• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    分離自屠宰場(chǎng)的肺炎克雷伯菌的耐藥性分析

    2023-07-31 08:57:20趙菲菲謝仕廷曾振靈
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:克雷伯毒力耐藥性

    趙菲菲,李 杰,韓 寧,謝仕廷,曾振靈*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642;2.廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642;3.國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

    肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia) 屬腸桿菌科、克雷伯菌屬的革蘭陰性菌,兼性厭氧,無(wú)鞭毛,有較厚的莢膜,已成為僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌[1]。近年來(lái),由于飼養(yǎng)管理不規(guī)范、免疫抑制性疾病頻發(fā)、濫用抗生素、畜舍飼養(yǎng)密度不合理等,肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性日益嚴(yán)重,不但呈現(xiàn)多重耐藥(multidrug resistant,MDR)現(xiàn)象,且分離率呈逐年上升趨勢(shì)[2-3],因而限制了細(xì)菌感染的治療選擇。同時(shí),肺炎克雷伯菌可致使豬、牛、羊、雞、水貂、狐貍等動(dòng)物及人發(fā)病,臨床上通常表現(xiàn)為腦膜炎、肺炎、敗血癥、支氣管炎等多種病癥,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

    1875年,Edwin Klebs首次在一例肺炎患者的氣道分泌物中分離得到肺炎克雷伯菌;1882年,肺炎克雷伯菌由德國(guó)微生物學(xué)家和病理學(xué)家Carl Friedlander首次報(bào)道,因此該細(xì)菌一度被稱為Friedl?nder菌[7];1989年和1990年夏秋季,C型肺炎克雷伯氏桿菌病在福建省福州地區(qū)部分豬場(chǎng)暴發(fā)[8];高倞[9]對(duì)河南駐馬店地區(qū)患呼吸道疾病豬肺、鼻拭子等74份樣本中分離得到43株肺炎克雷伯菌,研究發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素等7種藥物耐藥性較高,耐藥率均在51.2%以上,且呈現(xiàn)多重耐藥性。歐冠標(biāo)等[10]對(duì)廣西南寧地區(qū)采集存欄生豬肛拭子樣品125份及宰后生豬肉類(lèi)樣品50份,分別分離得到32及4株肺炎克雷伯菌,發(fā)現(xiàn)其對(duì)四環(huán)素、氯霉素耐藥性最高。譚耀榮等[11]從發(fā)病母豬組織中分離得到一株肺炎克雷伯菌,菌株接種在血瓊脂培養(yǎng)基上會(huì)發(fā)生α溶血現(xiàn)象,且具有多重耐藥性,能夠使小鼠在22 h內(nèi)死亡,表明其具有嚴(yán)重的耐藥性和強(qiáng)致病性。

    為了解豬源肺炎克雷伯菌的耐藥情況,本試驗(yàn)2021年3月從廣州市白云區(qū)某屠宰場(chǎng)采集豬肺樣本150份,通過(guò)對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)觀察、khe基因PCR檢測(cè),篩選并鑒定出116株肺炎克雷伯菌。通過(guò)對(duì)116株肺炎克雷伯菌血清型、耐藥性、耐藥基因和毒力基因進(jìn)行檢測(cè),為豬源肺炎克雷伯菌的防控提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 樣品來(lái)源 本試驗(yàn)在2021年3月于廣州市白云區(qū)某屠宰場(chǎng)(豬來(lái)源于廣東省、湖南省和江西省)采集豬肺樣本150份,質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由本藥理教研室保存。

    1.1.2 主要試劑 LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林均購(gòu)于海博生物技術(shù)有限公司,MH瓊脂購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,引物、DNA Marker均購(gòu)于擎科生物技術(shù)有限公司,2×PCR Mix購(gòu)于東盛生物科技有限公司,核酸染料購(gòu)于廣州藍(lán)澤生物科技有限公司,革蘭染色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,瓊脂糖購(gòu)于西班牙Biowest公司,氨芐西林(含量96.0%)、美羅培南(含量98.0%)、四環(huán)素(含量95.0%)等均購(gòu)于大連美倫生物技術(shù)有限公司。

    1.1.3 主要儀器 渦旋儀購(gòu)于杭州海沛儀器有限公司,恒溫?fù)u床購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司,PCR儀購(gòu)于蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司,核酸電泳儀購(gòu)于上海天能科技有限公司,數(shù)控恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)等均購(gòu)于賽默飛世爾科技公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 無(wú)菌操作取豬肺樣本置于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中,恒溫37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12~16 h用于增菌,再將菌液劃線接種于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18 h后挑取呈粉色、菌落濕潤(rùn)、黏液樣、拉動(dòng)呈絲狀的疑似菌落轉(zhuǎn)接于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純化,最后挑取純化后的單菌落于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂中進(jìn)行增菌培養(yǎng),刮取菌苔于30%甘油肉湯中,-20 ℃保存,備用。

    1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 一般通過(guò)革蘭染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及鑒別菌株。取擦拭干凈的載玻片,滴加一滴生理鹽水,取純培養(yǎng)在麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基中的單菌落涂布在載玻片中,烤片固定,經(jīng)結(jié)晶紫初染(1 min,水洗)、碘液媒染(1 min,水洗)、95%乙醇脫色(20 s,水洗)、番紅液復(fù)染(2 min,水洗)后,鏡檢觀察菌株形態(tài)。

    1.2.3 樣品DNA提取 利用煮沸法[12]提取細(xì)菌DNA模板。取增菌培養(yǎng)的菌液50 μL復(fù)蘇后,置于103 ℃恒溫金屬浴中加熱15 min,轉(zhuǎn)放-20 ℃冰箱中冰浴15 min,高速冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1離心2 min,吸取上清液,即為DNA模板,-20 ℃保存,備用。

    1.2.4 細(xì)菌PCR鑒定 參照參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道的特異性引物(表1),以提取的樣品DNA模板進(jìn)行khe基因擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增片段大小為428 bp。PCR擴(kuò)增體系(總體積為20 μL):2×PCR Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè),將陽(yáng)性產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    表1 細(xì)菌分離鑒定及血清型分型引物Table 1 Primers for bacterial isolation, identification and serotype identification in this study

    1.2.5 血清型分型 根據(jù)文獻(xiàn)[14]設(shè)計(jì)合成引物,采用PCR方法擴(kuò)增6種常見(jiàn)的莢膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57),引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性15 s,Tm退火15 s,72 ℃延伸20 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min,8 ℃保存。擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè),將陽(yáng)性產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果提交 NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)。

    1.2.6 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn),以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌,利用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)13種抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌分離株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[15]。檢測(cè)的抗菌藥物:氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、美羅培南、黏菌素、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、多西環(huán)素、替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明。

    1.2.7 耐藥基因的檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[16-19]設(shè)計(jì)合成引物,對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)(blaCTX-M1)、碳青霉烯類(lèi)耐藥基因(blaKPC-2、blaNDM-1、blaNDM-5)、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因(tetA、tetB)、磺胺類(lèi)耐藥基因(sul1、sul2)、喹諾酮類(lèi)耐藥基因(oqxA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表2。

    表2 肺炎克雷伯菌耐藥相關(guān)基因的PCR引物Table 2 PCR primers for drug-resistant genes of Klebsiella pneumoniae

    1.2.8 毒力基因的檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[16,20-22]設(shè)計(jì)合成引物,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)8種常見(jiàn)的毒力基因,包括莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因(rmpA),鐵載體基因(entB、iucA、iroN),菌毛定植黏附基因(ycfM、fimH、mrkD),脂多糖形成相關(guān)基因(wabG),PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表3。

    表3 肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)基因的PCR引物Table 3 PCR primers for virulence genes of Klebsiella pneumoniae

    2 結(jié) 果

    2.1 肺炎克雷伯菌分離及鑒定結(jié)果

    無(wú)菌狀態(tài)下將分離株劃線培養(yǎng)于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林平板,可見(jiàn)紅色、較大且黏稠的菌落,用接種環(huán)挑取時(shí)有拉絲的現(xiàn)象。革蘭染色鏡檢菌體呈現(xiàn)紅色短桿狀,單個(gè)排列,偶見(jiàn)兩個(gè)鏈狀排列,符合肺炎克雷伯菌的形態(tài)特征(圖1A);樣本通過(guò)DNA提取及PCR鑒定,116個(gè)樣品擴(kuò)增出大小約428 bp的特異性條帶,分離率為77.3%,測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)比對(duì)分析,確定分離株為肺炎克雷伯菌(圖1B),其中,共84株檢出常見(jiàn)的血清型,以K57型(59株,50.9%)為主,其次為K5型(20株,17.2%)和K2型(4株,3.5%),未檢出K1、K20和K54型(圖1C)。

    A.革蘭染色鏡檢結(jié)果(100×);B.部分分離菌株khe基因鑒定結(jié)果(M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1~7.分離菌株);C.常見(jiàn)血清型鑒定結(jié)果A. The results of Gram stain microscopy (100×); B. The results of khe gene identification in some isolates(M.DNA marker; 1-7. Isolates);C. The results of common serotype identification圖1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 The results of bacterial isolation and identification

    2.2 藥敏試驗(yàn)

    通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法,對(duì)116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行13種抗菌藥物的MIC檢測(cè)。結(jié)果顯示,116株肺炎克雷伯菌分離株對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林及復(fù)方新諾明的耐藥率較高,分別為96.6%、95.7%、95.7%及94.0%;其次是慶大霉素和環(huán)丙沙星,耐藥率均為25.0%;對(duì)頭孢噻肟、替加環(huán)素、頭孢他啶和阿米卡星的耐藥率較低,分別為4.3%、2.6%、1.7%和1.7%;對(duì)美羅培南、黏菌素和恩諾沙星均敏感(見(jiàn)圖2)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明分離株多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重,其中耐4種抗生素的菌株最多,占比59.5%,且僅有一株菌表現(xiàn)為對(duì)所有檢測(cè)藥物敏感(表4)。

    圖2 肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of Klebsiella pneumoniae drug sensitivity test

    表4 分離株多重耐藥攜帶率分析結(jié)果Table 4 The results of multidrug resistance carrying rate analysis of isolates

    2.3 耐藥基因檢測(cè)

    本研究對(duì)116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行了常見(jiàn)的11個(gè)耐藥基因的檢測(cè),結(jié)果顯示,磺胺類(lèi)耐藥基因sul2的檢出率為60.3%(70/116),碳青霉烯酶基因blaNDM-1和blaNDM-5的檢出率均為0.9%(1/116),與藥敏結(jié)果中復(fù)方新諾明的高耐藥率以及美羅培南高敏感一致;喹諾酮類(lèi)耐藥基因oqxA的檢出率為59.5%(69/116)(圖3)。

    圖3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The result of drug resistance genes

    2.4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

    116株肺炎克雷伯菌中8種毒力基因檢出率:莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因rmpA的檢出率為7.8%,鐵載體基因entB、iucA、iroN的檢出率分別為78.4%、61.2%及1.7%,菌毛定值與黏附基因ycfM、fimH、mrkD的檢出率分別為87.1%、35.3%及62.9%,脂多糖形成相關(guān)基因wabG的檢出率為56.0%(圖4)。

    圖4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The result of virulence genes

    3 討 論

    近年來(lái),隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,由感染肺炎克雷伯菌而引發(fā)臨床動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道也越來(lái)越多,給養(yǎng)殖企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[23]。由于肺炎克雷伯菌的感染與呼吸道疾病相關(guān)[24],因此本試驗(yàn)以豬肺為采集對(duì)象,共分離到116株肺炎克雷伯菌,分離率(77.3%)較高。血清型檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其中84株(72.4%)為常見(jiàn)血清型,有32株(27.6%)為未分型菌株,表明存在其他血清分型,需進(jìn)一步鑒定。根據(jù)毒力特點(diǎn)肺炎克雷伯菌可分為經(jīng)典型和高毒力型。因此,本研究通過(guò)PEG-344基因[25]鑒定高毒力肺炎克雷伯菌,然而在116株臨床分離株中無(wú)高毒力型肺炎克雷伯菌(結(jié)果未顯示)。這表明該屠宰場(chǎng)雖然肺炎克雷伯菌的分離率偏高,但分離株致病性弱。

    肺炎克雷伯菌感染機(jī)體的過(guò)程與其存在的毒力基因相關(guān),如鐵載體、菌毛、莢膜、脂多糖等。因此本試驗(yàn)通過(guò)PCR對(duì)116株分離株進(jìn)行8個(gè)毒力基因檢測(cè),毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示,菌毛定值與黏附基因ycfM檢出率最高(87.1%),其次是鐵載體基因entB(78.4%),這與Farzana等[26]報(bào)道的1株致新生兒極高病死率的高毒力多重耐藥天花克雷伯菌類(lèi)似,鐵攝取系統(tǒng)、菌毛等典型毒力因子檢出率都較高。此外,翟祎夢(mèng)等[27]研究表明,鐵攝取對(duì)細(xì)菌毒力至關(guān)重要,ent基因?qū)Υ龠M(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)和提高其在特定條件的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)具有重要作用。

    近年來(lái),由于大量使用抗生素,肺炎克雷伯菌會(huì)產(chǎn)生抗生素水解酶,耐藥菌株不斷出現(xiàn),導(dǎo)致使用抗生素防治肺炎的難度逐漸加大[28]。通過(guò)藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn),116株肺炎克雷伯菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥率較高,耐藥率均在90%以上,與此4種抗菌藥物大量用于豬的疾病防治密切相關(guān);對(duì)美羅培南、黏菌素和恩諾沙星均敏感;對(duì)其他藥物耐藥率為1.7%~25.0%。董瑞和孫曉[29]對(duì)滄州地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)中分離出的肺炎克雷伯菌耐藥性進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素和磺胺類(lèi)藥物的耐藥率均超過(guò)90%;劉海林[30]研究表明,從河南新鄉(xiāng)分離的肺炎克雷伯菌對(duì)一代頭孢類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物和四環(huán)素耐藥性較強(qiáng),均與本研究結(jié)果一致。從分離菌株的多重耐藥結(jié)果來(lái)看,耐4種抗生素的分離菌株最多,占分離菌的59.5%,與林星宇等[31]報(bào)道的結(jié)果一致。

    鑒于豬場(chǎng)耐藥情況嚴(yán)重,為了解肺炎克雷伯菌分離株耐藥基因攜帶情況,本試驗(yàn)共測(cè)定ESBLs、碳青霉烯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)5大類(lèi)耐藥基因,其中,磺胺類(lèi)耐藥基因檢出率最高,sul2檢出率為60.3%,oqxA為59.5%。有趣的是,喹諾酮類(lèi)耐藥基因的高檢出率和低耐藥率表現(xiàn)不一致,可能是這些耐藥基因在菌體內(nèi)未表達(dá)。此現(xiàn)象與尹澤東等[32]報(bào)道的大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因檢出率與耐藥相關(guān)性的研究一致。

    綜上所述,目前肺炎克雷伯菌在豬場(chǎng)中有一定的流行趨勢(shì),并且出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象。尤其是對(duì)四環(huán)素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)以及磺胺類(lèi)抗生素耐藥嚴(yán)重,且呈多重耐藥現(xiàn)象。因此建議在生產(chǎn)實(shí)踐中要合理使用抗生素,選用敏感藥物如恩諾沙星、黏菌素,避免耐藥性的產(chǎn)生。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境,提高動(dòng)物機(jī)體免疫力,完善飼養(yǎng)程序,提高經(jīng)濟(jì)效益。

    4 結(jié) 論

    通過(guò)對(duì)廣東省廣州市某屠宰場(chǎng)豬源肺炎克雷伯菌進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)來(lái)自廣東省、湖南省、江西省的養(yǎng)殖場(chǎng)中肺炎克雷伯菌感染較為嚴(yán)重。定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)展致病性肺炎克雷伯菌的檢測(cè)和耐藥性檢測(cè),有助于減少疾病的發(fā)生,并為豬源肺炎克雷伯菌感染的防控提供參考依據(jù)。

    猜你喜歡
    克雷伯毒力耐藥性
    變棲克雷伯菌感染患者的臨床特征
    12種殺菌劑對(duì)三線鐮刀菌的室內(nèi)毒力測(cè)定
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:04
    長(zhǎng)絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    侵襲性和非侵襲性肺炎克雷伯菌肝膿腫CT特征對(duì)比
    阿維菌素與螺螨酯對(duì)沾化冬棗截形葉螨的毒力篩選及田間防效研究
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機(jī)升級(jí),普及耐藥性檢測(cè)意義重大
    水稻白葉枯病菌Ⅲ型效應(yīng)物基因hpaF與毒力相關(guān)
    連翹等中草藥對(duì)肺炎克雷伯菌抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用
    影響肺炎克雷伯菌粘附上皮細(xì)胞作用的研究
    欧美日本中文国产一区发布| 亚洲成人国产一区在线观看| 成人三级做爰电影| 国产成人精品久久二区二区91| 少妇粗大呻吟视频| 黄色a级毛片大全视频| 男人操女人黄网站| 国产精品九九99| 成人三级黄色视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产成人欧美在线观看| 日韩欧美免费精品| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| e午夜精品久久久久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精品免费视频内射| 亚洲中文日韩欧美视频| 欧美日韩福利视频一区二区| av有码第一页| 国产高清视频在线播放一区| 一级毛片精品| svipshipincom国产片| 女人精品久久久久毛片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 身体一侧抽搐| 在线国产一区二区在线| 国产成人欧美在线观看| 一区二区三区精品91| 国产免费现黄频在线看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲国产欧美网| 欧美中文综合在线视频| 久9热在线精品视频| 91av网站免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产99久久九九免费精品| 女人被狂操c到高潮| 在线观看日韩欧美| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产熟女xx| 精品第一国产精品| 日本一区二区免费在线视频| 91av网站免费观看| 热re99久久精品国产66热6| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色综合婷婷激情| 亚洲专区字幕在线| 夜夜爽天天搞| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产伦人伦偷精品视频| 久久伊人香网站| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲国产精品999在线| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲熟妇熟女久久| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 乱人伦中国视频| 99在线人妻在线中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 高清黄色对白视频在线免费看| 色综合站精品国产| 啦啦啦免费观看视频1| 9热在线视频观看99| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲男人天堂网一区| 日本vs欧美在线观看视频| 两性夫妻黄色片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 大型av网站在线播放| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| av片东京热男人的天堂| 男女之事视频高清在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 乱人伦中国视频| 99国产精品99久久久久| 日韩欧美在线二视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜福利在线观看吧| av在线天堂中文字幕 | 午夜免费观看网址| 亚洲自拍偷在线| 亚洲中文字幕日韩| 色老头精品视频在线观看| 一区二区三区国产精品乱码| www.精华液| 性欧美人与动物交配| 国产熟女午夜一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美激情高清一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 久久中文看片网| 国产又色又爽无遮挡免费看| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产亚洲欧美98| 99精品久久久久人妻精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| www.999成人在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 曰老女人黄片| 又黄又爽又免费观看的视频| 制服人妻中文乱码| 国产成人av教育| 免费看十八禁软件| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 丝袜美足系列| 看片在线看免费视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 中文字幕色久视频| 国产亚洲欧美精品永久| 99精品久久久久人妻精品| 日韩欧美免费精品| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品影院久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 9热在线视频观看99| 亚洲成人免费电影在线观看| 超碰97精品在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黄色a级毛片大全视频| 欧美中文综合在线视频| 久久久国产成人精品二区 | 欧美乱码精品一区二区三区| 色综合婷婷激情| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲五月色婷婷综合| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产97色在线日韩免费| 三级毛片av免费| 美女 人体艺术 gogo| 免费在线观看黄色视频的| 午夜精品在线福利| 久久精品亚洲av国产电影网| 麻豆av在线久日| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩欧美在线二视频| 性欧美人与动物交配| 国产区一区二久久| 亚洲人成伊人成综合网2020| 午夜老司机福利片| 免费在线观看黄色视频的| 久久香蕉激情| 久久午夜亚洲精品久久| 后天国语完整版免费观看| 国产色视频综合| 后天国语完整版免费观看| 国产av又大| 波多野结衣一区麻豆| 大香蕉久久成人网| 两性夫妻黄色片| 一区在线观看完整版| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一区在线观看完整版| 男人操女人黄网站| 久久香蕉激情| 国产成人av教育| 亚洲欧美激情综合另类| 很黄的视频免费| 国产区一区二久久| 成熟少妇高潮喷水视频| www国产在线视频色| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲精品av麻豆狂野| av天堂久久9| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产片内射在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品久久午夜乱码| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 免费av中文字幕在线| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美人与性动交α欧美软件| 黄色成人免费大全| 国产精品久久久久成人av| 岛国在线观看网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 老司机在亚洲福利影院| 一二三四在线观看免费中文在| 久久精品91蜜桃| 丝袜在线中文字幕| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲熟女毛片儿| 精品一区二区三卡| 两人在一起打扑克的视频| 成人免费观看视频高清| 久久久久久大精品| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日韩三级视频一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 日本免费a在线| 一级,二级,三级黄色视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 久99久视频精品免费| 女人被狂操c到高潮| 国产激情久久老熟女| 久久久久久久久免费视频了| 99国产精品99久久久久| 一本大道久久a久久精品| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本黄色日本黄色录像| 久久中文字幕人妻熟女| av网站免费在线观看视频| 欧美乱妇无乱码| 午夜老司机福利片| 成人亚洲精品av一区二区 | 新久久久久国产一级毛片| av在线播放免费不卡| 88av欧美| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品福利永久在线观看| 久久九九热精品免费| 精品久久久久久电影网| 日韩大尺度精品在线看网址 | 窝窝影院91人妻| 色婷婷久久久亚洲欧美| 不卡一级毛片| 午夜免费成人在线视频| 成年人免费黄色播放视频| a级毛片在线看网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 99精品在免费线老司机午夜| 麻豆成人av在线观看| 亚洲片人在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产成人影院久久av| 中文字幕人妻熟女乱码| 91麻豆av在线| 可以在线观看毛片的网站| 色老头精品视频在线观看| 国产精品影院久久| 国产成人系列免费观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲av美国av| 午夜福利一区二区在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲男人天堂网一区| 大陆偷拍与自拍| 99在线视频只有这里精品首页| 国产片内射在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产欧美网| 日韩国内少妇激情av| 三上悠亚av全集在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99国产综合亚洲精品| 欧美日韩一级在线毛片| 精品久久久久久电影网| svipshipincom国产片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 乱人伦中国视频| 久久精品国产清高在天天线| 麻豆av在线久日| 久久草成人影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 97碰自拍视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久久大精品| 欧美日韩一级在线毛片| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产单亲对白刺激| 淫妇啪啪啪对白视频| 手机成人av网站| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲人成电影观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美日韩av久久| 韩国精品一区二区三区| 午夜a级毛片| 女性生殖器流出的白浆| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美丝袜亚洲另类 | 一级片'在线观看视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久人人精品亚洲av| 免费高清视频大片| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美久久黑人一区二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 成人国产一区最新在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲七黄色美女视频| x7x7x7水蜜桃| 看免费av毛片| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品粉嫩美女一区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产熟女xx| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久久人人做人人爽| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久草成人影院| 国产成人av激情在线播放| 少妇 在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 久久性视频一级片| 国产片内射在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲第一av免费看| 日韩av在线大香蕉| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看免费高清a一片| 免费看a级黄色片| 国产av在哪里看| 久久中文看片网| 国产精品久久视频播放| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲国产欧美网| 日韩免费av在线播放| 国产一卡二卡三卡精品| 在线观看免费午夜福利视频| 老司机亚洲免费影院| 一级a爱片免费观看的视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 在线十欧美十亚洲十日本专区| 好男人电影高清在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99riav亚洲国产免费| 免费av中文字幕在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲伊人色综图| 久久久久久久午夜电影 | 在线观看免费视频日本深夜| 欧美午夜高清在线| 夜夜爽天天搞| 黑人猛操日本美女一级片| 国产成人欧美| 久久久久久久午夜电影 | 免费在线观看影片大全网站| 视频区欧美日本亚洲| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品国产国语对白av| 久久久久亚洲av毛片大全| 女性生殖器流出的白浆| 99久久国产精品久久久| 久久久久久久久中文| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产av一区二区精品久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 丰满的人妻完整版| 欧美成狂野欧美在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久精品欧美日韩精品| 女人被狂操c到高潮| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久精品91无色码中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品美女久久av网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 97人妻天天添夜夜摸| av欧美777| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 首页视频小说图片口味搜索| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩欧美三级三区| 99热国产这里只有精品6| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲伊人色综图| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 成人精品一区二区免费| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲性夜色夜夜综合| 成年女人毛片免费观看观看9| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 丰满的人妻完整版| av福利片在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美乱妇无乱码| 成人永久免费在线观看视频| 久久亚洲精品不卡| av福利片在线| 老司机在亚洲福利影院| 两个人免费观看高清视频| 免费看十八禁软件| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩精品青青久久久久久| 丝袜美腿诱惑在线| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美激情久久久久久爽电影 | 嫩草影视91久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产高清videossex| 欧美一区二区精品小视频在线| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 88av欧美| 国产单亲对白刺激| 亚洲熟女毛片儿| 国产三级黄色录像| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久久久久午夜电影 | 日韩免费av在线播放| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品电影一区二区在线| 精品免费久久久久久久清纯| 久久影院123| 老熟妇仑乱视频hdxx| 精品久久久久久成人av| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 视频在线观看一区二区三区| 丁香六月欧美| 两个人免费观看高清视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 久久久久久久午夜电影 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久99一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产色视频综合| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久中文看片网| 性少妇av在线| 水蜜桃什么品种好| 69av精品久久久久久| 女性被躁到高潮视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| netflix在线观看网站| 色综合站精品国产| 久久青草综合色| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品一区二区在线不卡| 搡老岳熟女国产| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲三区欧美一区| 国产免费现黄频在线看| 夫妻午夜视频| 村上凉子中文字幕在线| 在线观看日韩欧美| 一区二区三区激情视频| 久久99一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久中文字幕人妻熟女| 久久人妻av系列| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久九九热精品免费| 国产免费男女视频| 免费高清视频大片| 成人亚洲精品av一区二区 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 一级毛片精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲专区国产一区二区| 嫩草影院精品99| xxx96com| 男女下面进入的视频免费午夜 | 国产成人av激情在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 日韩欧美在线二视频| 亚洲少妇的诱惑av| 成人手机av| a级毛片黄视频| 久久久国产精品麻豆| 久久影院123| 美女午夜性视频免费| 99久久国产精品久久久| 亚洲熟女毛片儿| 国产成人精品无人区| 国产成人免费无遮挡视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类 | 波多野结衣高清无吗| 香蕉国产在线看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩国内少妇激情av| 成在线人永久免费视频| 亚洲av片天天在线观看| 午夜福利免费观看在线| 看片在线看免费视频| 长腿黑丝高跟| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲中文av在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| avwww免费| 狂野欧美激情性xxxx| 97碰自拍视频| 成年人黄色毛片网站| 国产视频一区二区在线看| 亚洲av第一区精品v没综合| 色播在线永久视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 极品人妻少妇av视频| 午夜视频精品福利| tocl精华| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av第一区精品v没综合| 在线观看舔阴道视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一级毛片女人18水好多| 丰满的人妻完整版| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 精品久久久久久电影网| 乱人伦中国视频| 无人区码免费观看不卡| ponron亚洲| 99精品久久久久人妻精品| 999精品在线视频| 欧美乱妇无乱码| 亚洲欧美激情在线| 久久九九热精品免费| 麻豆久久精品国产亚洲av | 午夜福利影视在线免费观看| 露出奶头的视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 岛国视频午夜一区免费看| 国产高清国产精品国产三级| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜久久久在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 久久久国产成人精品二区 | 久久久久九九精品影院| 麻豆成人av在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 免费av中文字幕在线| 在线观看一区二区三区激情| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜激情av网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲国产欧美网| 久久久精品欧美日韩精品| 久久精品国产综合久久久| 叶爱在线成人免费视频播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 黄色视频,在线免费观看| 91九色精品人成在线观看| 大陆偷拍与自拍| 欧美乱色亚洲激情| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲三区欧美一区| 久久精品成人免费网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精品成人在线| 身体一侧抽搐| 操出白浆在线播放| 国产精品影院久久| 两人在一起打扑克的视频| 无遮挡黄片免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产又爽黄色视频| 午夜久久久在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久人妻av系列| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品高清国产在线一区| 99国产综合亚洲精品| 精品福利观看|