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      納豆芽孢桿菌對肉仔雞生長性能、免疫功能及腸道健康的影響

      2023-07-12 09:30:52席燕燕王改利孫全友李紹鈺
      飼料研究 2023年10期
      關(guān)鍵詞:納豆仔雞盲腸

      王 丁 徐 彬 席燕燕 王改利 付 趁 孫全友 李紹鈺*

      (1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002)

      在動物生產(chǎn)中長期使用抗生素類藥物容易產(chǎn)生負面影響,如產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留、食品安全等問題[1],因此我國提出在飼料端禁止使用抗生素[2]。微生態(tài)制劑具有增強動物自身免疫力、改善飼料轉(zhuǎn)化率、維持動物健康快速生長等生物學(xué)功能[3-4]。納豆芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的一個亞種,屬于好氧菌中的非致病革蘭氏陽性菌[5]。納豆芽孢桿菌具有耐酸耐堿的特性,可在酸性胃環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性,進入腸道后產(chǎn)生的代謝物能夠抑制有害菌生長,調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)平衡,保障腸道正常功能運轉(zhuǎn)[6]。肉仔雞日糧中添加納豆芽孢桿菌可以顯著提高免疫器官指數(shù),增強肉雞免疫反應(yīng)[7]。發(fā)酵納豆芽孢桿菌能夠有效降低肉雞的料重比,提高腸道中乳酸桿菌的含量[8]。乳酸菌和芽孢桿菌聯(lián)用,可在不同程度上提高肉仔雞的飼料利用率,促進肉仔雞生長,提高法氏囊指數(shù),增強機體免疫功能[9]。目前,有關(guān)納豆芽孢桿菌的研究多集中于對肉雞生長性能及免疫作用的影響,關(guān)于其對腸道菌群影響的研究甚少。因此,本試驗在肉仔雞日糧中添加納豆芽孢桿菌,觀察其對肉仔雞生長性能、免疫功能及腸道菌群的影響,以期為納豆芽孢桿菌在肉仔雞的生產(chǎn)應(yīng)用中提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 試驗設(shè)計

      選取180 只1 日齡科寶肉仔雞隨機分為2 組,每組6個重復(fù),每個重復(fù)15只雞,對照組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗組在基礎(chǔ)日糧+300 mg/kg 納豆芽孢桿菌。試驗期42 d。試驗地點在河南大用實業(yè)有限公司,試驗雞由公司提供。試驗所用納豆芽孢桿菌購自日本株式會社目黑研究所,為灰棕色至黃棕色粉末。納豆芽孢桿菌含量≥1.0×1011CFU/g,推薦量為300 mg/kg。基礎(chǔ)日糧參照《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)進行配制,基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

      表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

      1.2 飼養(yǎng)管理

      采用三層籠養(yǎng),肉仔雞自由采食與飲水,環(huán)境溫度隨著日齡增加逐漸降低,每周下降2~3 ℃,從1日齡的32 ℃降到23 ℃并保持不變。按照雞場免疫程序進行接種。

      1.3 測定指標及方法

      1.3.1 生長性能

      試驗期間每周對試驗雞進行空腹稱重并詳細記錄耗料量,計算試驗肉雞的平均日采食量、平均日增重和料重比。

      1.3.2 血清免疫指標

      在肉仔雞21、42 日齡,從每個重復(fù)選取1 只雞翅靜脈采血,無抗凝血3 500 r/min 離心10 min,收集血清分裝于2 mL 離心管中,-20 ℃冷凍保存。血清用于測定免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)的含量,采用南京建成生物工程研究所試劑盒采用方法為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。

      1.3.3 空腸炎癥因子

      試驗肉仔雞采血后屠宰,取出腸道,縱向剪開空腸,用生理鹽水沖洗掉腸道內(nèi)容物,收集黏膜于凍存管中-80 ℃保存待測。稱取空腸黏膜,按重量體積比1 g∶9 mL的比例加入9倍體積的PBS(pH值7.4),使用勻漿器充分勻漿。2 000~3 000 r/min離心20 min,收集上清,-20 ℃冷凍,白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用南京建成生物工程研究所試劑盒使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。

      1.3.4 腸道菌群

      收集盲腸內(nèi)容物于無菌凍存管中,置于液氮中保存,用于微生物測定。根據(jù)DNeasy? PowerSoil? Pro Kit(QIAGEN)說明書對盲腸內(nèi)容物微生物群落進行總DNA抽提,使用NanoDrop 2000 檢測DNA 濃度并進行PCR 擴增,對回收純化后的產(chǎn)物構(gòu)建文庫并測序[10]。

      PCR 擴增體系(20 μL):5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物(5 μmol/L)0.8 μL、下游引物(5 μmol/L)0.8 μL、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng。

      德國ETAS(易特馳)集團為客戶提供用于汽車電控單元(ECU)開發(fā)和維護的各種集成工具和解決方案。作為一流的工具供應(yīng)商,易特馳始終提供創(chuàng)新、高質(zhì)量的產(chǎn)品,并針對ECU生命周期的各個階段提供解決方案。該公司2005年進入中國,為中國本土客戶提供全方位的服務(wù)以及個性化的解決方案。

      1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

      試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進行T 檢驗,Duncan's法進行多重比較。結(jié)果以平均值和標準誤表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。采用FASTP(version 0.20.0)軟件用于盲腸微生物原始測序序列的質(zhì)控,F(xiàn)lash(version 1.2.7)軟件拼接。根據(jù)97%的相似度對優(yōu)化序列進行OTU聚類,消除嵌合體,并統(tǒng)計不同水平下各樣品菌群結(jié)構(gòu)的組成。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 納豆芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響(見表3)

      由表3 可知,1~21 日齡,與對照組相比,試驗組肉仔雞平均采食量、平均日增重、料重比差異均不顯著(P>0.05)。22~42日齡,試驗組肉雞的平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)。1~42日齡,試驗組肉雞的平均日增重顯著高于對照組(P<0.05),肉雞42日齡體重顯著高于對照組(P<0.05)。

      2.2 納豆芽孢桿菌對肉仔雞血清免疫的影響(見表4)

      由表4 可知,與對照組相比,21 日齡和42 日齡試驗組肉仔雞血清IgA和IgG含量差異不顯著(P>0.05),IgM含量分別升高了37.63%、38.85%(P<0.01)。

      2.3 納豆芽孢桿菌對肉仔空腸炎癥因子的影響(見表5)

      表5 納豆芽孢桿菌對肉仔雞空腸炎癥因子的影響 單位:g/L

      由表5 可知,與對照組相比,21 日齡試驗組肉雞空腸黏膜IL-1β的含量下降21.97%(P>0.05),42日齡肉雞空腸IL-1β 的含量極顯著下降47.02%(P<0.01)。21、42日齡試驗組肉雞空腸黏膜IL-6、TNF-α的含量均有不同程度降低(P>0.05),IL-10 的含量具有一定程度的提高(P>0.05)。

      2.4 納豆芽孢桿菌對肉仔雞盲腸微生物區(qū)系的影響

      2.4.1 盲腸微生物α多樣性分析

      通過高通量測序分析最終獲得3 514 657 條有效序列,平均長度416 bp。按照97%相似性對非重復(fù)效序列進行OTU聚類分析,得到所有樣本平均聚類的OTU數(shù)目為648 個。對序列進行隨機抽樣并獲得對應(yīng)的數(shù)量構(gòu)建稀釋曲線,見圖1。

      圖1 稀釋曲線

      由圖1 可知,該曲線趨于平坦,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大并且樣本的測序數(shù)據(jù)量合理。

      納豆芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響見表6。由表6 可知,與對照組相比,試驗組肉雞腸道微生物多樣性有所提高。對照組和試驗組盲腸菌群測序覆蓋率達到99.87%,說明樣本中未檢測序列的概率很低。各組間42 日齡肉雞盲腸生物群落α 多樣性指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

      表6 納豆芽孢桿菌對肉仔雞盲腸菌群多樣性的影響

      2.4.2 盲腸微生物Beta多樣性分析(見圖2)

      圖2 盲腸微生物Beta多樣性分析

      由圖2 可知,根據(jù)樣品間距離,微生物群落有部分相似性,群落結(jié)構(gòu)相似度較高,分析表明對照組和處理組差異顯著(P<0.05),同組微生物具有明顯聚類。

      2.4.3 盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)分析(見圖3~圖5)

      圖3 42日齡盲腸菌群門水平相對豐度

      圖4 42日齡盲腸菌群屬水平相對豐度

      圖5 腸道微生物菌群屬水平組間差異

      由圖3 可知,對照組和試驗組肉仔雞盲腸菌群由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobaceteriota)和變形菌門(Proteobacteria)等菌門組成,是不同組別中菌群的主要組成成分,其中前4種微生物大約占群落總數(shù)的98%。

      由圖4 可知,對照組和試驗組肉仔雞盲腸菌群由另枝菌屬(Alistipes)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、未分類f_norank_o_梭菌目_UCG-014(norank_f_norank_o_Clostridia-UCG-014)、 未分類_f_毛螺菌屬(unclassified_f_Lachnospiraceae)、梭菌目vadin BB60 菌科的 norank_f_ 菌屬 (noramk_f__Clostridiales_vadin BB60_group) 、 瘤 胃 菌 屬(Ruminococcus_torques_group)、Barnesiella、巨單胞菌屬(Megamonas)、羅姆布茨菌(Romboutsia)、布勞特氏菌屬 (Blautia)、 雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium)、Shuttleworthia、 Colidextribacter、 考 拉 桿 菌 屬(Phascolarctobacterium)等其他菌門組成,是不同組別中菌群的主要組成成分,其中前10種微生物大約占群落總數(shù)的74%。

      由圖5 可知,試驗組Enorma、未分類_f_黃桿菌屬(norank_f_Flavobacteriaceae)、Paludicola顯著高于對照組(P<0.05)。

      3 討論

      3.1 納豆芽孢桿菌對肉仔雞生長性能的影響

      有研究發(fā)現(xiàn),納豆芽孢桿菌能夠降低肉仔雞腹部脂肪的堆積,顯著提高肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率[11]。本試驗結(jié)果表明,飼料中添加納豆芽孢桿菌可顯著提高肉仔雞平均日增重、降低料重比,與上述試驗結(jié)果一致,說明納豆芽孢桿菌能夠顯著提高肉仔雞的生長性能。

      3.2 納豆芽孢桿菌對肉仔雞血清免疫的影響

      IgM 是抗原刺激后產(chǎn)生的第一種抗體,可以通過殺菌、激活補體等作用提高機體免疫功能[12-13]。據(jù)報道,肉仔雞日糧中添加不同劑量復(fù)合益生菌后可顯著提高血清IgG和IgM含量[14]。張俊瑜等[15]研究發(fā)現(xiàn),肉雞日糧中加入不同水平的納豆芽孢桿菌均能夠提高血清IgG、IgM、IgA含量,與胥振國等[16]的研究結(jié)論一致。本試驗結(jié)果顯示,日糧中添加納豆芽孢桿菌提高肉仔雞血清IgA、IgG、IgM 含量,表明納豆芽孢桿菌對肉仔雞的機體免疫有一定的促進作用,可減輕肉仔雞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

      3.3 納豆芽孢桿菌對肉仔雞腸道炎癥的影響

      當病原菌進入腸道后,腸相關(guān)淋巴樣組織(gutassociated lymphoid tissue,GALT)釋放多種細胞因子(如白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等物質(zhì)),可有效避免有害病菌入侵,維持腸道健康[17]。細胞因子參與和介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)[18],根據(jù)細胞因子的作用可分為參與促進炎癥反應(yīng)的促炎因子(IL-6、IL-1β、TNF-α 等)以及具有緩解炎癥反應(yīng)的抗炎因子(IL-10、IL-4等)[19]。當機體發(fā)生炎癥時,機體內(nèi)促炎細胞因子IL-6、IL-1β含量升高,導(dǎo)致炎癥加劇[20]。趙會利等[21]發(fā)現(xiàn),將納豆芽孢桿菌與牛奶混合飼喂犢牛可降低斷奶犢牛IL-6和IL-1β 的含量,緩解犢牛的斷奶應(yīng)激,從而影響犢牛的生長發(fā)育。在本試驗中,納豆芽孢桿菌能夠降低肉仔雞腸道黏膜促炎因子IL-1β 的含量,從而調(diào)節(jié)肉仔雞腸道免疫系統(tǒng)保持穩(wěn)定。

      3.4 納豆芽孢桿菌對肉仔雞腸道菌群的影響

      腸道是動物機體的重要消化器官,包含大量的微生物。腸道微生物對機體的營養(yǎng)代謝、生長起重要作用,也是導(dǎo)致動物腸道免疫系統(tǒng)成熟的重要因素。因此,腸道微生物菌群的數(shù)量與結(jié)構(gòu)影響著動物機體的消化和健康。動物機體受到品種、日糧、所處環(huán)境尤其是胃腸道環(huán)境的變化時,能夠引起腸道微生物的變化,進而對動物機體產(chǎn)生影響,因此,動物機體與其腸道菌群之間存在共生關(guān)系[22-23]。

      腸道菌群α多樣性中,Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)反映了菌群的豐富程度,其值越大,菌群豐富度越大;Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了腸道菌群的多樣性,Shannon指數(shù)越大,Simpson指數(shù)越小,物種多樣性越大[24]。隨著腸道菌群的多樣性增加,腸道微生物群對入侵細菌的抵抗力也進一步增強,兩者呈正相關(guān)[25]。本試驗中,與對照組相比,試驗組肉仔雞盲腸中Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)均有不同程度的上升和下降趨勢,說明添加納豆芽孢桿菌能豐富腸道菌群多樣性。本試驗基于PCoA分析發(fā)現(xiàn),納豆芽孢桿菌改變了菌群結(jié)構(gòu)。腸道菌群結(jié)構(gòu)與動物生長、發(fā)育和健康存在密切聯(lián)系,對動物機體物質(zhì)代謝、營養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)和保護屏障等方面具有重要作用[26]。有研究顯示,添加芽孢桿菌可調(diào)節(jié)動物腸道菌群組成及維持腸道健康[27]。黃俊文等[28]研究發(fā)現(xiàn),添加納豆芽孢桿菌仔豬腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量上升,腸黏膜中乳酸桿菌數(shù)量上升且大腸桿菌數(shù)量下降。吳高峰等[29]對小鼠灌胃納豆芽孢桿菌溶液,結(jié)果顯示,腸道益生菌群(包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌等)顯著增多,腸道致病菌群(包括腸球菌、腸桿菌、變形桿菌等)均明顯減少。吳德華等[30]研究在仔犬日糧中添加納豆芽孢桿菌也得到了類似結(jié)果。鐘青萍等[31]研究發(fā)現(xiàn),納豆芽孢桿菌對一些常見的腸道致病菌也具有明顯的抑制作用,如沙門氏菌、大腸桿菌等。陳冬金等[32]研究表明,納豆菌復(fù)合組unclassified_o__Clostridiales的相對豐度顯著降低。楊利娜等[33]研究發(fā)現(xiàn),單胃動物盲腸中的微生物多樣性最高,其優(yōu)勢菌群主要有擬桿菌門與厚壁菌門。原因可能是納豆芽孢桿菌分泌抗菌物質(zhì),如吡啶二羧酸和多黏菌素抑制致病菌(如痢疾桿菌、原發(fā)性大腸桿菌、傷寒菌、沙門氏菌等)的生長,拮抗腸內(nèi)病原細胞,緩解腸道疾病[5,34-35]。本試驗結(jié)果顯示,在肉仔雞的腸道微生物中,厚壁菌門相對豐度最高,其次為擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門,上述均為優(yōu)勢菌群;在屬水平以另枝菌屬、糞桿菌屬、擬桿菌屬、未分類f_norank_o_梭菌目_UCG-014 為主,對照組Ruminococcaceae_UCG-010 顯著高于納豆菌處理組,提高了另枝桿菌的相對豐度,糞桿菌屬、擬桿菌屬的相對豐度有所降低,改變了肉仔雞盲腸優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)的占比,說明飼喂納豆芽孢桿菌能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群比例,改變?nèi)庾须u腸道菌群組成,進而提高了肉仔雞的生長性能。

      4 結(jié)論

      本研究結(jié)果表明,納豆芽孢桿菌可改善肉仔雞腸道菌群結(jié)構(gòu),提高腸道菌群豐富度和多樣性,增強機體免疫功能,進而提高肉仔雞生長性能。

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