滋陰明目丸干預(yù)視網(wǎng)膜色素變性小鼠效應(yīng)及機(jī)制研究

曾梅艷 ，熊萌， ，仇婧玥， ，喻昶， ，歐晨 ，宋厚盼， ，彭清華， ， ，秦裕輝，

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；

3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是一類具有高度遺傳異質(zhì)性的視網(wǎng)膜變性疾病。視桿細(xì)胞受損是導(dǎo)致RP的主要原因，患者大多表現(xiàn)為視力逐漸下降或視野縮窄、夜盲，通常為雙眼患病且眼底表現(xiàn)對(duì)稱。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球約有150萬RP患者，西方國(guó)家發(fā)病率為1/4 000～1/3 000，我國(guó)發(fā)病率約為1/3 500[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚缺乏有效治愈或延緩RP進(jìn)展的方法。

穆勒細(xì)胞是哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，約占視網(wǎng)膜細(xì)胞總量的90%，因其在胚胎發(fā)育過程中與視網(wǎng)膜神經(jīng)元有共同的干細(xì)胞來源，因此與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞具有密切聯(lián)系[2]。穆勒細(xì)胞在維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用，其過度膠質(zhì)激活可引發(fā)視網(wǎng)膜興奮性毒性損傷，破壞視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境離子平衡，從而加速視網(wǎng)膜損傷，最終形成膠質(zhì)瘢痕，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)再生功能，加速RP進(jìn)程[3]。抑制穆勒細(xì)胞膠質(zhì)化是防治RP的重要手段。

RP屬中醫(yī)學(xué)“高風(fēng)雀目”“高風(fēng)內(nèi)障”“陰風(fēng)障”范疇。臨床實(shí)踐表明，中醫(yī)藥治療RP在提高患者視力與增加視野方面具有較好療效和潛在優(yōu)勢(shì)，同時(shí)對(duì)緩解患者不穩(wěn)定情緒和提高生活質(zhì)量具有積極意義[4]。滋陰明目丸是湖南中醫(yī)藥大學(xué)李傳課教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)研制，前期研究發(fā)現(xiàn)，該方能提高RP患者暗適應(yīng)B波振幅，降低視網(wǎng)膜黃斑中心凹厚度[5]。本研究探討滋陰明目丸對(duì)RP模型小鼠的干預(yù)效應(yīng)及對(duì)穆勒細(xì)胞膠質(zhì)化的影響，為滋陰明目丸臨床治療RP等眼底病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

4周齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠12只，4周齡SPF級(jí)rd10小鼠48只，雌雄各半，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，使用許可證號(hào)SYXK（湘）2018-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)1107271911002785。飼養(yǎng)于溫度23～25 ℃、濕度50%～55%環(huán)境，12 h/12 h明暗循環(huán)，自由攝食飲水。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（LLBH-202107210001）。

1.2 藥物及制備

滋陰明目丸（熟地黃、山藥、枸杞子、黃精、三七、川芎、當(dāng)歸、丹參、菟絲子、牛膝、石菖蒲等17味中藥組成），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，批號(hào)20211213。將藥丸置于研缽中研成粉末，以沸水溶解，攪拌均勻，制成濃度0.25 g/mL藥液。樂盯軟膠囊，廣州市范樂醫(yī)藥科技有限公司，0.5 g/粒，批號(hào)ABJ90400701。以市售花生油溶解，配制成0.008 g/mL藥液備用。復(fù)方托吡卡胺滴眼液，批號(hào)MP2228，參天制藥（中國(guó)）有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

SteadyPure 通用型RNA 提取試劑盒（批號(hào)A3A2084）、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑（批號(hào)A3A2044），艾科瑞生物有限公司；Pierceable Foil Heat Seal（批號(hào)1814040）、DG8 Cartridges for Droplet Generator（批號(hào)1000122527）、微滴生成油（批號(hào)64442314），美國(guó)Bio-Rad公司；蘇木素染液（批號(hào)CR2112051）、分化液（批號(hào)CR2112181）、返藍(lán)液（批號(hào)CR2112174）、伊紅染液（批號(hào)CR2202010）、 DAPI （批號(hào)CR2203098）、抗熒光淬滅封片劑（批號(hào)CR2202016）、Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（批號(hào)CR2205060），武漢賽維爾生物科技有限公司；中性樹膠（批號(hào)20211201），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）一抗（批號(hào)AI07253146），北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

Dante包埋機(jī)，意大利DIAPATH公司；YT-12K全自動(dòng)組織脫水機(jī)，湖北耀楚醫(yī)療器械科技有限公司；Galileo石蠟切片機(jī)，意大利DIAPATH公司；DMi8倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica公司；BA410E正置光學(xué)顯微鏡，廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司；nonmyd 7非散瞳眼底照相機(jī)，日本KOWA公司；MicronⅣ造影光學(xué)相干斷層掃描一體機(jī)，美國(guó)Phoenix Research Labs公司；Ganzfeld視網(wǎng)膜電圖儀，美國(guó)Phoenix Research Labs公司；QX200TM數(shù)字PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.4 分組及給藥

將12 只C57BL/6J 小鼠作為正常對(duì)照組，48 只rd10小鼠隨機(jī)分為模型組、樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組，每組12只。樂盯組予樂盯藥液0.15 g/kg灌胃，滋陰明目丸低、高劑量組分別予滋陰明目丸藥液4.50、9.00 g/kg灌胃，正常對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)30 d。

1.5 HE染色觀察視網(wǎng)膜組織病理變化

給藥結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只小鼠，腹腔注射1%戊巴比妥鈉4 mL/kg麻醉小鼠，75%乙醇消毒眼瞼周圍，摘取雙眼眼球，F(xiàn)AS眼球固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。依次將切片放入二甲苯、無水乙醇、75%乙醇、自來水中脫蠟至水。將切片放入蘇木素染液中染色5 min，水洗返藍(lán)，置于伊紅染液中染色5 min，無水乙醇、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖像，觀察視網(wǎng)膜組織病理改變。

1.6 視網(wǎng)膜電圖檢測(cè)視網(wǎng)膜功能

各組剩余6只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，置于37 ℃恒溫臺(tái)，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，采用視網(wǎng)膜電圖儀檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜功能。將參比電極接于兩耳間皮下，地電極接于尾部，金屬電極接于右眼角膜中央。記錄8.0×104cd/m2（持續(xù)時(shí)間1 ms）光強(qiáng)度刺激下的視網(wǎng)膜電圖反應(yīng)波形，每組測(cè)6個(gè)反應(yīng)波形，計(jì)算A波振幅和B波振幅。

1.7 眼底光學(xué)相干斷層掃描檢測(cè)

小鼠散瞳后以2.5%羥丙基甲基纖維素將角膜濕潤(rùn)，采用MicronⅣ造影光學(xué)相干斷層掃描一體機(jī)對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行檢測(cè)。調(diào)節(jié)恒溫臺(tái)高度，使鏡頭與角膜接觸，獲取眼底圖像并對(duì)全視網(wǎng)膜進(jìn)行掃描，分別于距視神經(jīng)乳頭（ONH）150、300、450 μm處測(cè)量視網(wǎng)膜全層厚度。

1.8 數(shù)字PCR檢測(cè)

眼科顯微鏡下鈍性分離視網(wǎng)膜，使用RNA提取試劑盒提取視網(wǎng)膜組織總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。數(shù)字PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μL、Supermix 10 μL、引物1 μL、DNase-free water 8 μL。采用QX200TM數(shù)字PCR儀微滴生成器制備反應(yīng)微滴。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，94 ℃、30 s，60 ℃、45 s，68 ℃、45 s，共45 個(gè)循環(huán)；98 ℃、10 min，4 ℃、10 min。于微滴分析器中測(cè)定每個(gè)微滴FAM熒光信號(hào)，計(jì)算GFAP mRNA表達(dá)量[6]。GFAP引物序列（5'～3'）：（上游）CAACGTTAAGCTAGCCCTGGACAT，（下游）CTCACCATCCCGCATCTCCACAGT，產(chǎn)物長(zhǎng)度124 bp。

1.9 免疫熒光檢測(cè)

將眼球組織石蠟切片依次放入二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水中脫蠟至水，采用EDTA抗原修復(fù)緩沖液于微波爐中對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)。以免疫組化筆在視網(wǎng)膜組織劃圈后加入自發(fā)熒光淬滅劑，胎牛血清封閉30 min。加入GFAP一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后加入Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h。滴加DAPI染液，室溫避光孵育10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組采集6張圖像，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光強(qiáng)度[7]。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，方差齊組間兩兩比較用LSD 法，方差不齊用Dunnett's T3法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋陰明目丸對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜病理改變的影響

正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)正常，內(nèi)核層和外核層染色均勻，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列緊密，視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞層排列整齊，分界清楚；模型組小鼠視網(wǎng)膜明顯損傷，視錐、視桿細(xì)胞層，外核層，外叢狀層厚度顯著變薄甚至消失；滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網(wǎng)膜損傷明顯改善，可見明顯的視錐、視桿細(xì)胞層，外核層和外叢狀層。見圖1。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)（HE染色，×400）

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度和外核層層數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度和外核層層數(shù)明顯增加（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜外核層層數(shù)和厚度比較（±s）

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜外核層層數(shù)和厚度比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

外核層層數(shù)12.00±0.63 3.17±0.75**6.50±1.05##6.33±1.03##7.33±0.82##組別正常對(duì)照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6外核層厚度/μm 52.38±2.53 14.27±2.65**33.52±2.82##30.48±1.60##34.60±3.91##

2.2 滋陰明目丸對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜功能的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜A波振幅、B波振幅明顯減小（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網(wǎng)膜A波振幅、B波振幅明顯增加（P＜0.01）。見圖2、表2。

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜A波振幅和B波振幅比較（±s，μV）

表2 各組小鼠視網(wǎng)膜A波振幅和B波振幅比較（±s，μV）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

B波振幅811.50±38.41 103.17±23.14**262.67±40.43##336.33±28.32##620.17±27.22##組別正常對(duì)照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6 A波振幅911.33±30.43 56.17±12.47**294.50±29.47##405.67±21.99##573.17±29.60##

圖2 各組小鼠視網(wǎng)膜電圖

2.3 滋陰明目丸對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜厚度的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜在3個(gè)測(cè)量點(diǎn)的厚度均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸高劑量組小鼠視網(wǎng)膜在3個(gè)測(cè)量點(diǎn)的厚度均明顯增加（P＜0.01）。見圖3、表3。

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜厚度比較（±s，μm）

表3 各組小鼠視網(wǎng)膜厚度比較（±s，μm）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組距ONH 450 μm 257.83± 5.91 153.67± 7.20**199.17± 8.70##162.83± 5.85 211.17±10.48##只數(shù)6 6 6 6 6距ONH 150 μm 228.17±6.11 137.17±4.79**187.67±6.25##144.17±5.78 194.17±5.98##距ONH 300 μm 246.17±7.52 146.17±7.60**193.67±7.92##150.17±7.28 206.67±6.56##

圖3 各組小鼠視網(wǎng)膜光學(xué)相干斷層掃描

2.4 滋陰明目丸對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA表達(dá)的影響

GFAP是視網(wǎng)膜穆勒細(xì)胞膠質(zhì)化的標(biāo)志蛋白。與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA平均拷貝數(shù)和總拷貝數(shù)均明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA平均拷貝數(shù)和總拷貝數(shù)均明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

只數(shù)總拷貝數(shù)1 356.17±33.17 2 360.33±58.59**1 604.83±55.80##1 721.83±65.10##1 428.17±57.30##組別正常對(duì)照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組6 6 6 6 6平均拷貝數(shù)67.33±3.20 118.67±9.54**80.05±1.94##86.33±3.61##71.50±3.94##

2.5 滋陰明目丸對(duì)模型小鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，樂盯組和滋陰明目丸低、高劑量組小鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見圖4、表5。

表5 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

平均熒光強(qiáng)度4.87±1.06 23.26±3.41**6.32±0.82##8.61±1.21##6.20±0.94##組別正常對(duì)照組模型組樂盯組滋陰明目丸低劑量組滋陰明目丸高劑量組只數(shù)6 6 6 6 6

圖4 各組小鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)（免疫熒光染色）

3 討論

RP是一種以視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞受累為主的遺傳性進(jìn)行性視網(wǎng)膜疾病，分為綜合征型和非綜合征型兩大類：前者發(fā)病過程可累及其他器官，導(dǎo)致功能障礙；后者發(fā)病部位主要在眼部，約占RP病例總數(shù)的80%[8]。盡管基因治療、干細(xì)胞治療、視網(wǎng)膜假體等新型治療手段已應(yīng)用于RP治療，但這些方法對(duì)不同患者療效差異較大，且存在價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)大等問題[9]。

先天稟賦不足、后天失養(yǎng)是導(dǎo)致RP的基本原因。先天不足多責(zé)之于腎臟虛勞，元陽匱乏。后天失養(yǎng)與脾胃虧虛、氣血不足、精血不能濡養(yǎng)目睛有關(guān)，病程日久，脈絡(luò)阻閉，神光衰微，視野縮窄、視力減退。RP核心病機(jī)為虛中夾瘀，以虛為本，絡(luò)脈瘀阻為標(biāo)，補(bǔ)虛活血、通絡(luò)明目是RP的關(guān)鍵治法。滋陰明目丸具有補(bǔ)虛滋陰、活血明目功效。課題組前期拆方研究發(fā)現(xiàn)，方中枸杞子、丹參配伍可抑制rd10小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，維持視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)視功能[10]。

rd10小鼠為RP最常用的動(dòng)物模型，該品系小鼠出生后17 d視網(wǎng)膜全層及外核層厚度均與正常小鼠接近，此后視網(wǎng)膜開始變性，相較于其他RP動(dòng)物模型，rd10小鼠視網(wǎng)膜變性開始的時(shí)間推后、變性速度減緩，能準(zhǔn)確地模擬RP發(fā)病過程[11]。本研究HE染色結(jié)果表明，rd10小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯損傷，外核層顯著變薄，予滋陰明目丸治療后，視網(wǎng)膜組織損傷得到明顯改善，外核層層數(shù)和厚度均顯著增加。視網(wǎng)膜電圖是檢測(cè)視網(wǎng)膜功能的常用方法，視網(wǎng)膜電圖A波可反映視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的功能，主要用于評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜能否正常接收光信號(hào)；B波可反映視網(wǎng)膜內(nèi)穆勒細(xì)胞和雙極細(xì)胞功能，主要用于評(píng)價(jià)光信號(hào)能否傳遞到大腦[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜功能明顯減弱，表現(xiàn)為A波振幅和B波振幅均顯著減少。經(jīng)滋陰明目丸治療后，模型小鼠A波振幅和B波振幅均顯著增加，提示滋陰明目丸能提高RP模型小鼠視網(wǎng)膜功能。

光學(xué)相干斷層掃描可對(duì)活體內(nèi)部形態(tài)進(jìn)行非侵入、無損傷、無接觸的檢測(cè)，獲取組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的橫斷面圖像，廣泛應(yīng)用于各?？祁I(lǐng)域，其中眼科疾病的診療方面應(yīng)用最為成功[13]。本研究采用該技術(shù)檢測(cè)滋陰明目丸對(duì)RP模型小鼠的作用效果，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜全層厚度顯著降低。給予高劑量滋陰明目丸治療后，在距離ONH 150、300、450 μm 3個(gè)測(cè)量點(diǎn)，小鼠視網(wǎng)膜全層厚度均顯著增加。

穆勒細(xì)胞是一類廣泛存在于視網(wǎng)膜中的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，與其他視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞具有共同的祖細(xì)胞。穆勒細(xì)胞的主要功能為支撐視網(wǎng)膜，為視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元提供代謝支持[14]。研究表明，穆勒細(xì)胞具有視網(wǎng)膜前體細(xì)胞屬性，可自我更新并分化成視網(wǎng)膜特異的神經(jīng)元，如視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞。因此，抑制穆勒細(xì)胞膠質(zhì)化、促進(jìn)其分化是治療RP 的重要途徑[15]。GFAP可特異性表達(dá)于視網(wǎng)膜穆勒細(xì)胞，當(dāng)穆勒細(xì)胞受損時(shí)，伴隨細(xì)胞膠質(zhì)化的發(fā)生，GFAP在穆勒細(xì)胞大量合成與堆積。采用數(shù)字PCR和免疫熒光法從分子水平檢測(cè)滋陰明目丸治療RP的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，模型組小鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，提示模型組小鼠視網(wǎng)膜穆勒細(xì)胞發(fā)生膠質(zhì)化。給予滋陰明目丸治療后，小鼠視網(wǎng)膜GFAP mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，提示滋陰明目丸能抑制穆勒細(xì)胞膠質(zhì)化。

綜上所述，滋陰明目丸可修復(fù)RP小鼠視網(wǎng)膜組織損傷，增加視網(wǎng)膜外核層和視網(wǎng)膜全層厚度，提升視網(wǎng)膜A波和B波振幅，改善視網(wǎng)膜功能，其分子機(jī)制與下調(diào)視網(wǎng)膜GFAP mRNA和蛋白表達(dá)、抑制視網(wǎng)膜穆勒細(xì)胞膠質(zhì)化有關(guān)。