不同產(chǎn)地干、鮮粉葛 HPLC 指紋圖譜及6種成分含量測定

謝雪勤 李志杰 吳靜宜 鄧欣 洪玉冰 車彥云 趙毅

【摘 要】 ??目的： 比較不同產(chǎn)地干、鮮粉葛中化學成分及對其中葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元 6 種異黃酮類成分的含量進行測定。 方法： 選用 Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇－0.2%冰乙酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，紫外檢測波長為 250 nm。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2.0版）”軟件處理色譜數(shù)據(jù)，建立了粉葛指紋圖譜，同時進行相似度評價。另外，采用 HPLC對 6 種成分進行了含量測定。 結(jié)果： 建立了粉葛的指紋圖譜，共標定了 26 個共有峰，指認了 9 種成分，分別是 3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素。對其中 6 種指認的成分進行含量測定，發(fā)現(xiàn)各地葛根素含量最多。各地鮮品葛根素平均含量為 4.48 mg/g，各產(chǎn)地含量排名前三依次是：文山＞麗江＞紅河，各產(chǎn)地6 種異黃酮總含量排名前三依次是：紅河＞文山＞麗江；不同產(chǎn)地 6 種異黃酮總含量均是鮮品大于烘干粉葛。 結(jié)論： 不同產(chǎn)地粉葛干、鮮的化學成分較相似，但含量存在明顯差異，且鮮品粉葛中 6 種異黃酮總含量高于干品，可為粉葛資源的相關(guān)開發(fā)利用提供有效的科學依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 ?指紋圖譜；粉葛；異黃酮；含量測定

【中圖分類號】R932 ??【文獻標志碼】A ???【文章編號】1007-8517（2023）13-0023-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202313006

HPLC Fingerprints of Dry and Fresh ??from Different Areas and Determination of Six Components

XIE Xueqin1，2 LI Zhijie1，2 WU Jingyi1，2 DENG Xin1，2 HONG Yubing1，2 CHE Yanyun1，2 ZHAO Yi1，2*

1. College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2.Engineering Research Center for Homology of Medicine and Food Beverage of Yunnan Province， Kunming 650500，China

Abstract： ?Objective ?To compare the chemical constituents of dried and fresh different producing area and determine the contents of six isoflavones， including Puerarin， 3′-MethoxyPuerarin， Puerarin apioside， Daidzin， Genistin and Daidzein. Methods ?The Symmetry C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used with methanol-0.2%glacial acetic acid aqueous solution as the mobile phase for gradient elution， and the ultraviolet detection wavelength was 250 nm. The chromatographic data were processed by the software of “ Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Materia Medica （version 2.0）”， and the fingerprints of Pueraria thomsonii were established and the similarity was evaluated. In addition， the contents of the six components were determined by HPLC. Results ?HPLC fingerprints of Pueraria thomsonii were established. A total of 26 common peaks were identified， and 9 components were determined， namely 3′- Hydroxy Puerarin， Puerarin， 3′-Methoxy Puerarin， Puerarin apioside， Daidzin， Genistin， Daidzein， Genistein and Formononetin. The contents of six identified components were determined， and it was found that the content of puerarin was the highest in all places. The average content of puerarin in fresh samples is 4.48 mg/g， and the top three contents in each producing area are Wenshan > Lijiang > Honghe， and the top three total contents of six isoflavones in each producing area are Honghe > Wenshan > Lijiang. The total contents of six isoflavones from different origins were higher in the fresh products than in the dried Pueraria thomsonii. ?Conclusion ?The chemical components of dried and fresh Pueraria thomsonii from different habitats are similar， but there are obvious differences in their contents. In addition， that total content of the six isoflavone in the fresh ?Pueraria thomsonii is higher than that of the dry Pueraria thomsonii， which can provide effective scientific basis for the related development and utilization of Pueraria thomsonii resources.

Key words： Fingerprint; Pueraria thomsonii; Isoflavone; Content Determination

粉葛是豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii ?Benth.的干燥根，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡、解酒毒等功效［1］。粉葛在2005年于《中國藥典》中與葛根分開記載，藥典規(guī)定葛根正品藥用植物有葛根與粉葛，其有效成分主要為異黃酮類［2］，而其中以葛根素、大豆苷元和染料木素等為主［3］。研究［4-8］表明，葛根具有解酒護肝、降血糖、降血壓、抗炎、抗凋亡和抗氧化等藥理活性。

中藥鮮藥的研究也有眾多討論，鮮藥的使用體現(xiàn)了極高的價值［9-12］。葛根鮮用也有悠久的歷史，《圣惠方》中記載鮮葛搗汁可治鼻衄；葛洪在《肘后備急方》中也記載：“搗鮮葛根，以水煮，去滓，溫服，治金瘡中風”“治服藥失度，心中苦煩，飲生葛根汁大良?！蹦壳皩Ψ鄹鹧芯恐饕燥嬈瑸橹?，且主要集中于化學成分、藥理活性、臨床應用等方面，對鮮品涉及較少，干、鮮品粉葛化學成分的差異也少有報道。

本實驗通過對粉葛干品、鮮品的異黃酮類成分建立指紋圖譜，并對其中的葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元6種成分進行含量測定，以期為粉葛后續(xù)相關(guān)臨床應用及藥理藥效考察提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料 11種粉葛樣品分別于2022年5～6月采集和購買于云南省、貴州省、廣西省、湖北省。

1.2 儀器 高效液相色譜儀（SHIMADZU LC-2030，日本島津公司）；分析天平（ AR224CN 型，奧豪斯儀器有限公司）；超純水機（VE-10LH-A，深圳市洪森環(huán)保科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱（101-3AB，天津市泰斯特儀器有限公司）；超聲波清洗器（SK5200HP，上?？茖С晝x器有限公司）；冰箱（ BCD-610W，西門子股份公司）。

1.3 試劑 粉葛（購自德陽遠知藥材經(jīng)營部，由云南中醫(yī)藥大學中藥學院邱斌正高級工程師鑒定為豆科植物甘葛藤 ?Pueraria thomsonii ?Benth. 的根）；對照品：3′-羥基 葛根素（3′-HydroxyPuerarin）、葛根素（Puerarin）、3′-甲氧基葛根素（3′-MethoxyPuerarin）、葛根素芹菜糖苷（Puerarin apioside）、大豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）和 芒柄花素（Formononetin），均購于德斯特生物技術(shù)有限公司（純度≥98.0%）。色譜甲醇（美國Sigma公司），其它試劑為分析純。

1.4 原料的制備 將11個產(chǎn)地的新鮮粉葛洗凈，去除表面泥沙，分為兩份，一份凍干，一份于60 ℃烘干（水分符合《中國藥典》2020年版要求），具體信息見表1，粉碎，過三號篩后保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm），以甲醇－0.2%冰乙酸水溶液作為流動相梯度洗脫（見表 2），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長250 nm；進樣量：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素，置于5 mL容量瓶中， 用40%甲醇溶解，定容。吸取各對照品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用40%甲醇定容，制得各質(zhì)量濃度分別為0.7252 mg/mL、0.3332 mg/mL、0.4508 mg/mL、 0.3332 mg/mL、0.5096 mg/mL、0.5684 mg/mL、0.5488 mg/mL、0.4508 mg/mL、0.6468 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試溶液的制備 分別精密稱取凍干與60 ℃干燥的粉葛粉末約1.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入40%甲醇50.0 mL，稱重，超聲提取30 min，放冷，補足失重，搖勻， 以3500 rpm離心 15 min，取上層清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性考察 取“2.2”項下對照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，以40%甲醇定容至刻度，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分的含量為橫坐標（ X）、峰面積為縱坐標（Y ）進行線性回歸，見表3。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品混合溶液10 μL，重復進樣 6 次測定，以峰面積計算連續(xù)進樣測定6次，以葛根素為參照，計算各色譜峰峰的相對峰面積。結(jié)果表示3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素的RSD值分別為0.07%、0.07%、0.04%、0.06%、0.07%、0.10%、0.11%、0.03%、0.02%，表明該方法精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品混合溶液10 μL，分別在0 h、1 h、4 h、6 h、10 h時進行測定，分別計算3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素 的RSD值分別為0.06%、0.08%、0.05%、0.07%、0.06%、0.09%、0.11%、0.02%、0.01%， 表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復性試驗 取同一批樣品，平行配制6份供試品溶液， 進樣10 μL。分別計算3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素的RSD值，結(jié)果分別為1.83%、1.49%、0.75%、0.68%、2.35%、1.19%、1.48%、2.26%、2.48%， 表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 ?取已知含量的干品（編號S4，60 ℃烘干）6份，每份約0.8 g，加入含量相當?shù)膶φ掌啡芤海ò础?.2”項下方法配制），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算平均回收率和RSD。結(jié)果顯示，葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的平均加樣回收率分別為100.50%、101.41%、99.51%、101.85%、100.18%、99.33%，RSD分別為0.81%、1.09%、1.18%、1.47%、1.07%、1.25%（表4）。

2.5 干、鮮粉葛指紋圖譜的生成及相似度評價 取11批粉葛干、鮮樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，將圖譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2.0版）》。以S4樣品圖譜為參照，生成干（A）、鮮（B）粉葛HPLC指紋圖譜和各自對照指紋圖譜（R），如圖1所示。采用Mark峰匹配，共得到26個共有峰。通過比對混合對照品色譜圖（D），確定10、13、14、15、18、19、23、24、26號峰分別為3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素。

對11批粉葛干、鮮樣品進行相似度評價。圖A S1～S11 批干品與對照指紋圖譜的相似度在0.721～0.995之間，其中嵩明與賀州相似度分別為0.721與0.779，其余產(chǎn)地相似度均大于0.9；圖 B S1～S11 批鮮品與對照指紋圖譜的相似度在0.939～0.989之間，表明各產(chǎn)地粉葛之間差異性較小。

2.6 6種差異性成分的含量測定 取11批粉葛干、鮮樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并計算6種差異性成分葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的含量。不同產(chǎn)地的粉葛 6 種異黃酮成分含量差異較大，各地葛根素含量最多。各地凍干鮮品葛根素平均含量為4.48 mg/g，各產(chǎn)地含量排名前三依次是：文山＞麗江＞紅河，6種異黃酮總含量，各產(chǎn)地含量排名前三依次是：紅河＞文山＞麗江；不同產(chǎn)地6種異黃酮總含量均是凍干鮮品大于烘干。該差異可能是與地域、氣候、采收期以及運輸過程中的儲存方式相關(guān)。見表5。

3 討論

鮮藥是藥材經(jīng)采收后直接使用的特殊的中藥材［13］，中藥鮮藥的應用具有悠久的歷史，最早在《五十二病方》中就有關(guān)于鮮藥應用的記載［14］。據(jù)統(tǒng)計，臨床常用藥中有480種可用鮮品治療疾?。?5］。由于鮮藥受到產(chǎn)地、時節(jié)及保鮮技術(shù)等因素的影響，市場上中藥材多用干品。粉葛作為藥食兩用資源，鮮葛寒涼清熱作用較干葛強，可治療溫病發(fā)熱、血熱吐衄、 津傷口渴等血熱病［16］。市場上粉葛不論作為藥品或者食品均是以干品或提取物居多，但粉葛作為鮮藥使用也具有很高的價值。

本實驗通過對不同產(chǎn)地的粉葛干品、鮮品建立指紋圖譜并進行相似度評價發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地粉葛化學成分無明顯差異，粉葛干品與鮮品化學成分也無明顯差異；但比較其葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元6種異黃酮成分含量，不同產(chǎn)地的粉葛6種異黃酮成分含量差異較大，各地葛根素含量最多；干品與鮮品6種異黃酮成分總含量也較大，均是鮮品大于烘干粉葛。各地鮮品葛根素平均含量為4.48 mg/g，各產(chǎn)地含量排名前三依次是：文山＞麗江＞紅河，6種異黃酮總含量，各產(chǎn)地含量排名前三依次是：紅河＞文山＞麗江。因為樣品均為藥材公司提供，考慮其地域、氣候、采收期以及運輸過程中的儲存方式等因素，所得結(jié)果還需進一步驗證。

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（收稿日期：2022-03-08 編輯：劉 斌）