辣椒油中罌粟堿標準樣品的制備與定值

張信仁，張云，陳澤宇，劉正才

（1.三明海關綜合技術服務中心，福建 三明 365000；2.福州海關技術中心，福州 350001）

標準樣品是集科研與標準于一體的，具有均勻性、穩(wěn)定性、準確性和溯源性的實物標準[1]。標準樣品在測量系統(tǒng)校準、測量程序評估、給其它材料賦值和質量控制[2]、保證分析方法的準確性及可溯源性等方面具有重要作用[3]。標準物質分為純品標準物質和基體標準物質[4]兩類，標準樣品可有效避免基體效應對物質成分分析的影響，能滿足校準檢測的實際需求，適用于食品分析方法的確認和質量控制，對于確保食品檢驗分析的準確性和有效性具有重要意義[5]。

罌粟殼為罌粟科植物罌粟采完鴉片后的干燥成熟果殼，具有一定的成癮性，標志性成分為罌粟堿、那可丁、可待因、嗎啡、蒂巴因等生物堿[6]，是國家嚴格控制的藥用物質，嚴禁食品中非法添加，也是國家食品安全重點監(jiān)查項目[7]。然而一些不法商販為了謀取高額利益，將罌粟殼或其浸提物添加到食品中使消費者食用后容易上癮，以達到吸引消費者的目的[8]，極大地危害人民群眾的身體健康。因食品基體復雜多樣，需要有對應的基質標準樣品或質控樣來檢測校準，才能保證檢測結果的準確性或滿足要求[9]，由此可見基質標準物質對于檢驗檢測至關重要，直接影響測量數(shù)據(jù)的準確性和可靠性，從而影響到此類案件的查處。雖然國家一級、二級標準物質已在國內外各領域得到廣泛應用[10]，但是目前涉及的食品安全檢測基體標準物質在非法添加物領域取得有證編號的僅有10個批號，5種物質[11]，未見食品基質中罌粟堿標準樣品的相關研究報道。筆者以辣椒油為基質，加入一定量的鹽酸罌粟堿標準品，研制了辣椒油中罌粟堿標準樣品，該標準樣品可用于火鍋食品系列中罌粟堿檢測的方法驗證和質量控制。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：LC-30A 型，日本島津公司。

三重四極桿質譜儀：AB3500 型，美國AB SCIEX公司。

冷凍臺式高速離心機：Allegra 64R 型，美國Beckman Coulter公司。

超純水機：Milli-Q Reference 型，美國密理博公司。

電子分析天平：XS204型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

脈動式多管渦旋振蕩器：HMV-50A 型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

旋渦混合器：XW-80 A 型，上海精科實業(yè)有限公司。

鹽酸罌粟堿標準品：純度(質量分數(shù))不小于99.9%，美國CATO標準品公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國默克公司。

無水乙酸鈉、無水硫酸鎂：分析純，西隴科學股份公司。

1.2 標準樣品制備

在辣椒油樣品中加入一定濃度和比例的鹽酸罌粟堿標準品，充分振蕩混勻后，采用帶密封蓋的棕色玻璃瓶分裝，并粘貼對應的標識，每瓶獨立樣品分裝25 g左右。所制得的標準樣品與實驗室日常檢測樣品基本一致，于-18 ℃冰箱中存儲，短期可常溫下儲存與使用。

1.3 測定方法

參考國家市場監(jiān)管總局公告〔2018年第3號〕附件1 (BJS 201802)[12]，以液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，以色譜峰面積外標法定量，罌粟堿檢測離子對質荷比為304.4/202.0(定量)，304.4/171.1(定性)。

1.4 樣品均勻性檢驗

隨機抽取15 份獨立包裝的樣品進行均勻性檢測，對抽取的每瓶樣品，在重復條件下測定3 次，采用單因素方差分析(F檢驗)法對測定結果進行統(tǒng)計分析，以檢驗樣品的均勻性。

1.5 樣品穩(wěn)定性檢驗

包含長期穩(wěn)定性檢驗和短期穩(wěn)定性檢驗，所用的人員、設備、方法及實驗條件與均勻性檢驗相同。長期穩(wěn)定性共進行了26個月，按照先密后疏的原則每間隔一定時間隨機取樣1次，每瓶樣品重復檢驗3次，采用平均值作為檢測結果進行統(tǒng)計分析；短期穩(wěn)定性通過模擬運輸條件，將穩(wěn)定性測試結果的平均值與均勻性測定結果的平均值進行比較，采用F檢驗法評定樣品的穩(wěn)定性。

1.6 樣品定值及不確定度分析

標準樣品由9個通過資質認定的實驗室協(xié)同定值，檢測數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗[13?14]、柯克倫(Cochran)檢驗及格拉布斯(Grubbs)檢驗[15]后取平均值進行定值。

參照國家標準GB/T 15000.3—2008[16]，通過建立有效的數(shù)學模型，對各種不確定度分量進行定量，利用相對標準不確定度進行分布計算和整體合成，通過推導計算，給出火鍋食品(辣椒油)中罌粟堿含量的擴展不確定度。

2 結果與討論

2.1 基質樣品選擇

為了使標準樣品基質與實際檢測樣品接近一致，盡量消除基質干擾和基體效應引入的系統(tǒng)誤差[17]，選擇火鍋食品底料中辣椒調味油陰性樣品，經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，去除火鍋殘渣和辣椒籽后澄清辣椒調味油；也可選擇市售的辣椒油或調和油，但是成分相對較單純，與實際檢測樣品(成分較為復雜)基質會有偏差。

2.2 均勻性檢驗

在充分振蕩混勻后的辣椒油標準樣品分裝前，隨機選取上、中、下層的3 份樣品進行均勻性初測，然后在已分裝好的樣品中隨機抽取15 份獨立包裝樣品，以每瓶樣品3次重復測試數(shù)據(jù)為一組，共15組45 個數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析法(F檢驗)檢驗樣品的均勻性。計算F值，查F分布臨界值Fa，若樣品F＜Fa，則表明樣品內和樣品間無顯著性差異，樣品是均勻的。均勻性檢驗方差分析結果見表1。結果表明，在95%的置信區(qū)間內，F(xiàn)＜F0.05，因此組間和組內不存在顯著性差異，辣椒油中罌粟堿標準樣品均勻性良好。

表1 辣椒油中罌粟堿標準樣品均勻性檢驗方差分析結果

2.3 穩(wěn)定性檢驗

2.3.1 短期穩(wěn)定性

模擬樣品運輸極端條件進行短期穩(wěn)定性檢驗，將獨立包裝的樣品分別置于-18、4、25 ℃環(huán)境以及室外條件下保存14 d后測定；取獨立包裝樣品分別郵寄至北京和深圳往返4～6 d，取樣檢測，每個樣品重復測試3 次，考察其短期穩(wěn)定性。對檢測結果及均勻性數(shù)據(jù)同時采用F檢驗法，進行單因素方差分析，分析結果見表2。結果表明，當顯著水平α=0.05時，樣品F＜Fα(臨界值)，其結果均未見顯著差異，表明所研制的辣椒油基體標準樣品短期是穩(wěn)定的。

表2 辣椒油中罌粟堿標準樣品短期穩(wěn)定性方差分析結果

2.3.2 長期穩(wěn)定性

進行了26 個月長期穩(wěn)定性考察。按照先密后疏的原則，每間隔一定時間抽取獨立包裝的樣品，每個樣品重復測試3次。長期穩(wěn)定性測定結果及F檢驗法檢驗、統(tǒng)計結果分別見表3和表4。采用F檢驗法檢驗一元線性回歸模型的顯著性(以Fs表述)，通過計算F來評估回歸的顯著性。對于95%的置信水平，罌粟堿的Fs≥0.05，表示回歸不顯著，表明所研制的標準樣品在26 個月內是穩(wěn)定的。目前該標準樣品的穩(wěn)定性實驗仍在繼續(xù)監(jiān)控。

表3 辣椒油中罌粟堿標準樣品長期穩(wěn)定性檢驗測定結果

表4 辣椒油中罌粟堿標準樣品長期穩(wěn)定性回歸統(tǒng)計分析結果

2.4 定值

2.4.1 定值實驗室選擇

標準樣品采用多實驗室協(xié)同定值的方案，參加協(xié)同定值的具有CMA(中國計量認證)資質的實驗室有石家莊海關技術中心(編號001)、昆明海關技術中心(編號002)、廈門海關技術中心(編號003)、重慶海關技術中心(編號004)、福建中檢華日有限公司(編號005)、福州海關技術中心(編號006)、天津海關動植物與食品檢測中心(編號007)、三明海關綜合技術服務中心(編號008)、南昌海關技術中心(編號009)。每個實驗室測定3 個樣品，每個樣品平行測定2次，共計54個檢測值。罌粟堿室外協(xié)同定值結果見表5。

表5 辣椒油中罌粟堿標準樣品室外協(xié)同定值結果

2.4.2 離群值檢驗

為保證各實驗室的檢測值無異常值，依次采用正態(tài)分布檢驗的偏態(tài)系數(shù)和峰態(tài)系數(shù)法、柯克倫(Cochran)檢驗及格拉布斯(Grubbs)檢驗進行檢驗。

正態(tài)分布檢驗采用偏態(tài)系數(shù)和峰態(tài)系數(shù)法，置信概率P=0.95，測量次數(shù)n=54，經(jīng)計算偏態(tài)系數(shù)A=0.136，峰態(tài)系數(shù)B=2.535，查表得A1=0.53，B1=2.15，B1′=3.99，則A＜A1，B1＜B＜B1′，表明該組測量數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。

柯克倫檢驗結果：當p=9，n=6時，查表得C0(5%)=0.328 5，計算C值為0.233 2，則C＜C0(5%)。

格拉布斯檢驗結果：當p=9 時，單值G1(5%，9)=2.215，G1(1%，9)=2.387，計算G11=2.206，G1p=2.311，則G11＜G1(5%，9)；雙值G2(5%，9)=0.149 2，G2(1%，9)=0.085 1；計算G21和G2p值分別為0.840 3 和0.819 7，則G21＞G2(5%，9)，表明9家實驗室對辣椒油基體中罌粟堿的檢測數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，結果無異常值，均可參與后續(xù)檢驗，所有單元的數(shù)據(jù)均可參與定值。

2.4.3 定值結果

數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗、柯克倫檢驗及格拉布斯檢驗，所有單元的數(shù)據(jù)均可保留并參與最終定值，即協(xié)同定值實驗室提供結果的平均值，結果為39.4 μg/kg。

2.5 溯源性

根據(jù)標準物質在空間上必須具有溯源量值的功能[18]。以有證標準物質配制的罌粟堿標準溶液制作校準曲線；測量前對所有計量儀器(分析天平、容量瓶、移液槍等)進行了校準，并考慮其示值不確定度；具有資質的9 家實驗室協(xié)同定值，保證了結果的準確性和溯源性。

2.6 不確定度評定

定值結果的擴展不確定度UCRM參照GB/T 15000.3—2008 評定。由于標準樣品采用郵政網(wǎng)絡協(xié)同定值，因短期運輸所引入的標準不確定度usts已包含在各實驗室的檢測值中，不用再單獨計算。故標準品的不確定度來源由3 部分組成：定值標準不確定度uchar、瓶間標準不確定度ubb、長期穩(wěn)定性標準不確定度ults。各項不確定度計算結果見表6。

表6 辣椒油中罌粟堿標準樣品量值不確定度計算結果

在置信水平為95%時，k=2，將表6 數(shù)據(jù)代入下式計算擴展不確定度：

計算得UCRM=1.52 μg/kg。標準值由定值的總平均值與擴展不確定度組成，則辣椒油中罌粟堿標準樣品的定值結果為(39.4±3.0) μg/kg.

3 結語

建立了火鍋食品基質(辣椒油)中罌粟堿標準樣品的制備方法。由9 家通過資質認證的實驗室采用液相色譜-串聯(lián)質譜法協(xié)作定值，量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好，罌粟堿特性值為(39.4±3.0)μg/kg。利用該方法制備的標準樣品(質控樣)對檢測過程的質量控制、檢測結果的準確性，對相關標準物質的研發(fā)、生產(chǎn)、制備以及確保食品安全均具有重要意義。