斑褐孔菌子實體化學成分的分離鑒定及生物活性研究

吳曉鵬　李冉　馬青云　楊理　謝晴宜　戴好富　趙友興

關(guān)鍵詞：斑褐孔菌；子實體；化學成分；分離鑒定；生物活性

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A

斑褐孔菌[Fuscoporia punctata （Fr.） Cunn]屬于多孔菌科（Polyporaceae）褐孔菌屬（Fuscoporia），常寄生在櫟、槭及其他闊葉樹的樹皮和腐木上，可引起木材白色腐朽，主產(chǎn)于河北、吉林、江蘇、陜西以及海南等地[1]。斑褐孔菌是海南重要的大型藥用真菌資源，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效，民間用于治療心絞痛、心律失常、月經(jīng)不調(diào)和冠心病等，能起到降壓和改善心功能的作用。現(xiàn)代藥理研究表明，斑褐孔菌具有保護心律失常和抗腫瘤的作用[2-3]。但關(guān)于斑褐孔菌的藥效物質(zhì)基礎尚無報道，其子實體的化學成分及其生物活性的研究鮮有報道，僅對發(fā)酵培養(yǎng)得到的斑褐孔菌菌絲體和野生斑褐孔菌子實體中的黃酮進行過含量測定[4]。

為了進一步明確斑褐孔菌子實體的藥效物質(zhì)基礎和化學成分組成，本研究對斑褐孔菌子實體的乙醇提取物的活性物質(zhì)進行分離純化，采用活性追蹤的方法對乙醇提取物采用多種色譜技術(shù)進行分離，通過NMR 和MS 等技術(shù)確定化合物成分，對7 個聚酮類成分（1～7）進行PTP1B 抑制活性測定、α-葡萄糖苷酶抑制活性測定和清除DPPH 自由基的測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑褐孔菌樣品 斑褐孔菌子實體于2016年6 月采自海南省瓊中縣，由海南醫(yī)學院曾念開教授鑒定為斑褐孔菌[Fuscoporia punctata （Fr.）Cunn]，憑證標本（No. 2016ZBHKJ）存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所?？谑袩釒烊划a(chǎn)物研究與利用重點實驗室。

1.1.2 儀器與試劑 化合物的核磁共振數(shù)據(jù)由Bruker DRX-500 核磁共振光譜儀測定，TMS 為內(nèi)標；質(zhì)譜由API Qster Pulsar 質(zhì)譜儀測定；凝膠色譜采用GE Biosciences 公司的Sephadex LH-20；正相柱色譜用硅膠（200～300 目）和薄層色譜硅膠GF₂₅₄均為青島美高有限公司生產(chǎn)；反相硅膠ODS 為日本YMC 公司生產(chǎn)；Agilent 1260 分析型高效液相色譜儀購自Agilent 公司；半制備高效液相色譜儀（SUM-MITP680A，戴安，美國）；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均為天津市康科德科技有限公司產(chǎn)品；氘代試劑（德國Merck 公司）；Synergy H1 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；薄層色譜TLC 顯色劑為10% H₂SO₄乙醇顯色劑，噴后70 ℃烘烤。

1.2 方法

1.2.1 化合物萃取、分離與純化 斑褐孔菌干燥子實體3.5 kg 粉碎，用95%工業(yè)乙醇回流提取3次，每次4 h，過濾后濾液經(jīng)濃縮加水混懸，用石油醚萃取脫脂，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液濃縮至浸膏得乙酸乙酯部分65.6 g。乙酸乙酯萃取部分經(jīng)正相硅膠柱色譜[石油醚-乙酸乙酯（10∶1～0∶1， V/V）]梯度洗脫得到5 個餾分Fr1～Fr5。Fr.2（8.2 g）經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（5∶1～0∶1， V/V）為洗脫劑，梯度洗脫，得到6 個組分（Fr.2.1～Fr.2.6）。Fr.2.2（1.6 g）通過Sephadex LH-20 （ 甲醇） 得到Fr.2.2.1～Fr.2.2.4。Fr.2.2.1（209 mg）通過半制備型高效液相色譜儀，經(jīng)C18 半制備柱，以甲醇-水（55∶40，V/V）系統(tǒng)洗脫分離得到5（RT 9.9 min， 13.5 mg）。Fr.2.2.2（114 mg）通過反相硅膠柱色譜（甲醇-水系統(tǒng)，50∶50，V/V）洗脫后，得到化合物2（tR9.9 min，4.1 mg）。Fr.2.2.3（327 mg）通過半制備型高效液相色譜儀（乙腈-水系統(tǒng)，35∶65， V/V）分離制備得到化合物3（RT 9.2 min， 5.3 mg）、化合物6（RT 15.0 min， 7.2 mg）和化合物1（RT 11.0min， 10.8 mg）。Fr.2.2.4（89 mg）通過半制備型高效液相色譜儀（乙腈-水系統(tǒng)， 30∶70， V/V）分離制備得到化合物7（RT 18.8 min， 4.2 mg）。Fr.3（1.9 g）經(jīng)減壓C18 反相柱色譜，以甲醇-水（1∶5～1∶0， V/V）為洗脫劑，梯度洗脫，得到餾分再經(jīng)半制備型高效液相色譜儀（乙腈-水系統(tǒng)， 40∶60， V/V）分離制備得到化合物4（RT 8.0 min，16.3 mg）和12（RT 12.8 min， 1. 8 mg）。Fr.4（3.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜[石油醚-乙酸乙酯（2∶1， V/V）]和Sephadex LH-20[氯仿-甲醇（1∶1， V/V）]得到化合物8（11.2 mg）和化合物9（2.2 mg）以及Fr.4.1。餾分Fr.4.1（65 mg）經(jīng)半制備型高效液相色譜儀（甲醇-水系統(tǒng)，30∶70， V/V）分離制備得到化合物11（RT 14.2 min， 1.6 mg）和化合物10（RT10.8 min， 1.6 mg）。

1.2.2 生物活性測試 （1）蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制活性測定。采用文獻[5]報道的方法，對7 個聚酮類成分（1～7）進行PTP1B 抑制活性測定，以對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）作為反應底物，根據(jù)PTP1B 水解底物pNPP 得到的游離產(chǎn)物在405 nm 處有很強的光吸收，通過酶標儀在405 nm 處光吸收變化來觀察酶的活性變化以及化合物對酶的抑制作用。以正礬酸鈉作為陽性對照，不加蛋白稀釋液和正礬酸鈉作為空白對照。

用96 孔平板在酶標儀405 nm 測定吸光度，每個體系設置2 組重復， 每孔中依次加入50 μL2×reaction buffer、25.5 μL ddH₂O 和10 μL 蛋白稀釋液，置于酶標儀中37 ℃溫育5 min，再分別在每孔中加入待測化合物（化合物用DMSO 溶解），置于酶標儀中37 ℃溫育15 min，再分別加入12.5 μL pNPP 溶液，置于酶標儀中，在波長405 nm處每20 s 測1 次OD 值，測45 次。根據(jù)反應結(jié)果判斷待測化合物的抑制活性，抑制率大于50%時，設置濃度梯度進行復篩，測其IC50 值。通過抑制率對抑制濃度的非線性關(guān)系，計算出半數(shù)抑制濃度IC50 值。

（2）α-葡萄糖苷酶抑制活性測定。采用PNPG法[6]測定化合物1～7 的α-葡萄糖苷酶抑制活性。化合物均用DMSO 溶解配制成待測化合物溶液（5 mg/mL）。取70 μL 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）于96 孔板中，再分別加入20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（2 U/mL）和10 μL 待測樣品溶液。37 ℃溫育15 min 后加入20 μL pNPG 溶液（2.5 mmol/L），在37 ℃放置30 min 后加入80 μL Na₂CO₃終止液（0.2 mol/L）終止反應，反應總體系為200 μL。充分混勻后于405 nm 處用酶標儀檢測各孔吸光值。以阿卡波糖（反應終濃度為0.25 mg/mL）為陽性對照，DMSO（反應終濃度為0.5%）為陰性對照，實驗重復3 次。

按照公式計算化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率：抑制率=[（B-B₀）-（A-A₀）]/（B-B₀）′100%，式中，A 為實驗組平均吸光值，A0 為背景對照組平均吸光值，B 為陰性對照平均吸光值，B0 為空白對照平均吸光值。

（3）抗氧化清除自由基活性測定。采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法測定化合物1～7的抗氧化清除自由基活性[7]。DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，在乙醇溶劑中顯紫色，清除自由基的清除劑可以使DPPH 的單電子被接受，使紫色變淺，從而在最大波長時吸光值下降，以代表抗氧化清除自由基能力增強。100 mL 無水乙醇將0.0256 gDPPH 溶解后，冷藏備用，使用時乙醇稀釋10 倍。取50 mg/mL 的待測化合物10 μL 加到90 μL 無水乙醇中，在實驗中抗壞血酸（VC）作為陽性對照藥，以相同方法配制成5 mg/mL 的VC 溶液。分別取20 μL VC 溶液加入到陽性對照組和陽性背景組，20 μL 待測化合物溶液到空白組（A0）和實驗組（A），20 μL 10% DMSO-乙醇溶液到陰性對照組（B），陽性背景組和空白組均加180 μL 無水乙醇，其他組均加180 μL DPPH 溶液到96 孔板中，避光反應30 min，處于25 ℃環(huán)境中，在515nm 波長下得出每孔的OD 值，計算抗氧化自由基清除力， 計算公式為： 自由基清除率=[1-（A-A₀）/B]×100%，式中，A 為實驗組平均吸光值，A₀為背景對照組平均吸光值，B 為陰性對照平均吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+485，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C25H18O9，不飽和度為17。該化合物的1H-NMR譜有12 個信號，包括4 個單峰次甲基信號、5 個雙峰的次甲基信號、1 個單峰甲基信號和2 個多重峰次甲基信號；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有25 個碳信號，包括1 個甲基信號，11個次甲基信號，13 個季碳（其中1 個酮羰基和1個酯羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz，DMSO-d₆） δ： 1.93 （3H， s，CH₃-1′）， 5.63 （1H， s， H-5′）， 5.66 （1H， s， H-2′）， 6.52（1H， d， J=7.9 Hz， H-11′）， 6.65 （1H， d， J=2.7 Hz，H-7′）， 6.71 （1H， s， H-4）， 6.73 （1H， d， J=2.7 Hz，H-10′）， 6.78 （1H， m， H-12）， 6.81 （1H， d， J=15.9 Hz，H-6）， 7.01 （1H， m， H-13）， 7.08 （1H， s， H-9）， 7.32（1H， d， J=15.9 Hz， H-7）；

¹³C-NMR （125 MHz， DMSO-d₆） δ： 157.6 （s，C-1）， 98.0 （s， C-2）， 174.3 （s， C-3）， 94.5 （d， C-4），165.0 （s， C-5）， 115.9 （d， C-6）， 137.6 （d， C-7），126.4（s， C-8）， 114.3 （d， C-9）， 145.8 （s， C-10）， 148.3（s， C-11）， 115.9 （d， C-12）， 121.3 （d， C-13）， 16.4 （q，CH₃-1′）， 189.9 （s， C-1′）， 103.9 （d， C-2′）， 199.7 （s，C-3′）， 92.3 （s， C-4′）， 93.6 （d， C-5′）， 121.2 （s， C-6′），114.7 （d， C-7′）， 145.0 （s， C-8′）， 146.4 （s， C-9′），115.2 （d， C-10′）， 118.8 （d， C-11′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，鑒定該化合物為inoscavin A，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物2：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]⁺443，結(jié)合¹H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₂₃H₁₆O₈，不飽和度為16。該化合物的¹H-NMR譜有9 個信號，包括1 個單峰次甲基信號、1 個多重峰次甲基信號、6 個雙峰的次甲基信號、1 個單峰甲基信號和；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有23 個碳信號，包括1 個甲基信號，9個次甲基信號，13 個季碳（其中1 個酮羰基和1個酯羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， DMSO-d6） δ： 2.63 （3H， s，CH₃-1′）， 6.79 （1H， d， J=15.9 Hz， H-6）， 6.84 （2H， m，H-12，9′）， 6.98 （1H， d， J=8.0 Hz， H-13）， 7.06 （1H， d，J=3.0 Hz， H-9）， 7.09 （1H， m， H-10′）， 7.10 （1H， s，H-4）， 7.18 （1H， d， J=2.1 Hz， H-6′）， 7.23 （1H， d，J=15.9 Hz， H-7）；

¹³C-NMR （125 MHz， DMSO-d6） δ： 157.9 （s，C-1）， 107.8 （s， C-2）， 160.0 （s， C-3）， 95.2 （d， C-4），157.4 （s， C-5）， 116.2 （d， C-6）， 134.4 （d， C-7）， 126.9（s， C-8）， 113.9 （d， C-9）， 145.7 （s， C-10）， 147.9 （s，C-11）， 115.9 （d， C-12，9′）， 120.5 （d， C-13）， 32.0 （q，C-1′），196.6 （s， C-2′）， 117.4 （s， C-3′）， 153.7 （s， C-4′），119.0 （s， C-5′）， 114.4 （d， C-6′）， 145.4 （s， C-7′），147.5 （s， C-8′）， 119.3 （d， C-10′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，鑒定該化合物為inoscavin C，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物3：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]⁺375，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₁₉H₁₂O₇，不飽和度為14。該化合物的1H-NMR譜有8 個信號，包括3 個單峰次甲基信號、3 個雙峰的次甲基信號和2 個多重峰次甲基信號；根據(jù)13C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有19 個碳信號，包括8 個次甲基信號，11 個季碳（其中1 個酯羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， DMSO-d₆） δ： 6.77 （1H， d，J=8.1 Hz， H-12）， 6.81 （1H， d， J=16.0 Hz， H-6）， 6.97（1H， m， H-13）， 7.05 （1H， m， H-9）， 7.06 （1H， s， H-4），7.11 （1H， s， H-5′）， 7.19 （1H， s， H-2′）， 7.23 （1H， d，J=16.0 Hz， H-7）；

¹³C-NMR （125 MHz， DMSO-d₆） δ： 158.0 （s，C-1）， 103.9 （s， C-2）， 162.9 （s， C-3）， 96.0 （d， C-4），158.2 （s， C-5）， 116.6 （d， C-6）， 134.2 （d， C-7）， 127.1（s， C-8）， 113.7 （d， C-9）， 146.1 （s， C-10）， 147.5 （s，C-11）， 116.0 （d， C-12）， 120.5 （d， C-13）， 114.0 （s，C-1′）， 104.7 （d， C-2′）， 145.7 （s， C-3′）， 144.6 （s，C-4′）， 98.9 （d， C-5′）， 149.1 （s， C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，鑒定該化合物為phellibauminA，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物4：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+ 447，結(jié)合¹H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₂₂H₁₆O₉，不飽和度為15。該化合物的¹H-NMR譜有10 個信號，包括5 個單峰次甲基信號和5 個雙峰的次甲基信號；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有22 個碳信號，包括10 個次甲基信號、12 個季碳（其中1 個酮羰基和1 個羧基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD） δ： 6.18 （1H， s，H-4）， 6.61 （1H， d， J=15.9 Hz， H-6）， 6.68 （1H， d，J=8.3 Hz， H-12）， 6.75 （1H， d， J=8.3 Hz， H-5′）， 6.80（1H， d， J=8.3 Hz， H-6′）， 6.94 （1H， s， H-2′）， 6.92 （1H，m， H-13）， 7.02 （1H， s， H-9）， 7.32 （1H， d， J=15.9 Hz，H-7）， 7.77 （1H， s， H-7′）；

¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD） δ： 166.0 （s， C-1），101.1 （s， C-2）， 169.2 （s， C-3）， 101.5 （d， C-4）， 160.9（s， C-5）， 116.8 （d， C-6）， 137.2 （d， C-7）， 128.3 （s，C-8）， 114.8 （d， C-9）， 146.2 （s， C-10）， 148.6 （s，C-11）， 116.1 （d， C-12）， 122.0 （d， C-13）， 128.9 （s，C-1′）， 117.2 （d， C-2′）， 146.7 （s， C-3′）， 148.7 （s，C-4′）， 116.6 （d， C-5′） 124.7 （d， C-6′）， 145.6 （d， C-7′），120.0 （s， C-8′）， 171.0 （s， C-9′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，鑒定該化合物為phellibaumin D，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物5：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+445，結(jié)合¹H-NMR、13C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₂₃H₁₈O₈，不飽和度為15。該化合物的¹H-NMR譜有12 個信號，包括3 個單峰次甲基信號、4 個雙峰的次甲基信號、2 個雙雙峰的次甲基信號、1個雙雙峰的亞甲基信號、1 個單峰甲基信號和1個多重峰次甲基信號；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有23 個碳信號，包括1 個甲基信號，1 個亞甲基信號，9 個次甲基信號，12 個季碳（其中1 個酮羰基和1 個酯羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， DMSO-d₆） δ： 2.14 （3H， s，H-10′）， 2.84 （1H， dd， J=16.5， 4.3 Hz， H-8′a）， 3.07（1H， dd， J=16.5， 9.0 Hz， H-8′b）， 5.75 （1H， m， H-7′），6.32 （1H， s， H-4）， 6.58 （1H， s， H-5′）， 6.69 （1H， d，J=16.0 Hz， H-7）， 6.76 （1H， d， J=8.2 Hz， H-12）， 6.95（1H， dd， J=8.2， 2.3 Hz， H-13）， 7.03 （1H， d， J=2.3Hz， H-9）， 7.89 （1H， s， H-2′）， 7.22 （1H， d， J=16.0 Hz，H-6）；

¹³C-NMR （125 MHz， DMSO-d₆） δ： 160.0 （s，C-1）， 99.8 （s， C-2）， 162.3 （s， C-3）， 100.5 （d， C-4），158.1 （s， C-5）， 115.9 （d， C-6，12）， 134.6 （d， C-7），126.9 （s， C-8）， 114.0 （d， C-9）， 145.1 （s， C-10），145.7 （s， C-11）， 121.8 （d， C-13）， 120.6 （s， C-1′），111.4 （d， C-2′）， 145.4 （s， C-3′）， 147.6 （s， C-4′），111.9 （d， C-5′）， 116.6 （C-6′）， 74.3 （d， C-7′）， 48.4 （t，C-8′）， 205.3 （s， C-9′）， 30.3 （q， C-10′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，鑒定該化合物為inonotusinB，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物6：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+ 401，結(jié)合1H-NMR、13C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C21H14O7，不飽和度為15。該化合物的1H-NMR譜有10 個信號，包括3 個單峰次甲基信號、4 個雙峰的次甲基信號、2 個雙雙峰次甲基信號和1個多重峰次甲基信號；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有21 個碳信號，包括10 個次甲基信號，11 個季碳（其中1 個酮羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， DMSO-d₆） δ： 6.76 （1H， d，J=16.0 Hz， H-1′）， 6.78 （1H， d， J=8.3 Hz， H-7′）， 6.83（1H， d， J=8.2 Hz， H-5′′）， 6.95 （1H， dd， J=8.3， 1.9Hz， H-8′）， 7.04 （1H， s， H-4′）， 7.05 （1H， s， H-7）， 7.15（1H， dd， J=8.2， 2.1 Hz， H-6′′）， 7.17 （1H， d， J=16.0Hz， H-2′）， 7.19 （1H， s， H-3）， 7.20 （1H， m， H-2′′）；

¹³C-NMR （125 MHz， DMSO-d₆） δ： 155.9 （s，C-2）， 100.1 （d， C-3）， 158.1 （s， C-4）， 156.5 （s， C-6），95.7 （d， C-7）， 116.2 （d， C-1′）， 133.3 （d， C-2′）， 127.1（s， C-3′）， 113.8 （d， C-4′）， 145.7 （s， C-5′）， 147.3 （s，C-6′）， 115.9 （d， C-7′）， 120.2 （d， C-8′）， 120.2 （s，C-1′′）， 111.7 （d， C-2′′）， 145.8 （s， C-3′′）， 146.8 （s，C-4′′）， 116.4 （d， C-5′′）， 116.5 （d， C-6′′）， 110.8 （s，C-3a）， 160.4 （s， C-7a）。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，鑒定該化合物為phellifuropyranone A，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物7：黃色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+403，結(jié)合¹H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₂₀H₁₂O₈，不飽和度為15。該化合物的1H-NMR譜有12 個信號，包括3 個單峰次甲基信號和5 個雙峰的次甲基信號；根據(jù)13C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有20 個碳信號，包括8 個次甲基信號，12 個季碳（其中2 個酯羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， DMSO-d₆） δ： 10.82 （1H， s，HO-9）， 10.22 （1H， s， HO-8）， 9.66 （1H， s， HO-）， 9.25（1H， s， HO-）， 6.72 （1H， s， H-4）， 6.78 （H， d， J=8.2Hz， H-，）， 6.80 （1H， d， J=16.0 Hz， H-）， 7.28 （1H， d，J=16.0 Hz， H-）， 7.52 （1H， s， H-7）， 7.53 （2H， d，J=8.2 Hz， H-4′，8'）， 8.34 （1H， s ， H-10）；

¹³C-NMR （125 MHz， DMSO-d₆） δ： 159.7 （s，C-1）， 158.6 （s， C-3）， 98.9 （d， C-4）， 160.9 （s， C-4a），158.9 （s， C-6）， 111.6 （s， C-6a）， 114.6 （d， C-7）， 147.1（s， C-8）， 153.8 （s， C-9）， 110.6 （d， C-10）， 127.2 （s，C-10a）， 99.2 （s， C-10b）， 115.6 （d， C-1′）， 136.0 （d，C-2′）， 126.8 （s， C-3′）， 114.2 （d， C-4′）， 145.8 （s，C-5′）， 148.0 （s， C-6′）， 116.0 （d， 7′）， 121.1 （d， C-8′）。

以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，鑒定該化合物為phelligridin D，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物8：白色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+161，結(jié)合¹H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₇H₆O₃，不飽和度為5。該化合物的1H-NMR 譜有4 個信號，包括1 個單峰醛基信號、2 個雙峰的次甲基信號、1 個雙雙峰次甲基信號；根據(jù)13C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有7 個碳信號，包括3 個次甲基信號，4 個季碳（其中1 個醛羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD） δ： 6.21 （1H， d，J=2.0 Hz， H-2）， 6.42 （1H， dd， J=2.0， 8.8 Hz，H-6），7.42 （1H， d， J=8.8 Hz， H-5）， 9.67 （1H， s，-CHO）；

¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD） δ： 194.5 （d，CHO）， 135.4 （s， C-1）， 102.5 （d， C-2）， 146.2 （s， C-3），154.9 （s， C-4）， 109.6 （d， C-5）， 115.4 （d， C-6）。 以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，鑒定該化合物為原兒茶醛，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物9：無色針狀，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+ 133，結(jié)合¹H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₆H₆O₂，不飽和度為4。該化合物的1H-NMR 譜有4 個次甲基信號；根據(jù)13C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有6 個碳信號，包括4 個次甲基信號，2 個季碳。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD） δ： 6.67 （2H， d，J=8.2 Hz， H-3，6）， 6.79 （2H， m， H-4，5）；

¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD ） δ： 146.2 （s，C-1，2）， 116.2 （d， C-3，6）， 120.9 （d， C-4，5）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，鑒定該化合物為兒茶酚，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物10：白色針狀，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]⁺149，結(jié)合1H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₆H₆O₃，不飽和度為4。該化合物的1H-NMR 譜有3 個次甲基信號；根據(jù)13C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有6 個碳信號，包括3 個次甲基信號，3 個季碳。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD） δ： 6.42 （1H， t，J=7.8 Hz， H-5）， 6.31 （2H， d， J=8.1 Hz， H-4，6）；

¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD ） δ： 148.9 （s，C-1，3）， 134.2 （s， C-2）， 108.4 （d， C-4，6）， 120.4 （d，C-5）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，鑒定化合物為沒食子酚，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物11：白色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]⁺161，結(jié)合¹H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₇H₆O₃，不飽和度為5。該化合物的¹H-NMR 譜有4 個次甲基信號；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有7 個碳信號，包括4 個次甲基信號，3 個季碳（其中1 個酸羰基）。該化合物的H和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， CD3OD） δ： 7.77 （2H， d，J=8.4 Hz， H-2，6）， 6.76 （2H， d， J=8.4 Hz， H-3，5）；

¹³C-NMR （125 MHz， CD₃OD ） δ： 169.7 （s，COOH），122.5 （s， C-1）， 133.4 （d， C-2，6）， 116.5 （d，C-3，5）， 163.8 （s， C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，鑒定該化合物為對羥基苯甲酸，結(jié)構(gòu)式見圖1。

化合物12：白色粉末，質(zhì)譜的準分子離子峰ESI-MS positive m/z [M+Na]+ 185，結(jié)合1H-NMR、¹³C-NMR 和DEPT 譜信息可以確定其分子式為C₁₀H₁₀O₂，不飽和度為6。該化合物的1H-NMR譜有7 個信號，包括1 個單峰甲基信號和6 個雙峰的次甲基信號；根據(jù)¹³C-NMR 和DEPT 譜分析，該化合物有10 個碳信號，包括6 個次甲基信號，1 個甲基信號和3 個季碳（其中1 個酮羰基）。該化合物的H 和C 歸屬如下：

¹H-NMR （500 MHz， CD₃OD） δ： 2.29 （3H， s，H-4）， 6.56 （1H， d， J=16.2 Hz， H-1）， 6.76 （2H， d，J=8.2 Hz， H-3′，5′）， 7.45 （2H， d， J=8.2 H-2′，6′）， 7.54（1H， d， J=16.2 Hz， H-2）；

¹³C-NMR （125 MHz， CD3OD） δ： 146.5 （d，C-1）， 124.7 （d， C-2）， 201.7 （s， C-3）， 27.1 （q， C-4），131.6 （s， C-1′）， 127.1 （d， C-2′，6′）， 116.9 （d， C-3′，5′），151.6 （s， C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，鑒定該化合物為對羥基芐叉丙酮，結(jié)構(gòu)式見圖1。

2.2 化合物活性測定

2.2.1 PTP1B 抑制活性 研究表明，化合物1～7均具有PTP1B 抑制活性（表1），化合物2、3、4、5、7 的抑制率均大于60%，其中化合物4 的活性最高，化合物6 的活性最低。

2.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定結(jié)果見表2，結(jié)果表明，化合物1、2、3、5、6、7 均具有抑制活性，其中化合物2 的活性最強。

2.2.3 抗氧化清除自由基活性 化合物1～7 的抗氧化清除自由基活性測定結(jié)果見表3，研究結(jié)果顯示，除化合物1 的清除率在10%以下，其他化合物均表現(xiàn)出一定的活性，其中化合物4 清除自由基的IC50 值為6.71 μmol/L，濃度最低。

3 討論

3.1 斑褐孔菌子實體的化學成分

本研究綜合利用多種色譜技術(shù)首次對斑褐孔菌（F. punctata）子實體的乙醇提取物進行分離純化，通過質(zhì)譜和核磁技術(shù)等對分離出的單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果表明，從海南的斑褐孔菌子實體乙醇提取物中分離得到12 個化合物。分別鑒定為inoscavin A（1）、inoscavin C（2）、phellibaumin A（3）、phellibaumin D（4）、inonotusinB（5）、phellifuropyranone A（6）、phelligridin D（7）、原兒茶醛（8）、兒茶酚（9）、沒食子酚（10）、對羥基苯甲酸（11）和對羥基芐叉丙酮（12），這些化合物均為首次從斑褐孔菌中分離得到。本研究鑒定的化合物結(jié)構(gòu)類型主要為聚酮類和酚類成分，未發(fā)現(xiàn)前人測定的黃酮類成分[4]，這可能是因為采用比色法測定的黃酮是一大類具有類似吸收的成分，可能包括本研究中發(fā)現(xiàn)的聚酮類成分，也可能是黃酮類成分含量低未分離得到單體成分。此外，化學成分的積累也與該真菌的生長期有關(guān)，這需要進一步研究分析。

3.2 斑褐孔菌子實體中活性成分構(gòu)效關(guān)系分析

對于大型藥用真菌的活性研究，大部分研究者都集中在抗腫瘤和提高免疫力的研究中，這可能與大型藥用真菌普遍具有抗癌和提高免疫力的作用有關(guān)，其中的主要活性物質(zhì)是多糖類、甾類和萜類化合物。由于本研究得到的化合物主要是聚酮類化合物，所以降血糖和抗氧化是本研究活性測試的重點。

化合物1～7 為聚酮類化合物，對PTP1B 均有抑制活性，活性由高到低依次為4、5、7、3、2、1、6?；衔? 的活性最高可能是因為3 位的羥基處于活性狀態(tài)；化合物5 和7 的3 位羥基均參與成了六元環(huán)，且化合物5 的3 位羥基成了六元醚環(huán)，而化合物7 是六元酯環(huán)，這可能是影響活性的原因之一；化合物3、2、1 和6 的3 位羥基均成了五元醚環(huán)，且五元醚環(huán)上取代基越少活性越差，具體的作用機理有待進一步研究，后期可以根據(jù)聚酮類化合物的構(gòu)效關(guān)系，對化合物結(jié)構(gòu)進行針對性修飾，為開發(fā)治療糖尿病的藥物提供有價值的先導化合物。

在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面，除了化合物4 的活性較低外，其他6 個化合物均表現(xiàn)出不同的抑制活性，這可能與化合物4 的3 位羥基未成環(huán)有關(guān)，而其他化合物的3 位羥基均成環(huán)，而且化合物2 和7 的3 位氧能與環(huán)上或附近的羰基形成電子共軛，這可能是化合物2 和7 的抑制活性較高，IC50 值較低的原因，如要驗證此推論，還需要對化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，從而進一步明確構(gòu)效關(guān)系。

在清除自由基DPPH 方面，大部分聚酮類化合物均表現(xiàn)出較強的活性，這可能與該類化合物均含有4 個酚羥基有關(guān)，而化合物4 比其他化合物多1 個羥基，促使其清除DPPH 的IC50 值最低，但化合物5 的DPPH 自由基清除率小于10%，不具有活性，而有研究[19-20]發(fā)現(xiàn)化合物5 和2 對ABTS 自由基具有清除活性，就目前的實驗數(shù)據(jù)和構(gòu)效關(guān)系還無法解釋，還需進一步研究。

3.3 斑褐孔菌子實體中活性成分研究展望

通過本研究初步展現(xiàn)了海南斑褐孔菌的主要化學成分類型，挖掘了聚酮類化合物在抑制α-糖苷酶、PTP1B 和清除DPPH 自由基方面的藥理活性[21]，為后續(xù)研發(fā)治療糖尿病等的藥物提供先導化合物。但由于本研究得到的化合物的種類和數(shù)量較少，且生物活性測試模型有限，未進行更進一步的構(gòu)效關(guān)系研究。斑褐孔菌是海南重要的大型藥用真菌資源，在民間已作為健康食品廣泛使用。為科學詮釋斑褐孔菌的健康功效，后續(xù)應加大研究材料的量，分離鑒定微（痕）量或者新穎結(jié)構(gòu)的化學成分，獲得更多的化合物種類及數(shù)量，并采用高通量活性篩選評價化合物的多種生物功能，發(fā)現(xiàn)更多活性成分，對高含量的活性物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)改造與修飾，闡明藥理活性的物質(zhì)基礎及構(gòu)效關(guān)系，為進一步深度開發(fā)利用海南斑褐孔菌提供理論依據(jù)。