神經功能缺損的恢復，這與本研究中NSCExos干預后，MCAO損傷大鼠右側海馬組織中IL-6、IL-1β 的表達明顯降低有異曲同工之處。TGF-β1是典型的損傷誘導亞型，可調控機體有關生長、增殖、分化和凋亡基因的表達，在腦組織內主要由星形膠質細胞分泌，因此星形膠質細胞的含量變化可影響TGF-β1 的表達，TGF-β1 又可反過來影響星形膠質細胞增生，進而干預神經膠質瘢痕的形成過程［18］。此外，TGF-β1 的作用依賴于細胞類型，它還可以進一步干預神經細胞凋亡的調控程序［19］，由于不同因素的聯合作用使得其生物學效應更加復雜。本研究發(fā)現，NSC-Exos 組大鼠TGFβ1 蛋白水平表達明顯升高、MAP-2 陽性神經元細胞凋亡率顯著降低，以上實驗結果與其他學者報道［20］的人NSCs 來源的外泌體通過抑制神經元的凋亡，增強細胞活性，從而對受損細胞發(fā)揮修復作用的研究結果類似。

綜上所述，NSC-Exos 具有減輕MCAO 損傷大鼠神經功能行為學缺損癥狀，發(fā)揮神經修復的作用，其機制可能與NSC-Exos 促進TGF-β1 高表達，抑制星形膠質細胞增生，進而影響炎癥因子IL-6、IL-1β釋放及細胞凋亡有關。實驗尚存在不足之處：（1）未設置NSC-Exos 注射濃度梯度，實驗選取的劑量濃度僅依靠文獻報道的劑量進行實驗；（2）僅對Exos 整體干預效果做出檢測，具體修復靶點和信號通路尚需進一步深挖。