貓角膜緣干細胞不同采集、分離與培養(yǎng)鑒定方法的對比研究

胥輝豪,馮雪倩,樸雪玲,慎曉軍,鄭小波,楊 恒,林珈好,金藝鵬,林德貴

(1.西南大學動物醫(yī)學院,重慶 402460;2.西南大學發(fā)光分析與分子傳感教育部重點實驗室,重慶 400700;3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 100193)

角膜具有折射與透射性,同時保護眼內(nèi)結(jié)構(gòu)免受外界因素傷害等生理作用,對維持正常視力至關重要。角膜上皮層位于角膜最外層,是眼表的第一道生理組織屏障,也是維持角膜透明度的重要結(jié)構(gòu)[1]。角膜緣干細胞(limbal stem cells, LSCs)是角膜上皮細胞的再生來源,各種病因造成的LSCs缺失將降低角膜上皮的自我更新能力,從而破壞角膜完整性或造成角膜潰瘍經(jīng)久不愈,進而致使角膜血管化、角膜結(jié)膜化、角膜瘢痕化、角膜組織壞死以及不同程度炎性反應,最終可能發(fā)展為角膜溶解和角膜穿孔等嚴重病理變化[2-3]。因此,功能正常的LSCs對于修復角膜損傷與維持角膜透明度至關重要[4]。

貓的角膜疾病不完全等同于犬或人類,獸醫(yī)臨床中某些特定的角膜疾病僅限于貓,例如壞死性角膜炎[5-6]、角膜上皮糜爛[7]等。隨著伴侶貓的數(shù)量日益增多且角膜疾病高發(fā),而常規(guī)的手術治療手段存在潛在麻醉風險、技術材料要求高、術后并發(fā)癥較多等局限性[5,7-10]。因此,針對貓角膜疾病治療的研究應當另辟蹊徑。近年來,LSCs移植技術治療角膜疾病被認為具有巨大前景[11-12]。目前,人醫(yī)臨床上已嘗試采用體外培養(yǎng)的自體或異體LSCs配合移植技術治療角膜上皮經(jīng)久不愈以及LSCs嚴重缺損所引發(fā)的各種角膜疾病,并已取得一定成效[13-14]。這為LSCs移植治療貓角膜疾病提供了新思路以及理論依據(jù),但目前獸醫(yī)臨床研究中尚未有針對貓角膜緣干細胞(feline limbal stem cells,FLSCs)體外培養(yǎng)的系統(tǒng)方法。因此,本研究通過比較不同分離與培養(yǎng)方法對FLSCs生長情況的影響,以期篩選出最適的分離、培養(yǎng)體系,為進一步研究貓相關角膜疾病的發(fā)病機制以及將其臨床用于相關角膜疾病的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

健康雌性本地實驗貓,4月齡,由西南大學實驗動物房提供。異氟烷(河北九派制藥有限公司),鼠尾膠原蛋白I型、三抗(青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B)、人重組EGF、人重組胰島素(Solarbio公司),中性蛋白酶Ⅱ、0.25%胰蛋白酶/1 mmol·L-1EDTA溶液、胎牛血清、DMEM、F12、血清替代物(KSR)、非必需氨基酸、堿性成纖維細胞生長因子、白血病抑制因子(美國Gibco公司),抗小鼠ABCG2蛋白(Invitrogen公司),抗鼠波形蛋白單抗(GeneTex公司),FITC—羊抗小鼠IgG二抗(Proteintech公司)。角膜板層隧道刀、角膜側(cè)切口刀(美國Sharpoint公司);角膜剪、顯微鑷(有齒/無齒):上海金鐘公司;百級凈化手術室(西南大學動物醫(yī)學院),GS-2020手術顯微鏡(德國目樂公司),37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo Scientific公司),酶標儀(美國佰騰公司),熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司),4、-20、-80 ℃冰箱(中國青島海爾公司)。

1.2 體外構(gòu)建FLSCs生長三維環(huán)境

在冰浴條件下,將200 μL鼠尾膠原蛋白I型(5 mg·mL-1)加至1.5 mL滅菌離心管中,再往離心管中加入690 μL滅菌超純水,混勻。然后加入12 μL 0.1 mol·L-1NaOH,立刻混勻。再加入100 μL DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基(3∶1)混合組成的基礎培養(yǎng)基(BM培養(yǎng)液),混勻后,立即加到96孔細胞培養(yǎng)板中,每孔10 μL。然后將包被好的培養(yǎng)板在室溫靜置20 min,待膠凝固后,移至培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.3 貓角膜緣組織取材

所有手術操作均在百級凈化手術室內(nèi)進行。對試驗貓進行吸入麻醉后,仰臥保定,剃除術眼周圍毛發(fā),使用碘伏充分消毒眼周皮膚。鋪無菌手術洞巾,放置開瞼器,使用聚維酮碘(900 mg·L-1)術野消毒液充分消毒眼表,無菌PBS液沖洗結(jié)膜囊3 次,在手術顯微鏡下(10×)取樣。以頭側(cè)12:00方向角膜緣為取材點,在角膜緣處剪開球結(jié)膜,使用隧道刀分離角膜緣處上皮與前基質(zhì)層,隨后使用角膜剪獲取角膜緣約1 mm×6 mm×0.2 mm的灰白色組織(利用顯微鏡自帶刻度尺測量)(圖1),裝入含 D-Hanks液(含1%三抗)的EP管中,浸泡持續(xù)30 min。

A.分離結(jié)膜并制作角膜緣切口;B.分離角膜緣處上皮與基質(zhì)層;C.獲取角膜緣組織A. Separate conjunctiva and make limbal incision; B. Separation of epithelial and stromal layers at the limbus; C. Obtain limbal tissue圖1 手術顯微鏡下采集貓角膜緣組織Fig.1 Collecting cat limbal tissue under operating microscope

1.4 原代FLSCs分離

原代FLSCs分離培養(yǎng)方法分為3組:A組采用組織貼壁法(T法),B組采用混合酶消化法(N法),C組采用混合酶消化法聯(lián)合組織貼壁法(NT法)。A組在無菌條件下將角膜緣組織剪成0.2 mm3大小,直接貼附于預先用添加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B的BM培養(yǎng)基濕潤過的的25 mm2有孔細胞瓶中,于CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)6 h后加入4 mL添加10% FBS、1%三抗的BM培養(yǎng)基,每2 d換液1次。待組織塊周邊爬出游離細胞后取出組織塊。B組將角膜緣組織與2.0 units·mL-1的中性蛋白酶Ⅱ在37 ℃溫育2 h,棄液,用PBS洗2～3次;用0.25%胰蛋白酶/1 mmol·L-1EDTA溶液37 ℃處理消化后細胞20 min,產(chǎn)生單細胞懸浮液,移除角膜緣組織,添加培養(yǎng)液終止酶活性,1 500 rpm離心10 min,棄上清;加入1 mL培養(yǎng)液輕吹混勻,轉(zhuǎn)移至25 mm2細胞瓶中補培養(yǎng)液至5 mL進行培養(yǎng),每2 d換液1次。C組使用B組酶消化角膜緣組織后,不移除角膜緣組織,加入添加10% FBS、1%三抗的BM培養(yǎng)基后培養(yǎng),每2 d換液1次。每日使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài),并拍照記錄。

1.5 角膜緣干細胞鑒定

對3種方法分離的角膜緣細胞進行細胞免疫熒光鑒定。取處于對數(shù)生長期的細胞制成細胞懸液,以3×105·mL-1的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中,待細胞在孔中長滿單層后,使用免疫熒光細胞化學法檢測細胞中ABCG2標志蛋白的表達情況。

1.6 FLSCs培養(yǎng)分析

將分離的FLSCs以1×104個接種到鼠尾膠原蛋白I型凝膠包被的96孔細胞培養(yǎng)板。細胞在3種不同條件下培養(yǎng): 對照組(BC組:BM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B);含血清培養(yǎng)組(DLM組:BM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B +20 ng·mL-1人重組EGF+10 μg·mL-1人重組胰島素);無血清培養(yǎng)組(SCM組:BM+10%血清替代物(KSR)+1% 非必需氨基酸+10 ng·mL-1堿性成纖維細胞生長因子+10 ng·mL-1白血病抑制因子+1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素-B )。連續(xù)7 d內(nèi)每24 h使用CCK-8法進行細胞計數(shù),繪制生長曲線,分析FLSCs最適培養(yǎng)基。

1.7 細胞屬性鑒定

使用篩選出的最佳分離FLSCs的方法和最適培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)FLSCs,對其進行形態(tài)學觀察、細胞增殖能力測定、以及細胞屬性的鑒定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 原代FLSCs分離方法對比結(jié)果

細胞形態(tài)學顯示,3種分離方法均可分離出呈梭形的干細胞形態(tài)的細胞,但分離的效率存在差異(圖2)。由圖2可見,T法干細胞形態(tài)的細胞生長時間較長,第1天貼壁細胞極少,第10天細胞生長率明顯低于N法和NT法,第10天后細胞生長速度加快,第17天細胞尚未長滿單層。N法第1天貼壁的梭形細胞比T法多,但有其他形態(tài)的雜細胞混合生長,不易純化分離,第7天后細胞生長速度加快,第17天后混合細胞長滿單層。而NT法第1天貼壁的干細胞形態(tài)的細胞較其他兩組多,細胞從角膜緣組織游出后,成島嶼狀生長,其他形態(tài)的雜細胞較少,第5天后明顯可見干細胞形態(tài)的細胞生長速度加快,第11天長滿單層。對比3種分離方法,明顯觀察到NT法中具有干細胞形態(tài)的細胞數(shù)量多于其他兩組,且其他形態(tài)的雜細胞較少;此外,NT法中干細胞形態(tài)的細胞分離速度最快,分離效果最好。

2.2 干細胞標記蛋白免疫熒光鑒定

三種消化法所分離的細胞中ABCG2標記蛋白均有表達,結(jié)果如圖3所示,NT法細胞中ABCG2蛋白表達最強,而T法中表達最弱。表明3種分離方法均可成功分離出FLSCs,但NT法分離的FLSCs最多。結(jié)果表明,在手術顯微鏡下微創(chuàng)分離與采集的活體貓角膜緣組織非常適用于體外培養(yǎng)FLSCs。通過細胞形態(tài)學和干細胞標記蛋白鑒定顯示,混合酶消化法聯(lián)合組織貼壁法(NT法)最適于分離FLSCs。

2.3 不同培養(yǎng)基中FLSCs生長分析結(jié)果

根據(jù)方差分析結(jié)果所示(表1),與其他兩組相比,DLM組在培養(yǎng)第3天時細胞增殖速度顯著加快(P<0.05),從培養(yǎng)第4天起,DLM組細胞增殖速度與其他兩組差異極顯著(P<0.01)。與BC組相比,SCM組培養(yǎng)第4天時細胞增殖速度相對更快,差異顯著(P<0.05),培養(yǎng)第5天時,差異極顯著(P<0.01)。細胞生長曲線顯示(圖4),FLSCs在3種培養(yǎng)基中均可生長增殖,但增殖速度存在差異,DLM組增殖速度明顯快于其他兩組。由此可知,在本研究篩選的3種培養(yǎng)基中,DLM培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)FLSCs的培養(yǎng)基,SCM培養(yǎng)基次之。

表1 FLSCs在不同培養(yǎng)基中生長的每日OD450 nm值Table 1 Daily OD450 nm values of FLSCs grown in different media

*. P<0.05; **. P<0.01圖4 FLSCs在不同培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.4 Growth curve of FLSCs in different culture media

2.4 細胞屬性鑒定

2.4.1 FLSCs生長過程中形態(tài)學觀察結(jié)果 如圖5所示,倒置顯微鏡下可見細胞從組織塊中游離出來,形成散在的單個細胞;72 h后,可見細胞開始聚集生長;120 h后,細胞數(shù)量明顯增多,開始進入對數(shù)生長期,細胞間間隙變窄;216 h后,貼壁細胞達到80%左右匯合;288 h后,貼壁細胞基本匯合形成細胞單層,細胞間排列緊密。鏡下可見凋亡細胞少,細胞形態(tài)清晰、呈梭形、胞質(zhì)豐富、核呈圓形、細胞核位于細胞中央,傳至7代細胞生長狀態(tài)仍然穩(wěn)定,細胞形態(tài)保持一致的長梭形,細胞核核質(zhì)明顯,邊緣清晰。

A.接種培養(yǎng)板24 h后的FLSCs;B.接種培養(yǎng)板72 h后的FLSCs;C.接種培養(yǎng)板120 h后的FLSCs;D.接種培養(yǎng)板216 h后的FLSCs;E接種培養(yǎng)板288 h后的FLSCsA. FLSCs after inoculated on culture plate for 24 h; B. FLSCs after inoculated on culture plate for 72 h; C. FLSCs after inoculated on culture plate for 120 h; D. FLSCs after inoculated on culture plate for 216 h; E. FLSCs after inoculated on culture plate for 288 h圖5 FLSCs生長狀態(tài)觀察(40×,標尺=50 μm)Fig.5 Observation of the growth status of FLSCs (40×, bar=50 μm)

2.4.2 FLSCs增殖生長曲線 FLSCs增殖情況見表2、表3、圖6和表4。細胞生長曲線呈“S”型,經(jīng)歷了經(jīng)典細胞生長曲線的遲緩期、對數(shù)生長期、平穩(wěn)期和衰亡期4個生長時期,細胞在貼壁生長的前72小時處于遲緩期,第72～216小時處于對數(shù)生長期,第216～264小時則基本處于平穩(wěn)期,第264小時開始細胞進入衰亡期。細胞群體倍增時間to=tlg2/1 g(Nt/No),其中,No為接種細胞數(shù),Nt為時間t后的細胞數(shù),由此計算FLSCs群體倍增時間為38.9 h,平均最大增殖濃度為5.66×105cells·mL-1。

表2 FLSCs生長曲線測定結(jié)果Table 2 Results of growth curve measurement of FLSCs

表3 FLSCs倍增時間測定結(jié)果Table 3 Measurement results of doubling time of FLSCs

表4 FLSCs生長曲線各時期的時間分布Table 4 Time distribution of feline corneal limbal stem cell growth curve in each period d

圖6 第3代FLSCs生長曲線Fig.6 Growth curve of the third-generation FLSCs

2.4.3 波形蛋白、p63、CK3和CK12表達檢測 本試驗選取LSCs的陽性標志物p63、波形蛋白和上皮分化標記物CK3、CK12對培養(yǎng)第3、4、5代FLSCs進行定性分析。結(jié)果可見,細胞中波形蛋白和p63均呈強陽性表達,而上皮分化標記物CK3和CK12則不表達(圖7)。

圖7 免疫熒光技術檢測波形蛋白 (A)、p63 (B)、CK3 (C)和CK12 (D)表達情況 (標尺=50 μm)Fig.7 Expression of vimentin (A), p63 (B), CK3 (C) and CK12 (D) detected by immunofluorescence technique (bar=50 μm)

3 討 論

近年來,對干細胞的研究是再生醫(yī)學最重要的進展之一。干細胞因具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、多向分化潛能、促進損傷修復等優(yōu)點,被廣泛用于各類疾病治療研究中[15]。角膜盲作為高發(fā)的眼表疾病備受人們關注,而LSCs移植的臨床應用為該類疾病的治療提供了全新的思路。LSCs不僅能為角膜上皮的體外重建提供足夠數(shù)量的種子細胞,且體外培養(yǎng)的LSCs還可失去部分抗原性,更利于臨床移植。近年來,利用LSCs做為種子細胞體外構(gòu)建角膜上皮的治療方法已在人類眼科學中初見成效[16]。鑒于角膜疾病同樣作為貓的高發(fā)眼科疾病,而傳統(tǒng)的治療方法存在效果不佳、費用昂貴等局限性,因此嘗試研究LSCs移植治療方法極具臨床意義。

角膜緣上皮由三層細胞組成:淺表非角化分層鱗狀細胞、與表層平行的中間翼狀細胞和垂直于表層的基底細胞[17]。LSCs位于角膜緣POV區(qū)(palisades of vogt)。LSCs體外分離培養(yǎng)關鍵的第一步在于成功分離角膜緣基底層和角膜緣內(nèi)皮層,并盡可能多地獲取LSCs。角膜緣區(qū)域結(jié)構(gòu)較為復雜,其中包括角膜、結(jié)膜、鞏膜等組織,因此造成取樣存在一定難度。為保證LSCs的高效分離及避免污染問題,本研究采取工作在百級凈化手術室內(nèi)完成,使用呼吸麻醉方式,利用眼科顯微鏡及眼科手術器械對活體試驗貓進行角膜緣取材,這在最大程度上減少了細胞污染的可能性并可精準定位與分離組織。在分離角膜緣組織時,本研究保留了部分黑色素細胞層組織。有研究表明,角膜緣的黑色素細胞有助于細胞的增殖和保持未分化的狀態(tài)[18]。本研究同時觀察到,取樣位點的缺損可在術后3～5 d內(nèi)完全修復,這表明活體角膜緣取樣對貓眼損傷極小,同時也提示貓自體角膜緣干細胞移植治療具有潛在的可能性。

LSCs的體外培養(yǎng)主要分為組織塊貼壁法和酶消化法。前者步驟簡單、成功率高、污染小、可保持細胞原有形態(tài)與維持角膜緣干細胞的功能[19],但操作要求較高,細胞生長期較長;酶消化法雖可獲得大量細胞,但操作繁瑣、需要試劑多且昂貴,對細胞損傷較大。隨著技術的進步,許多學者不斷改進分離角膜緣干細胞的方法[20-21]。鑒于尚未有FLSCs的分離方法報道,因此本研究對比了組織塊貼壁法、混合酶消化法以及混合酶消化法聯(lián)合組織貼壁法分離FLSCs的效果,以篩選最適用于FLSCs的原代分離方法。結(jié)果表明,酶消化法聯(lián)合組織貼壁法中干細胞形態(tài)的細胞分離速度最快,其他形態(tài)的細胞少,細胞增殖活性較高。采用顯微手術分離角膜緣組織能更準確剝離角膜基質(zhì)層和內(nèi)皮層,從而使組織塊貼壁法游離出雜細胞較少的FLSCs,但組織塊間細胞連接緊密,FLSCs游離出組織所需時間較長,且若FLSCs起始分離基數(shù)較少則易出現(xiàn)生長抑制的情況,這將不利于細胞體外快速擴增。而混合酶消化法,首先通過中性蛋白酶DispaseⅡ?qū)悄ぞ壣掀优c角膜緣基質(zhì)層結(jié)構(gòu)進行酶解,隨后胰酶-EDTA消化FLSCs,兩者配合,既減輕了對細胞膜的損傷,又分離了大量細胞,且盡可能地降低了雜細胞的含量,最終提高了FLSCs的分離效率,而角膜緣組織貼壁培養(yǎng)又增加短時間內(nèi)FLSCs的增殖數(shù)量,使FLSCs更早進入對數(shù)生長期。

離體的LSCs在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等二維環(huán)境中生長,常發(fā)生與細胞在體內(nèi)時不同的組織結(jié)構(gòu)改變、生物化學信息以及細胞之間相互作用的信號改變或丟失,從而無法反映出細胞在體時的正常功能[22]。相比之下,細胞在三維載體支架中的生長持續(xù)時間更長,也更能保持干細胞特性;同時三維載體培養(yǎng)可模擬體內(nèi)的生長因子作用、電信號傳輸及細胞外基質(zhì)介導的機械傳導等,上述微環(huán)境在細胞分化及維持正常生理生化過程中均發(fā)揮極其重要的作用[23]。膠原凝膠是一種可使LSCs體外生長狀態(tài)接近體內(nèi)生長狀態(tài)的安全、無病毒污染且可降解的三維細胞培養(yǎng)載體。鑒于此,本研究在細胞培養(yǎng)之前,選用對96孔細胞板包被鼠尾膠原蛋白I型凝膠以構(gòu)建FLSCs生長的三維載體,在DMEM/F12(3∶1)培養(yǎng)基(BM培養(yǎng)基)基礎上,對比了添加10%FBS、1%三抗的BM培養(yǎng)基(BC);添加10%FBS、1%三抗、20 ng·mL-1人重組EGF以及10 μg·mL-1人重組胰島素的BM培養(yǎng)基(DLM);添加1%三抗、10%血清替代物(KSR)、1% 非必需氨基酸、10 ng·mL-1堿性成纖維細胞生長因子和10 ng·mL-1白血病抑制因子的無血清培養(yǎng)基(SCM)3種不同的完全培養(yǎng)基,結(jié)果顯示,3種培養(yǎng)基均可培養(yǎng)FLSCs,但細胞在DLM中增殖速度最快,細胞峰值到達時間更短,10～11 d后長成細胞單層,而細胞在基礎培養(yǎng)基BC中增殖速度最慢。本研究初步認為血清和細胞生長因子的疊加使用以及血清替代物和細胞生長因子比單純使用血清對角膜緣干細胞促生長增殖的效果好,且血清和細胞生長因子的疊加使用對FLSCs的促生長效果更好。人重組EGF、人重組胰島素、bFGF、LIF 4種細胞生長因子均可促進FLSCs增殖和保持干細胞特性。其機制可能是bFGF可調(diào)節(jié)細胞的生長、分裂、增殖、分化、形態(tài)結(jié)構(gòu)及再生等特性;LIF可通過高效抑制干細胞的自發(fā)分化維持干細胞多潛能的表型;而bFGF與LIF配合可促進FLSCs增殖分裂且不分化。EGF通過廣泛的生物學效應,促進細胞生長繁殖、加速細胞新陳代謝;人重組胰島素是無血清哺乳動物細胞培養(yǎng)基中的普遍添加物質(zhì),其通過促進糖和氨基酸轉(zhuǎn)運,提高合成代謝降低分解代謝,從而刺激細胞生長。血清和血清替代物與細胞生長因子之間如何相互作用促進FLSCs增殖的機制還有待進一步研究。

ABCG2作為ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的成員,在干細胞中廣泛表達,研究發(fā)現(xiàn)其具有側(cè)群表型[24],被認為是干細胞的通用標記[25]。ABCG2在角膜緣干細胞[26-27]、造血干細胞[28]、胚胎干細胞[29]、神經(jīng)干細胞[30]等多種干細胞中廣泛表達。因此,本研究首先使用ABCG2對分離的細胞進行了干細胞鑒定,結(jié)果顯示,3種方法分離的干細胞形態(tài)的細胞ABCG2蛋白均為陽性表達,為后續(xù)研究奠定了基礎。

p63是一種核轉(zhuǎn)錄因子,近幾年,作為LSCs的陽性標志物對角膜緣上皮細胞及培養(yǎng)細胞進行鑒定[31-32]。研究發(fā)現(xiàn),p63廣泛表達于角膜緣的基底部,而在角膜緣表層上皮和角膜中央上皮層卻未見表達,可作為LSCs的陽性標志物[33]。波形蛋白(vimentin)是間質(zhì)細胞中最豐富的蛋白質(zhì)[34]。波形蛋白表達于角膜緣上皮基底細胞中,其常與其他生物標志物用于識別LSCs[35]。本研究使用細胞免疫熒光檢測FLSCs的波形蛋白和p63表達情況,結(jié)果表明,培養(yǎng)的細胞均呈陽性表達,表明本研究篩選與分離培養(yǎng)的細胞為FLSCs。

CK3和CK12是表達于細胞質(zhì)的角蛋白,被認為是角膜上皮分化的標記物。Schermer等[36]早在1986年利用CK3對兔角膜緣部位細胞染色,發(fā)現(xiàn)CK3在角膜緣的基底細胞層中未見表達,而角膜中央部位則全層表達。CK12作為角膜上皮特異性標記物,除角膜緣基底細胞外,其存在于整個角膜上皮。因此CK和CK12被廣泛認為是在角膜上皮細胞、角膜緣上基底層細胞中特異性表達,而不在角膜緣基底細胞中表達[27]。這些研究證明,CK3和CK12可作為LSCs的陰性標志物。本研究分離培養(yǎng)的的細胞中,CK3與CK12均為陰性表達,表明本研究所分離培養(yǎng)的細胞并非分化的角膜上皮細胞。4種標志物雙向驗證本研究分離培養(yǎng)的細胞為FLSCs。

4 結(jié) 論

本研究首次成功對FLSCs進行了采集、分離、體外培養(yǎng)與鑒定,并篩選出了最優(yōu)的分離與培養(yǎng)體系,為進一步使用FLSCs治療貓相關角膜疾病提供了堅實的理論基礎,也為其他動物LSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定提供了參考依據(jù)。