高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定五味子中的4種木脂素成分

唐琪 歐陽云 和薛 王輝 鄭濟(jì)芳 徐小娜

【摘要】目的：建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定五味子中五味子醇甲等4種木脂素成分的含量。方法：采用Sepax C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，甲醇-乙腈-水流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。結(jié)果：五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分別在0.365～13.194 mg/g、0.388～14.853 mg/g、0.442～16.630 mg/g、0.313～ 11.882 mg/g濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回收率、精密度、穩(wěn)定性等試驗(yàn)結(jié)果均符合方法學(xué)測(cè)定要求。12批不同產(chǎn)地五味子的4種木脂素成分含量有差異，RSD為0.76%～3.28%。結(jié)論：建立的高效液相色譜法可用于同時(shí)分析五味子中的4種木脂素成分。

【關(guān)鍵詞】五味子；高效液相色譜法；五味子醇甲；五味子酯甲；五味子甲素；五味子乙素

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.03.034

【基金項(xiàng)目】廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020JJA140132）；廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2023KY0527）；桂林醫(yī)學(xué)院人才引進(jìn)科研項(xiàng)目（20501020028）。

The Simultaneous Determination of Four Lignans in Schisandra Chinensis by HPLC

TANG Qi1，OUYANG yun1，HE Xue1，WANG Hui2，ZHENG Jifang1，XU Xiaona1，3*

（1.SGuilin Medical College〔School of Public Health〕，Guilin 541199，China；2.South China University〔School of Public Health〕，Hengyang 421001，China；3.The Guangxi Key Laboratory of Environmental Exposomics and Entire Lifecycle Health，Guilin 541199，China）

Abstract：Objective：To establish a high performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneous determination Schizandrol A and other three lignans in Schisandra Chinensis. Methods：HPLC separations were carried out on a Sepax C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm）by gradient elution using methanol，acetonitrile and water as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30℃. The injection volume was 20μL and the detection wavelength was 220 nm. Results：The linear relationships of Schizandrol A，Schisantherin A，Schizandrin A and Schizandrin B were good within the ranges of 0.36～13.20，0.39～ 14.86，0.44～16.63，and 0.32～11.88 mg/g，relatively. The results of recovery，precision，stability and so on all met the requirements of methodological determination. The content of the four lignans tested in 12 batches of Schisandra Chinensis samples from different producing areas was different，with the RSD of 0.76%～3.28%. Conclusin：The established method can be applied to determine the four lignans in Schisandra Chinensis simultaneously.

Key words：Schisandra Chinensis；HPLC；SchizandrolA；SchisantherinA；SchizandrinA；Schizandrin B

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)，具有益氣生津、收斂固澀、補(bǔ)腎寧心等功效[1]，屬我國(guó)傳統(tǒng)中藥材?，F(xiàn)代研究表明，木脂素為五味子主要的生物活性成分，具有保護(hù)肝臟、延緩心肌和血管重構(gòu)、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用[2]。目前，已從五味子中分離得到約50個(gè)木脂素類成分，且不同木脂素單體成分具有不同的功效[3]。其中，五味子醇甲具有明顯的鎮(zhèn)痛[4]、抗驚厥和抗抑郁[5]、鎮(zhèn)靜催眠、抗癌、抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞和抗自由基活性等作用[6]；五味子酯甲具有止咳、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤作用[7]；五味子甲素對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞瘤有較好的增殖抑制作用[8]；五味子乙素具有抗氧化、抗炎、護(hù)肝、抗腫瘤等功效[10]。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定以五味子醇甲的含量作為五味子藥材及飲片質(zhì)量控制的指標(biāo)，顯然單一指標(biāo)成分的含量測(cè)定不能全面反映藥材的質(zhì)量狀況。

為提高中藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保其療效穩(wěn)定，本文采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等4種木脂素成分同時(shí)進(jìn)行分析。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器和試劑

戴安高效液相色譜儀LC-20A，KQ-3200DF超聲儀清洗器（昆山超聲儀器公司，中國(guó)），萬能粉碎機(jī)，中沃水務(wù)超強(qiáng)型超純水器，遠(yuǎn)紅外干燥箱，冰箱，120目篩。

五味子醇甲（批號(hào)110857-201412）、五味子酯甲（批號(hào)1529-200001）、五味子甲素（批號(hào)110764-201714）、五味子乙素（批號(hào)110765-201512）均購于湖南省食品藥品檢定所。分析純無水甲醇、分析純無水乙醇、HPLC級(jí)甲醇、HPLC級(jí)乙腈均購于江蘇漢邦科技有限公司，水為二次去離子水（自制）。

1.2樣品信息

實(shí)驗(yàn)所用五味子藥材均為2019年產(chǎn)，經(jīng)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥學(xué)部劉韶教授鑒定為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)。樣品信息見表1。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

采用Sepax C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）-甲醇（C），梯度洗脫（0～20 min，A 30%，B 40%；20.1～30 min，A 30%→35%，B 40%→35%；30.1～40 min，A 35%→45%，B 35%→25%；40.1～50 min，A 45%，B 25%；50.1～60 min，A45%→30%，B 25%→40%）。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備

分別精密稱定四種對(duì)照品適量，加甲醇配制成各種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：五味子醇甲（0.7400 mg/mL）、五味子酯甲（0.5000 mg/ mL）、五味子甲素（1.4000 mg/mL）、五味子乙素（0.3000 mg/ mL），于4℃冰箱冷藏、備用。臨用前制備成標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

2.2.2樣品溶液制備

精密稱取五味子粉末0.25 g置于25 mL具塞比色管中，精密加入90 %甲醇4.00 mL，超聲提取3次，每次提取20 min，過濾，合并三次濾液，定容，搖勻，冷藏備用。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1專屬性

取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶劑進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，在樣品及對(duì)照品出峰處溶劑無干擾，表明方法的專屬性良好。

2.3.2線性關(guān)系

取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制備成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行進(jìn)樣2次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，以信噪比為3倍確定檢測(cè)限，色譜圖如圖1（A）所示，結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素分別在0.365～13.194 mg/g、0.388～14.853 mg/g、0.442～16.630 mg/g、0.313～11.882 mg/g濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r值均在0.9997～0.9999，回歸方程分別為y=96822x-0.5182、y=89233x-0.6938、y=73700x-0.6239和y=124166x-0.8712。表明各對(duì)照品在各自濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3精密度

對(duì)同一樣品在日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，得日內(nèi)精密度，在連續(xù)三天內(nèi)分別測(cè)定6次得日間精密度。結(jié)果五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值小于5.0%，表明方法的精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性

取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算。五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的峰面積RSD分別為1.08%、1.12%、1.47%和1.22%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5重復(fù)性

取同一樣品，精密稱取5份，按“2.2.2樣品溶液制備”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，平行測(cè)定，計(jì)算五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素平均峰面積，所得RSD值均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6回收率

稱取已知含量的五味子藥材細(xì)粉6份，分別精密加入等量對(duì)照品，按“2.2.2樣品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果平均回收率為98.31%～99.08%之間，RSD<2.8%，表明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.4樣品測(cè)定

在優(yōu)化的條件下分析樣品，利用回歸方程計(jì)算樣品中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，代表性的色譜圖如圖1（B）所示。樣品分析結(jié)果見表2。

3討論

3.1色譜柱選擇

考察了樣品在Phenomenex LUNR C18、Agilent XDB-C8、Sepax C18及依利特Hypersil ODS C18等色譜柱，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中Sepax C18分離效果最好。

3.2流動(dòng)相選擇

試驗(yàn)了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水等不同系統(tǒng)流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以甲醇-乙腈-水梯度洗脫時(shí)，峰形、分離效果均最佳。

3.3提取溶劑選擇

木脂素屬極性偏大的化學(xué)成分。以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的總提取率為考察指標(biāo)，分別用甲醇、乙醇及二者不同比例的水溶液進(jìn)行提取。結(jié)果表明，以90%甲醇為提取溶劑時(shí)，目標(biāo)物的總提取率最高，且提出的色素等雜質(zhì)的含量較少。

3.4提取方法選擇

選定提取溶劑后，考察了超聲提取20 min、30 min、40 min，回流提取30 min、40 min、50 min，以及浸漬法等方法的提取效果。結(jié)果表明，超聲提取30 min為最優(yōu)的提取方法。

3.5檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

采用DAD檢測(cè)器對(duì)樣品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，采集光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各目標(biāo)物質(zhì)在220 nm均有較好的吸收，因此選擇220 nm作為最終檢測(cè)波長(zhǎng)。

本文建立了同時(shí)測(cè)定五味子中4種木脂素成分的HPLC分析方法。方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡(jiǎn)單高效，可為五味子藥材的質(zhì)量控制提供參考。12個(gè)不同產(chǎn)地的五味子藥材中4種木脂素成分的含量的RSD為0.76%～3.28%，總提取率的RSD值為3.70%，表明各藥材所含木脂素成分存在一定差異，這可能與藥材產(chǎn)地的地質(zhì)、水源及氣候條件有關(guān)，更確切的原因以及由不同產(chǎn)地藥材木脂素成分的差異引起的藥理藥效上的不同需要進(jìn)一步分析研究。

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【作者簡(jiǎn)介】

唐琪，女，1996年出生，碩士，研究方向?yàn)榻】迪嚓P(guān)物質(zhì)分析。通訊作者：徐小娜，女，1974年出生，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閺?fù)雜體系多組分成分分離分析。聯(lián)系電話：0773-3680605。

（編輯：侯睿琪）