• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    分離自屠宰場(chǎng)的肺炎克雷伯菌的耐藥性分析

    2023-07-31 08:57:20趙菲菲謝仕廷曾振靈
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2023年7期
    關(guān)鍵詞:克雷伯毒力耐藥性

    趙菲菲,李 杰,韓 寧,謝仕廷,曾振靈*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642;2.廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642;3.國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

    肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia) 屬腸桿菌科、克雷伯菌屬的革蘭陰性菌,兼性厭氧,無(wú)鞭毛,有較厚的莢膜,已成為僅次于大腸埃希菌的第二大條件致病菌[1]。近年來(lái),由于飼養(yǎng)管理不規(guī)范、免疫抑制性疾病頻發(fā)、濫用抗生素、畜舍飼養(yǎng)密度不合理等,肺炎克雷伯菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性日益嚴(yán)重,不但呈現(xiàn)多重耐藥(multidrug resistant,MDR)現(xiàn)象,且分離率呈逐年上升趨勢(shì)[2-3],因而限制了細(xì)菌感染的治療選擇。同時(shí),肺炎克雷伯菌可致使豬、牛、羊、雞、水貂、狐貍等動(dòng)物及人發(fā)病,臨床上通常表現(xiàn)為腦膜炎、肺炎、敗血癥、支氣管炎等多種病癥,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。

    1875年,Edwin Klebs首次在一例肺炎患者的氣道分泌物中分離得到肺炎克雷伯菌;1882年,肺炎克雷伯菌由德國(guó)微生物學(xué)家和病理學(xué)家Carl Friedlander首次報(bào)道,因此該細(xì)菌一度被稱為Friedl?nder菌[7];1989年和1990年夏秋季,C型肺炎克雷伯氏桿菌病在福建省福州地區(qū)部分豬場(chǎng)暴發(fā)[8];高倞[9]對(duì)河南駐馬店地區(qū)患呼吸道疾病豬肺、鼻拭子等74份樣本中分離得到43株肺炎克雷伯菌,研究發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素等7種藥物耐藥性較高,耐藥率均在51.2%以上,且呈現(xiàn)多重耐藥性。歐冠標(biāo)等[10]對(duì)廣西南寧地區(qū)采集存欄生豬肛拭子樣品125份及宰后生豬肉類(lèi)樣品50份,分別分離得到32及4株肺炎克雷伯菌,發(fā)現(xiàn)其對(duì)四環(huán)素、氯霉素耐藥性最高。譚耀榮等[11]從發(fā)病母豬組織中分離得到一株肺炎克雷伯菌,菌株接種在血瓊脂培養(yǎng)基上會(huì)發(fā)生α溶血現(xiàn)象,且具有多重耐藥性,能夠使小鼠在22 h內(nèi)死亡,表明其具有嚴(yán)重的耐藥性和強(qiáng)致病性。

    為了解豬源肺炎克雷伯菌的耐藥情況,本試驗(yàn)2021年3月從廣州市白云區(qū)某屠宰場(chǎng)采集豬肺樣本150份,通過(guò)對(duì)菌株的形態(tài)學(xué)觀察、khe基因PCR檢測(cè),篩選并鑒定出116株肺炎克雷伯菌。通過(guò)對(duì)116株肺炎克雷伯菌血清型、耐藥性、耐藥基因和毒力基因進(jìn)行檢測(cè),為豬源肺炎克雷伯菌的防控提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 樣品來(lái)源 本試驗(yàn)在2021年3月于廣州市白云區(qū)某屠宰場(chǎng)(豬來(lái)源于廣東省、湖南省和江西省)采集豬肺樣本150份,質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922由本藥理教研室保存。

    1.1.2 主要試劑 LB營(yíng)養(yǎng)肉湯、麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林均購(gòu)于海博生物技術(shù)有限公司,MH瓊脂購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,引物、DNA Marker均購(gòu)于擎科生物技術(shù)有限公司,2×PCR Mix購(gòu)于東盛生物科技有限公司,核酸染料購(gòu)于廣州藍(lán)澤生物科技有限公司,革蘭染色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司,瓊脂糖購(gòu)于西班牙Biowest公司,氨芐西林(含量96.0%)、美羅培南(含量98.0%)、四環(huán)素(含量95.0%)等均購(gòu)于大連美倫生物技術(shù)有限公司。

    1.1.3 主要儀器 渦旋儀購(gòu)于杭州海沛儀器有限公司,恒溫?fù)u床購(gòu)于上海智城分析儀器制造有限公司,PCR儀購(gòu)于蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司,核酸電泳儀購(gòu)于上海天能科技有限公司,數(shù)控恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)等均購(gòu)于賽默飛世爾科技公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 無(wú)菌操作取豬肺樣本置于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中,恒溫37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12~16 h用于增菌,再將菌液劃線接種于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18 h后挑取呈粉色、菌落濕潤(rùn)、黏液樣、拉動(dòng)呈絲狀的疑似菌落轉(zhuǎn)接于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純化,最后挑取純化后的單菌落于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂中進(jìn)行增菌培養(yǎng),刮取菌苔于30%甘油肉湯中,-20 ℃保存,備用。

    1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 一般通過(guò)革蘭染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及鑒別菌株。取擦拭干凈的載玻片,滴加一滴生理鹽水,取純培養(yǎng)在麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林瓊脂培養(yǎng)基中的單菌落涂布在載玻片中,烤片固定,經(jīng)結(jié)晶紫初染(1 min,水洗)、碘液媒染(1 min,水洗)、95%乙醇脫色(20 s,水洗)、番紅液復(fù)染(2 min,水洗)后,鏡檢觀察菌株形態(tài)。

    1.2.3 樣品DNA提取 利用煮沸法[12]提取細(xì)菌DNA模板。取增菌培養(yǎng)的菌液50 μL復(fù)蘇后,置于103 ℃恒溫金屬浴中加熱15 min,轉(zhuǎn)放-20 ℃冰箱中冰浴15 min,高速冷凍離心機(jī)中12 000 r·min-1離心2 min,吸取上清液,即為DNA模板,-20 ℃保存,備用。

    1.2.4 細(xì)菌PCR鑒定 參照參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道的特異性引物(表1),以提取的樣品DNA模板進(jìn)行khe基因擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增片段大小為428 bp。PCR擴(kuò)增體系(總體積為20 μL):2×PCR Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè),將陽(yáng)性產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    表1 細(xì)菌分離鑒定及血清型分型引物Table 1 Primers for bacterial isolation, identification and serotype identification in this study

    1.2.5 血清型分型 根據(jù)文獻(xiàn)[14]設(shè)計(jì)合成引物,采用PCR方法擴(kuò)增6種常見(jiàn)的莢膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57),引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性15 s,Tm退火15 s,72 ℃延伸20 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸5 min,8 ℃保存。擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測(cè),將陽(yáng)性產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果提交 NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對(duì)。

    1.2.6 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn),以大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌,利用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)13種抗菌藥物對(duì)肺炎克雷伯菌分離株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)[15]。檢測(cè)的抗菌藥物:氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、美羅培南、黏菌素、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、多西環(huán)素、替加環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明。

    1.2.7 耐藥基因的檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[16-19]設(shè)計(jì)合成引物,對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因(extended spectrum β-lactamases,ESBLs)(blaCTX-M1)、碳青霉烯類(lèi)耐藥基因(blaKPC-2、blaNDM-1、blaNDM-5)、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因(tetA、tetB)、磺胺類(lèi)耐藥基因(sul1、sul2)、喹諾酮類(lèi)耐藥基因(oqxA、qnrB、aac(6′)-Ib-cr)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表2。

    表2 肺炎克雷伯菌耐藥相關(guān)基因的PCR引物Table 2 PCR primers for drug-resistant genes of Klebsiella pneumoniae

    1.2.8 毒力基因的檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[16,20-22]設(shè)計(jì)合成引物,利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)8種常見(jiàn)的毒力基因,包括莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因(rmpA),鐵載體基因(entB、iucA、iroN),菌毛定植黏附基因(ycfM、fimH、mrkD),脂多糖形成相關(guān)基因(wabG),PCR擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表3。

    表3 肺炎克雷伯菌毒力相關(guān)基因的PCR引物Table 3 PCR primers for virulence genes of Klebsiella pneumoniae

    2 結(jié) 果

    2.1 肺炎克雷伯菌分離及鑒定結(jié)果

    無(wú)菌狀態(tài)下將分離株劃線培養(yǎng)于麥康凱肌醇阿東醇羧芐西林平板,可見(jiàn)紅色、較大且黏稠的菌落,用接種環(huán)挑取時(shí)有拉絲的現(xiàn)象。革蘭染色鏡檢菌體呈現(xiàn)紅色短桿狀,單個(gè)排列,偶見(jiàn)兩個(gè)鏈狀排列,符合肺炎克雷伯菌的形態(tài)特征(圖1A);樣本通過(guò)DNA提取及PCR鑒定,116個(gè)樣品擴(kuò)增出大小約428 bp的特異性條帶,分離率為77.3%,測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)比對(duì)分析,確定分離株為肺炎克雷伯菌(圖1B),其中,共84株檢出常見(jiàn)的血清型,以K57型(59株,50.9%)為主,其次為K5型(20株,17.2%)和K2型(4株,3.5%),未檢出K1、K20和K54型(圖1C)。

    A.革蘭染色鏡檢結(jié)果(100×);B.部分分離菌株khe基因鑒定結(jié)果(M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1~7.分離菌株);C.常見(jiàn)血清型鑒定結(jié)果A. The results of Gram stain microscopy (100×); B. The results of khe gene identification in some isolates(M.DNA marker; 1-7. Isolates);C. The results of common serotype identification圖1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Fig.1 The results of bacterial isolation and identification

    2.2 藥敏試驗(yàn)

    通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法,對(duì)116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行13種抗菌藥物的MIC檢測(cè)。結(jié)果顯示,116株肺炎克雷伯菌分離株對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林及復(fù)方新諾明的耐藥率較高,分別為96.6%、95.7%、95.7%及94.0%;其次是慶大霉素和環(huán)丙沙星,耐藥率均為25.0%;對(duì)頭孢噻肟、替加環(huán)素、頭孢他啶和阿米卡星的耐藥率較低,分別為4.3%、2.6%、1.7%和1.7%;對(duì)美羅培南、黏菌素和恩諾沙星均敏感(見(jiàn)圖2)。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明分離株多重耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重,其中耐4種抗生素的菌株最多,占比59.5%,且僅有一株菌表現(xiàn)為對(duì)所有檢測(cè)藥物敏感(表4)。

    圖2 肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of Klebsiella pneumoniae drug sensitivity test

    表4 分離株多重耐藥攜帶率分析結(jié)果Table 4 The results of multidrug resistance carrying rate analysis of isolates

    2.3 耐藥基因檢測(cè)

    本研究對(duì)116株肺炎克雷伯菌進(jìn)行了常見(jiàn)的11個(gè)耐藥基因的檢測(cè),結(jié)果顯示,磺胺類(lèi)耐藥基因sul2的檢出率為60.3%(70/116),碳青霉烯酶基因blaNDM-1和blaNDM-5的檢出率均為0.9%(1/116),與藥敏結(jié)果中復(fù)方新諾明的高耐藥率以及美羅培南高敏感一致;喹諾酮類(lèi)耐藥基因oqxA的檢出率為59.5%(69/116)(圖3)。

    圖3 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The result of drug resistance genes

    2.4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

    116株肺炎克雷伯菌中8種毒力基因檢出率:莢膜多糖生成調(diào)節(jié)基因rmpA的檢出率為7.8%,鐵載體基因entB、iucA、iroN的檢出率分別為78.4%、61.2%及1.7%,菌毛定值與黏附基因ycfM、fimH、mrkD的檢出率分別為87.1%、35.3%及62.9%,脂多糖形成相關(guān)基因wabG的檢出率為56.0%(圖4)。

    圖4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果Fig.4 The result of virulence genes

    3 討 論

    近年來(lái),隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,由感染肺炎克雷伯菌而引發(fā)臨床動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道也越來(lái)越多,給養(yǎng)殖企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[23]。由于肺炎克雷伯菌的感染與呼吸道疾病相關(guān)[24],因此本試驗(yàn)以豬肺為采集對(duì)象,共分離到116株肺炎克雷伯菌,分離率(77.3%)較高。血清型檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其中84株(72.4%)為常見(jiàn)血清型,有32株(27.6%)為未分型菌株,表明存在其他血清分型,需進(jìn)一步鑒定。根據(jù)毒力特點(diǎn)肺炎克雷伯菌可分為經(jīng)典型和高毒力型。因此,本研究通過(guò)PEG-344基因[25]鑒定高毒力肺炎克雷伯菌,然而在116株臨床分離株中無(wú)高毒力型肺炎克雷伯菌(結(jié)果未顯示)。這表明該屠宰場(chǎng)雖然肺炎克雷伯菌的分離率偏高,但分離株致病性弱。

    肺炎克雷伯菌感染機(jī)體的過(guò)程與其存在的毒力基因相關(guān),如鐵載體、菌毛、莢膜、脂多糖等。因此本試驗(yàn)通過(guò)PCR對(duì)116株分離株進(jìn)行8個(gè)毒力基因檢測(cè),毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示,菌毛定值與黏附基因ycfM檢出率最高(87.1%),其次是鐵載體基因entB(78.4%),這與Farzana等[26]報(bào)道的1株致新生兒極高病死率的高毒力多重耐藥天花克雷伯菌類(lèi)似,鐵攝取系統(tǒng)、菌毛等典型毒力因子檢出率都較高。此外,翟祎夢(mèng)等[27]研究表明,鐵攝取對(duì)細(xì)菌毒力至關(guān)重要,ent基因?qū)Υ龠M(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)和提高其在特定條件的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)具有重要作用。

    近年來(lái),由于大量使用抗生素,肺炎克雷伯菌會(huì)產(chǎn)生抗生素水解酶,耐藥菌株不斷出現(xiàn),導(dǎo)致使用抗生素防治肺炎的難度逐漸加大[28]。通過(guò)藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn),116株肺炎克雷伯菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明耐藥率較高,耐藥率均在90%以上,與此4種抗菌藥物大量用于豬的疾病防治密切相關(guān);對(duì)美羅培南、黏菌素和恩諾沙星均敏感;對(duì)其他藥物耐藥率為1.7%~25.0%。董瑞和孫曉[29]對(duì)滄州地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)中分離出的肺炎克雷伯菌耐藥性進(jìn)行研究時(shí),發(fā)現(xiàn)對(duì)氨芐西林、多西環(huán)素和磺胺類(lèi)藥物的耐藥率均超過(guò)90%;劉海林[30]研究表明,從河南新鄉(xiāng)分離的肺炎克雷伯菌對(duì)一代頭孢類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物和四環(huán)素耐藥性較強(qiáng),均與本研究結(jié)果一致。從分離菌株的多重耐藥結(jié)果來(lái)看,耐4種抗生素的分離菌株最多,占分離菌的59.5%,與林星宇等[31]報(bào)道的結(jié)果一致。

    鑒于豬場(chǎng)耐藥情況嚴(yán)重,為了解肺炎克雷伯菌分離株耐藥基因攜帶情況,本試驗(yàn)共測(cè)定ESBLs、碳青霉烯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)5大類(lèi)耐藥基因,其中,磺胺類(lèi)耐藥基因檢出率最高,sul2檢出率為60.3%,oqxA為59.5%。有趣的是,喹諾酮類(lèi)耐藥基因的高檢出率和低耐藥率表現(xiàn)不一致,可能是這些耐藥基因在菌體內(nèi)未表達(dá)。此現(xiàn)象與尹澤東等[32]報(bào)道的大腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因檢出率與耐藥相關(guān)性的研究一致。

    綜上所述,目前肺炎克雷伯菌在豬場(chǎng)中有一定的流行趨勢(shì),并且出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象。尤其是對(duì)四環(huán)素類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)以及磺胺類(lèi)抗生素耐藥嚴(yán)重,且呈多重耐藥現(xiàn)象。因此建議在生產(chǎn)實(shí)踐中要合理使用抗生素,選用敏感藥物如恩諾沙星、黏菌素,避免耐藥性的產(chǎn)生。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,創(chuàng)造良好的養(yǎng)殖環(huán)境,提高動(dòng)物機(jī)體免疫力,完善飼養(yǎng)程序,提高經(jīng)濟(jì)效益。

    4 結(jié) 論

    通過(guò)對(duì)廣東省廣州市某屠宰場(chǎng)豬源肺炎克雷伯菌進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)來(lái)自廣東省、湖南省、江西省的養(yǎng)殖場(chǎng)中肺炎克雷伯菌感染較為嚴(yán)重。定期對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)展致病性肺炎克雷伯菌的檢測(cè)和耐藥性檢測(cè),有助于減少疾病的發(fā)生,并為豬源肺炎克雷伯菌感染的防控提供參考依據(jù)。

    猜你喜歡
    克雷伯毒力耐藥性
    變棲克雷伯菌感染患者的臨床特征
    12種殺菌劑對(duì)三線鐮刀菌的室內(nèi)毒力測(cè)定
    云南化工(2021年6期)2021-12-21 07:31:04
    長(zhǎng)絲鱸潰爛癥病原分離鑒定和耐藥性分析
    侵襲性和非侵襲性肺炎克雷伯菌肝膿腫CT特征對(duì)比
    阿維菌素與螺螨酯對(duì)沾化冬棗截形葉螨的毒力篩選及田間防效研究
    嬰幼兒感染中的耐藥菌分布及耐藥性分析
    WHO:HIV耐藥性危機(jī)升級(jí),普及耐藥性檢測(cè)意義重大
    水稻白葉枯病菌Ⅲ型效應(yīng)物基因hpaF與毒力相關(guān)
    連翹等中草藥對(duì)肺炎克雷伯菌抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用
    影響肺炎克雷伯菌粘附上皮細(xì)胞作用的研究
    韩国高清视频一区二区三区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| kizo精华| av在线观看视频网站免费| 亚洲av男天堂| 最近手机中文字幕大全| 久久久久久久久久久丰满| 97超碰精品成人国产| 成人毛片60女人毛片免费| 国产成人91sexporn| 精品少妇久久久久久888优播| 色婷婷久久久亚洲欧美| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品不卡视频一区二区| 两个人的视频大全免费| 在线观看三级黄色| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产日韩欧美在线精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 日本免费在线观看一区| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 成年免费大片在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 成人毛片60女人毛片免费| 免费av毛片视频| 国产综合精华液| 日韩 亚洲 欧美在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久久国产a免费观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美xxⅹ黑人| 欧美国产精品一级二级三级 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产成人免费观看mmmm| 日本一二三区视频观看| 青春草视频在线免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 99热网站在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 国产久久久一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲国产精品专区欧美| 插阴视频在线观看视频| 在线观看人妻少妇| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久久国产a免费观看| 简卡轻食公司| 国产成人一区二区在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 嫩草影院新地址| 免费看av在线观看网站| 老司机影院毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 中文天堂在线官网| 五月玫瑰六月丁香| 熟女人妻精品中文字幕| 在线精品无人区一区二区三 | 久久久久久久精品精品| 国产久久久一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 午夜视频国产福利| 亚洲欧美日韩无卡精品| av在线播放精品| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲综合精品二区| 精品视频人人做人人爽| 日日啪夜夜撸| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 成年免费大片在线观看| 女人久久www免费人成看片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 91精品伊人久久大香线蕉| 内地一区二区视频在线| 国产午夜福利久久久久久| 久久久国产一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 看黄色毛片网站| 国产极品天堂在线| 欧美激情在线99| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品一区二区在线观看99| 99热网站在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日本视频| 亚洲美女视频黄频| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产在视频线精品| 99久久精品一区二区三区| 边亲边吃奶的免费视频| 五月伊人婷婷丁香| av一本久久久久| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲综合精品二区| 亚洲三级黄色毛片| 街头女战士在线观看网站| 视频中文字幕在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av.在线天堂| 大片电影免费在线观看免费| 国产视频内射| 国产男女超爽视频在线观看| 国产男女内射视频| 又爽又黄无遮挡网站| 色综合色国产| 有码 亚洲区| 少妇熟女欧美另类| 国产黄片美女视频| 亚洲自偷自拍三级| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美日韩东京热| 草草在线视频免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲三级黄色毛片| 久久精品国产自在天天线| 一区二区三区免费毛片| 国产精品国产av在线观看| 久久99精品国语久久久| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品福利在线免费观看| 午夜老司机福利剧场| 国产淫语在线视频| 日韩欧美精品v在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 最近最新中文字幕大全电影3| av网站免费在线观看视频| 激情 狠狠 欧美| 免费看日本二区| 亚洲av二区三区四区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 在线 av 中文字幕| 亚洲在久久综合| 久久99热这里只有精品18| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 毛片女人毛片| 特级一级黄色大片| 在线观看三级黄色| 欧美极品一区二区三区四区| 日韩欧美 国产精品| 久久ye,这里只有精品| 极品教师在线视频| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美97在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 久久精品久久精品一区二区三区| 青春草国产在线视频| 内地一区二区视频在线| 一级毛片我不卡| 成年免费大片在线观看| 成人欧美大片| 日本免费在线观看一区| 国产精品人妻久久久影院| 国产老妇伦熟女老妇高清| 人妻 亚洲 视频| 免费观看av网站的网址| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 五月天丁香电影| 国产探花在线观看一区二区| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产欧美人成| 99久国产av精品国产电影| 国产 一区 欧美 日韩| h日本视频在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 91久久精品国产一区二区成人| 国产久久久一区二区三区| 国产av码专区亚洲av| 一级毛片 在线播放| 好男人在线观看高清免费视频| 久久这里有精品视频免费| 1000部很黄的大片| 神马国产精品三级电影在线观看| 97在线视频观看| 日韩亚洲欧美综合| 国产色爽女视频免费观看| 免费av不卡在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 亚洲成人久久爱视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩三级伦理在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 人妻系列 视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日韩欧美 国产精品| 成人国产av品久久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本免费在线观看一区| av播播在线观看一区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久国产网址| 亚洲天堂av无毛| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | www.av在线官网国产| 久久精品人妻少妇| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久97久久精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 成年av动漫网址| 中文资源天堂在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲怡红院男人天堂| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 精品酒店卫生间| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 91精品国产九色| 午夜免费观看性视频| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品国产成人久久av| 下体分泌物呈黄色| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精品,欧美精品| 免费观看性生交大片5| 51国产日韩欧美| 青春草视频在线免费观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 99热网站在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 伊人久久国产一区二区| 久久女婷五月综合色啪小说 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本一二三区视频观看| av在线老鸭窝| 身体一侧抽搐| 亚洲内射少妇av| 久久国内精品自在自线图片| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美+日韩+精品| 国产亚洲5aaaaa淫片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 精品国产露脸久久av麻豆| 99热网站在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线看a的网站| 男女边吃奶边做爰视频| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲无线观看免费| 精品国产乱码久久久久久小说| 美女内射精品一级片tv| 亚洲久久久久久中文字幕| 成人综合一区亚洲| 成人免费观看视频高清| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 91久久精品国产一区二区成人| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久精品国产亚洲av天美| 午夜免费男女啪啪视频观看| 九九在线视频观看精品| 国产一区二区三区av在线| 欧美国产精品一级二级三级 | 欧美人与善性xxx| 寂寞人妻少妇视频99o| av免费观看日本| 久久久久久国产a免费观看| 婷婷色综合www| 亚洲图色成人| 伦理电影大哥的女人| 神马国产精品三级电影在线观看| 九色成人免费人妻av| 在线观看免费高清a一片| 久久精品国产亚洲网站| 中文字幕久久专区| 国产成人精品久久久久久| 99久久精品热视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产老妇伦熟女老妇高清| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲性久久影院| 交换朋友夫妻互换小说| 一本色道久久久久久精品综合| 一二三四中文在线观看免费高清| 性色av一级| 日韩在线高清观看一区二区三区| 1000部很黄的大片| 七月丁香在线播放| av国产久精品久网站免费入址| 99热这里只有精品一区| 欧美+日韩+精品| av国产免费在线观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| av在线蜜桃| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产在视频线精品| 99热这里只有精品一区| 欧美日本视频| 不卡视频在线观看欧美| 日韩欧美精品v在线| 欧美性感艳星| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产 一区精品| 大片免费播放器 马上看| 午夜精品一区二区三区免费看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 黑人高潮一二区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 97超碰精品成人国产| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲天堂国产精品一区在线| 全区人妻精品视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 在线 av 中文字幕| 国产又色又爽无遮挡免| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久久久久久丰满| 99视频精品全部免费 在线| 七月丁香在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产色爽女视频免费观看| .国产精品久久| 日韩三级伦理在线观看| 老司机影院成人| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| 国产成人a∨麻豆精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜免费观看性视频| av在线亚洲专区| 中文天堂在线官网| 久久久久久久久大av| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产一区二区三区av在线| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产精品99久久99久久久不卡 | 成人漫画全彩无遮挡| 最近的中文字幕免费完整| av专区在线播放| 久久久亚洲精品成人影院| 九色成人免费人妻av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 内射极品少妇av片p| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区三区乱码不卡18| 国产综合懂色| 久久热精品热| xxx大片免费视频| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产精品999| 久久99热这里只有精品18| 2021少妇久久久久久久久久久| 91狼人影院| 99久久精品热视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 高清视频免费观看一区二区| 久久99蜜桃精品久久| 天天躁日日操中文字幕| 欧美潮喷喷水| 最新中文字幕久久久久| 精品久久久精品久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费看a级黄色片| 日韩免费高清中文字幕av| 99久久精品一区二区三区| 深夜a级毛片| 免费观看性生交大片5| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧洲日产国产| 午夜激情福利司机影院| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 久久国内精品自在自线图片| 成人一区二区视频在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 别揉我奶头 嗯啊视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 九色成人免费人妻av| 亚洲精品456在线播放app| 三级经典国产精品| 嫩草影院精品99| 国产69精品久久久久777片| 伦精品一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 国产一区有黄有色的免费视频| 成人黄色视频免费在线看| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲成人av在线免费| av在线天堂中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 哪个播放器可以免费观看大片| 青春草亚洲视频在线观看| 人妻系列 视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品嫩草影院av在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 色网站视频免费| av免费观看日本| 最后的刺客免费高清国语| 人人妻人人看人人澡| freevideosex欧美| 六月丁香七月| 日韩欧美一区视频在线观看 | 成人无遮挡网站| 在线播放无遮挡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩av在线免费看完整版不卡| 大片免费播放器 马上看| 亚洲精品日本国产第一区| 伦精品一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 大香蕉97超碰在线| 亚洲,欧美,日韩| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 51国产日韩欧美| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久久久av| 亚洲人成网站在线播| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 男男h啪啪无遮挡| 秋霞伦理黄片| 国产成人91sexporn| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 我的老师免费观看完整版| 久久久精品欧美日韩精品| 观看免费一级毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 精品人妻熟女av久视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久热精品热| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产午夜精品一二区理论片| 久久精品国产自在天天线| 99热这里只有是精品在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 身体一侧抽搐| 国模一区二区三区四区视频| 色5月婷婷丁香| 欧美精品国产亚洲| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 男女无遮挡免费网站观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 色视频在线一区二区三区| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲怡红院男人天堂| 日本黄色片子视频| 亚洲av日韩在线播放| 春色校园在线视频观看| 人体艺术视频欧美日本| 久久精品久久精品一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲综合精品二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 嫩草影院新地址| 国产伦在线观看视频一区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久99热这里只频精品6学生| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av成人精品一二三区| 国产69精品久久久久777片| 交换朋友夫妻互换小说| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲成色77777| 国产成人a∨麻豆精品| 大香蕉久久网| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 高清午夜精品一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 在线天堂最新版资源| 国产在视频线精品| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲综合精品二区| 在线看a的网站| 麻豆成人午夜福利视频| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲精品日本国产第一区| 身体一侧抽搐| 男人和女人高潮做爰伦理| 麻豆久久精品国产亚洲av| 能在线免费看毛片的网站| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 嫩草影院入口| 国产精品一区二区在线观看99| av卡一久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 校园人妻丝袜中文字幕| 人妻一区二区av| 视频中文字幕在线观看| 亚洲国产日韩一区二区| 国精品久久久久久国模美| 欧美日本视频| 天美传媒精品一区二区| 国产成人一区二区在线| 欧美另类一区| 精品久久久噜噜| 少妇的逼好多水| 久久这里有精品视频免费| 日韩强制内射视频| 国产又色又爽无遮挡免| 在线观看国产h片| av在线亚洲专区| 日本av手机在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 久久6这里有精品| 少妇高潮的动态图| 国产av国产精品国产| 岛国毛片在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 在线天堂最新版资源| 男人和女人高潮做爰伦理| 两个人的视频大全免费| 国产成人aa在线观看| 日日啪夜夜撸| 亚洲精品第二区| 国产精品成人在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲天堂av无毛| 91精品国产九色| 一区二区av电影网| 一级爰片在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 看黄色毛片网站| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲精品国产成人久久av| 波多野结衣巨乳人妻| 激情 狠狠 欧美| 麻豆成人av视频| 久久韩国三级中文字幕| 色网站视频免费| 老司机影院成人| 亚洲精品自拍成人| 国产精品国产三级国产专区5o| 免费看a级黄色片| 国产精品伦人一区二区| 日本色播在线视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 久久99热这里只有精品18| 97在线人人人人妻| av免费在线看不卡| 免费少妇av软件| 国产黄a三级三级三级人| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品三级大全| 伦精品一区二区三区| 嫩草影院新地址| 国产成人精品福利久久| 男男h啪啪无遮挡| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| av又黄又爽大尺度在线免费看| 联通29元200g的流量卡| 欧美国产精品一级二级三级 | 嫩草影院精品99| 内射极品少妇av片p|