高齡小鼠來源精原干細胞長期培養(yǎng)體系的建立*

湯瑞玲,范立青

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室,湖北 咸寧 437100;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生殖與干細胞工程研究所)

隨著全球進入后工業(yè)化時代,生育年齡推后,以及二胎政策的施行,高齡父親(advanced paternal age,APA)的生殖狀態(tài)及其對子代健康的影響已經(jīng)成為全球研究熱點。臨床人群研究顯示[1-3],高齡父親子代發(fā)生先天畸形、兒童腫瘤、智力低下、精神疾病如孤獨癥和精神分裂癥,以及不良孕產(chǎn)史的風(fēng)險大大增加。高齡雄性睪丸中精原干細胞(spermatogonial stem cell,SSC)發(fā)生的新發(fā)基因突變和表觀遺傳異常均可通過精子傳遞,從而導(dǎo)致嚴重的子代健康問題,稱為父親年齡效應(yīng)(paternal age effects,PAEs)[4-5];父親年齡超過35歲導(dǎo)致PAEs疾病風(fēng)險呈指數(shù)級增加;小鼠睪丸細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示8月齡SSCs即開始表達衰老相關(guān)基因[6-7]。目前SSC衰老研究集中于新生期和性成熟期小鼠來源的SSC體外長期培養(yǎng)造成的遺傳和表觀遺傳改變[8-9],直接來源于高齡小鼠睪丸SSC體外培養(yǎng)體系尚未見報道。本研究擬建立8月齡小鼠睪丸來源SSCs體外培養(yǎng)體系,可以完整保存SSCs發(fā)生衰老改變時的遺傳、表觀遺傳、基因表達特征,將為闡明高齡SSC衰老啟動時的遺傳和表觀遺傳調(diào)控機制提供有力的研究工具。

1 材料與方法

1.1 動物

6～8周齡成年雄性昆明白小鼠購自湖南史萊克景達有限責任公司,飼養(yǎng)于中南大學(xué)生殖與干細胞工程中心實驗動物房,用于實驗室正常小鼠繁殖配種,12h光照,12h黑暗,水食自由,所有實驗動物處理均遵循《實驗動物管理和使用指南》。5只6月齡小鼠停止配種后繼續(xù)飼養(yǎng)至8月齡用于本實驗。

1.2 試劑和儀器

StemPro-34 SFM培養(yǎng)基、高糖DMEM、100×MEM維生素、100xNEAA、100×丙酮酸鈉、100×ITS、FBS購自美國Gibco公司。Recombinant mouse GDNF購自美國Sigma公司、Recombinant mouse GDNF GFRa-1購自Sino Biological公司、Recombinant mouse bFGF、Recombinant mouse EGF和Recombinant mouse LIF均購于美國R&D公司。腐胺、D(+)葡萄糖、乳酸、維生素C、d-生物素、β-巰基乙醇購自Sigma公司。膠原酶IV、中性蛋白酶和0.05%胰酶/EDTA購自美國Gibco公司,透明質(zhì)酸酶和DNA酶購自美國Sigma公司,0.1%明膠購自美國Millipore公司,BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自美國Invitrogen公司,兔抗小鼠ThY-1多克隆抗體、兔抗小鼠PLZF多克隆抗體、兔抗小鼠c-KIT多克隆抗體、鼠抗OCT-4單克隆抗體均購自美國Santa Cruze公司,兔抗SCP3購自Abcam公司,驢血清、alexafluor 488標記驢抗兔二抗、alexafluor 488標記驢抗小鼠二抗購自美國Invitrogen公司,SP免疫組化試劑盒購自中國福建邁新公司。Trizol購自美國Invitrogen公司,RevertAid First Strand cDNA SyntHEsis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司,2×PCR Premix Taq購自日本Takara公司,江豐數(shù)字切片掃描儀購自中國江豐公司,體視光學(xué)顯微鏡購自德國蔡司公司,倒置相差熒光顯微鏡購自日本尼康公司,水套式二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高齡小鼠睪丸切片HE染色和IHC檢測PLZF表達

8周齡和8月齡昆明白小鼠脫頸致死,睪丸用Bouin固定液固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,切片厚度5μm;免疫組化(immunohisto-chemistry,IHC)染色:常規(guī)脫蠟至水,100mmol/L甘氨酸脫甲醛,3%過氧化氫消除內(nèi)源性生物素,正常羊血清封閉,1∶200稀釋兔抗PLZF抗體孵育過夜,生物素標記羊抗兔二抗室溫孵育10min,鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶室溫孵育10min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹脂封片。蘇木素伊紅(haematoxylin-eosin,HE)染色:常規(guī)脫蠟至水,蘇木素染色5min,0.1%鹽酸酒精分色5sec,自來水返藍20min,醇溶伊紅染色2min,中性樹脂封片。HE和IHC切片使用江豐數(shù)字切片掃描儀掃描,KF-Viewr閱片軟件截屏拍照。

1.3.2 三步酶消化法消化高齡小鼠睪丸獲取單細胞懸液

(1)配制消化酶。消化酶Ⅰ:6mL高糖DMEM加入5mg/mL膠原酶IV、2mg/mL透明質(zhì)酸酶;消化酶Ⅱ:6mL高糖DMEM加入2mg/mL膠原酶IV、2mg/mL透明質(zhì)酸酶、2mg/mL中性蛋白酶、100μg/mL Dnase I酶;消化酶Ⅲ:6mL 0.05%胰酶/EDTA加入100μg/mL Dnase I酶,0.22μm無菌過濾器4℃保存過濾備用。

(2)三步酶消化。脫頸處死8月齡雄性昆明白小鼠1只,取出雙側(cè)睪丸,去除睪丸白膜,在體式顯微鏡下用鐘表鑷分離精曲小管之間的間質(zhì)組織和血管,10mL PBS洗滌3次,將松散完整精曲小管移到15mL離心管中,加入6mL消化酶Ⅰ進行第一步消化:37℃水浴,30～40次/min震蕩消化10min,加入6mL高糖DMEM和2%FBS終止消化,靜置沉降5min共3次,吸棄上清中的間質(zhì)組織和細胞直至洗滌液清亮,5mL吸管輕輕吹吸精曲小管200次,800rpm離心2min。收集上清單細胞懸液,管底沉淀的精曲小管片段加入6mL消化酶Ⅱ進行第二步消化:37℃水浴,100次/min震蕩消化20min,加入600μL FBS終止反應(yīng),5mL吸管輕輕吹吸200次幫助精曲小管和細胞團塊解離,800rpm離心2min。收集上清單細胞懸液,10mL不含鈣鎂的DPBS洗滌管底的精曲小管殘跡和細胞團塊,1500rpm離心5min,管底沉淀的細胞團塊加入5mL消化酶Ⅲ進行第三步消化:37℃水浴,100次/min震蕩消化5min,加入600μL FBS終止消化,5mL吸管輕輕吹吸200次,直至細胞團塊完全解離,將第一、二、三步消化中收集的全部細胞懸液用200目無菌篩網(wǎng)過濾,1500rpm離心5min,10mL高糖DMEM和10%FBS洗滌,10mL含15%FBS的精原干細胞培養(yǎng)液重懸,細胞計數(shù)5.4×106個細胞,臺盼藍染色檢測細胞活性達95%以上。將細胞按9×105/cm2的密度接種到0.1%明膠預(yù)包被的6個60mm皿中,37℃ 5%CO2差異貼壁培養(yǎng)72h。

1.3.3 高齡小鼠精原干細胞原代培養(yǎng)

(1)配制小鼠精原干細胞培養(yǎng)液。StemPro-34 SFM加入StemPro專用補充物作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,逐次加入1×MEM維生素、1×NEAA、1×丙酮酸鈉、1×ITS、60μmol/L腐胺、6mg/mL D(+)葡萄糖、1μL/mL乳酸、100μmol/L維生素C、10μg/mL d-生物素、20ng/mL GDNF,400ng/mL GFRa1、20ng/mL EGF,10ng/mL bFGF,10ng/mL LIF、50μmol/L β-巰基乙醇,根據(jù)需要的濃度最后加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),0.22μm無菌過濾器過濾4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)CF-1小鼠來源胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層和條件培養(yǎng)基制備。小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)培養(yǎng)液由高糖DMEM添加10%FBS組成;液氮罐取出凍存的P2代CF-1小鼠來源MEF,解凍后加入MEF培養(yǎng)液10mL,接種到0.1%明膠預(yù)包被的100mm大皿,常規(guī)換液培養(yǎng)48h,以1∶4比例傳代,P3代換液常規(guī)培養(yǎng)3～4d至細胞鋪滿皿底,PBS洗滌3次,加入配有10μg/mL絲裂霉素C的MEF培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)2.5h。洗滌、消化、離心收集絲裂霉素C處理的P3代MEF,按3×106/管加入凍存液放入液氮中凍存,凍存液由9μL FBS和1μL DMSO組成。制備條件培養(yǎng)基時按1.5×106/9.5cm2接種密度鋪入6孔板中的1孔,加入2mL精原干細胞培養(yǎng)液,每隔24h收集條件培養(yǎng)基并更換新鮮精原干細胞培養(yǎng)液,7～10d后觀察飼養(yǎng)層細胞狀態(tài),如果不佳即丟棄。

(3)高齡小鼠精原干細胞原代培養(yǎng)。差異貼壁培養(yǎng)72h后,倒置顯微鏡下見5個60mm中皿貼壁體細胞約占皿底2/3,生殖細胞懸浮在培養(yǎng)液中,少量細胞相互積聚形成細胞團塊,收集上清生殖細胞,細胞計數(shù)2.2×106,以1.1×106接入鋪有密度為7.5×105/9.5cm2MEF飼養(yǎng)層的6孔板中2孔,加入2mL含10%FBS的精原干細胞培養(yǎng)液,37℃ 5%CO2培養(yǎng),翌日觀察到絕大部分生殖細胞已貼壁,僅少許懸浮細胞,隔日換液,每個培養(yǎng)孔加入MEF條件培養(yǎng)液和新鮮精原干細胞培養(yǎng)液各1mL,記為P0代。

(4)高齡小鼠精原干細胞的傳代培養(yǎng)。P0代細胞培養(yǎng)10d后,倒置顯微鏡下見6孔板2個孔的生殖細胞大量死亡,漂在培養(yǎng)液中,MEF飼養(yǎng)層上剩余的精原細胞堆積成大量小細胞團塊。每孔加入1mg/mL中性蛋白酶+1mg/mL膠原酶Ⅳ,37℃消化20min,輕輕吹吸皿底,至飼養(yǎng)層上的生殖細胞團塊完全脫落,皿底僅剩余部分飼養(yǎng)層細胞,等體積含有5%FBS的DMEM終止反應(yīng),1500rpm離心5min,按2∶2傳代,接入鋪有密度為5×105/9.5cm2MEF飼養(yǎng)層的6孔板中2孔,37℃ 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng),記為P1代;第10d觀察到精原細胞呈葡萄串狀聚集,可見多個包含20～50個細胞的精原干細胞克隆形成,1mg/mL中性蛋白酶+1mg/mL膠原酶Ⅳ消化傳代,傳代比例2∶3;從P1到P5代高齡小鼠SSC克隆增殖比較緩慢,傳代間隔為7～10d,傳代比例為2∶2或2∶3,在此期間保持精原干細胞培養(yǎng)液中15%FBS的濃度、CF-1來源MEF飼養(yǎng)層鋪皿密度5×105/9.5cm2,如果出現(xiàn)細胞2～3d不增殖時可加入新鮮解凍的MEF增加飼養(yǎng)層密度,或者加入MEF條件培養(yǎng)基,以促進高齡小鼠SSC克隆增殖;P6代以后高齡小鼠SSC克隆體外增殖處于穩(wěn)定狀態(tài),傳代間隔縮短至5～7d,傳代比例為1∶3,P6代開始將精原干細胞培養(yǎng)液中FBS以每周下降5%的梯度逐漸調(diào)整至5%,1周后再調(diào)整至1%,飼養(yǎng)層接種密度調(diào)整至2.5×105/9.5cm2,體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng)6個月,共傳13代,在傳代和實驗需要之外,將6孔板中每孔細胞加入由9μL FBS和1μL DMSO配制的凍存液,放入1個凍存管,置入液氮中保存。

1.3.4 高齡小鼠精原干細胞克隆的干性、精原干細胞標記物檢測

(1)AKP染色檢測SSC克隆的堿性磷酸酶活性。P10代SSC接種到4個孔內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)3d,第4d進行SSC克隆的AKP染色:吸棄培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛200μL室溫固定15min,雙蒸水200μL洗3次,每次10min,按照使用說明書配制BCIP/NBT染色液,加200μL染色液入培養(yǎng)孔,室溫孵育10～15min,吸棄染色液,用雙蒸水洗2次各2min,倒置顯微鏡觀察SSC克隆顏色變化,如果呈淺藍色可繼續(xù)加入染色液再染15～30min,雙蒸水洗滌3次,SSC克隆細胞呈深藍色時拍照。

(2)免疫熒光檢測SSC克隆的精原細胞標記物的蛋白表達情況。P10代SSC接種到4個孔內(nèi),常規(guī)培養(yǎng)3d,第4d進行SSC克隆的免疫熒光染色,吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液,400μL PBS洗滌3次,4%多聚甲醛200μL室溫固定30min,400μL PBS洗3次各10min,10%正常驢血清200μL室溫封閉30min,吸棄驢血清,分別加100μL一抗:ThY-1和cKIT兔抗多克隆抗體、OCT-4鼠抗單克隆抗體用10%驢血清按1∶50濃度稀釋,SCP3、PLZF兔抗多克隆抗體用含有0.5% TritonX-100的10%驢血清按1∶100濃度稀釋,陰性對照孔留置封閉液,4℃冰箱孵育過夜,400μL PBS洗3次各10min,加入1∶1000稀釋的alexafluor 488標記驢抗兔二抗100μL室溫避光孵育1h,400μL PBS洗3次各10min,1∶1000濃度DAPI復(fù)染細胞核3 min,400μL PBS洗滌1次5 min,倒置熒光顯微鏡觀察SSC克隆熒光染色結(jié)果并拍照。

(3)RT-PCR檢測SSC克隆的精原干細胞標記物mRNA表達情況。6孔板培養(yǎng)孔用4℃預(yù)冷PBS洗滌2次,1mL Trizol裂解液輕輕吹吸,移入1.5mL無核酶污染EP管內(nèi),冰上裂解10min,加0.2mL氯仿,按照Trizol使用說明書抽提RNA,溶于20μL DEPC水,測OD260/OD280,計算RNA濃度和純度,-80℃凍存;取1μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書冰上配制20μL反應(yīng)體系獲得cDNA,RT反應(yīng)程序為:42℃孵育60min;70℃孵育5min;4℃,+∞。取1μL cDNA為模板配制20μL PCR反應(yīng)體系,程序如下:95℃預(yù)變性5min(95℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s)×35循環(huán),72℃終延伸5min,4℃,+∞?；蛞镄蛄幸姳?。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖膠100V電泳15min分離,Gel Dox XR凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表1 RT-PCR檢測mRNA表達的引物序列

2 結(jié) 果

2.1 高齡小鼠睪丸內(nèi)精曲小管出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變

8月齡高齡小鼠睪丸大體形態(tài)與8周齡正常小鼠相似(圖1a),HE染色觀察到8月齡高齡小鼠睪丸出現(xiàn)精子異常的精曲小管:部分精曲小管內(nèi)出現(xiàn)各級生精細胞排列紊亂,偶見精曲小管僅保留Sertoli細胞和精原細胞而其他生精細胞均缺失(圖1b);IHC進行PLZF檢測顯示8周齡正常對照小鼠PLZFhigh表達于A型未分化精原細胞(a typeundifferentiated spermatogonia,Aun),PLZFlow表達于A型分化精原細胞(a type differentiating spermatogonia,Adiff),不表達于中間型分化精原細胞(intermediate type differentiated spermatogonia)(圖1c),8月齡高齡小鼠生精正常和生精異常精曲小管中均存在PLZFhighAun和PLZFlowAdiff精原細胞,同時PLZFPOS還表達于In分化精原細胞(圖1d)。

紅色三角:8周齡整體睪丸;藍色三角:8月齡整體睪丸;紅色箭頭:僅剩余基底膜側(cè)生精細胞的精曲小管;藍色箭頭:生精細胞排列紊亂的精曲小管;紅色無尾箭頭:精原細胞;藍色無尾箭頭:Sertoli細胞;紅色星號:PLZFhighA型未分化精原細胞;藍色星號:PLZFlowA型分化精原細胞;紫色星號:PLZFPOS中間型In分化精原細胞圖1 高齡小鼠的大體形態(tài)、HE染色和IHC檢測(Bar =100μm)

2.2 高齡小鼠單個整體睪丸經(jīng)過間質(zhì)預(yù)處理和三步酶消化解離成單細胞懸液

高齡小鼠難以成批獲取,我們只能進行單只高齡小鼠原代培養(yǎng),為盡可能多的獲取精原干細胞,我們需要優(yōu)化消化過程。在去除白膜后,消化前先用鐘表鑷機械分離小鼠睪丸間質(zhì)中的血管和結(jié)締組織,減少第一步消化時間,同時盡可能多的去除間質(zhì)組織和成纖維細胞。分離液中充滿離散的間質(zhì)組織團塊,未完全分離的血管殘端仍然附著在精曲小管上(圖2a);充分洗滌預(yù)處理的睪丸組織上清液中可見大量的間質(zhì)細胞和間質(zhì)組織團塊(圖2b);第一步膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化后,可見大量間質(zhì)組織從精曲小管壁完全脫落(圖2c);再次充分洗滌丟棄間質(zhì)組織和細胞之后,洗滌液中可見完整脫落的間質(zhì)血管(圖2d);洗滌后保留的精曲小管管壁光滑,懸浮液中殘存極少量間質(zhì)細胞(圖2e);將洗滌后收集的精曲小管反復(fù)吹吸之后,大量精曲小管斷裂崩解(圖2f);第二步膠原酶、透明質(zhì)酸酶和中性蛋白酶組合消化和吸管反復(fù)吹吸后,精曲小管完全解體,僅剩余少量未消化的細胞團塊(圖2g);第三步胰酶消化和吸管反復(fù)吹吸后,精曲小管基本完全解離,尚有極少量的小細胞團塊(圖2h);200目篩網(wǎng)過濾掉細胞團塊,至此高齡小鼠睪丸組織完全解離成單細胞懸液(圖2i)。

紅色箭頭:精曲小管;藍色箭頭:間質(zhì)血管;紫色箭頭:間質(zhì)組織;黑色箭頭:細胞團塊圖2 高齡小鼠消化前預(yù)處理精曲小管形態(tài)改變過程(Bar=100μm)

2.3 高齡小鼠的72h差異貼壁富集和原代培養(yǎng)

將消化解離的高齡小鼠睪丸單細胞懸液接種到0.1%明膠包被的6個60mm中皿,每隔24h觀察貼壁的體細胞密度,72h后貼附在皿底的體細胞約占皿底面積的1/2(圖3a),收集懸浮的生殖細胞并洗滌培養(yǎng)皿,可見皿底稀疏的貼壁體細胞(圖3b),將絲裂霉素C處理的MEF細胞按7.5×105/21cm2密度鋪皿作為高齡小鼠精原干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細胞(圖3c),將收集的生殖細胞以1.1×106/21cm2密度接種到飼養(yǎng)層上進行原代培養(yǎng),記為P0代(圖3d)。P0D10d可見生殖細胞集聚成葡萄串狀貼附在MEF飼養(yǎng)層上面,其中有少量有絲分裂旺盛的SSC來源子細胞緊密結(jié)合形成直徑<50μm小克隆(圖3e);P1D10d可見葡萄串狀的生殖細胞團塊數(shù)量減少,進入有絲分裂增殖的SSC數(shù)量增加,直徑增大,最大直徑約100μm(圖3f);P2D10日SSC克隆數(shù)量和克隆直徑進一步增加,最大SSC克隆直徑約200μm,僅剩余極少量未進入增殖狀態(tài)的原代生殖細胞,這些原代生殖細胞核直徑仍保持在10μm左右(圖3g);P3D10日可見SSC克隆數(shù)量和克隆直徑繼續(xù)增加,最大SSC克隆直徑約500μm,未觀察到原代生殖細胞(圖3h);P5D10可見SSC克隆處于穩(wěn)定增殖狀態(tài),細胞狀態(tài)良好(圖3i);P6代開始逐漸降低精原干細胞培養(yǎng)液中血清濃度和MEF飼養(yǎng)層鋪皿密度,P8D7(圖3j)P10D7(圖3k)和P13D5(圖3l)傳代過程中隨著殘留的老化MEF凋亡,培養(yǎng)皿中MEF密度逐漸降低,SSC克隆仍處于穩(wěn)定增殖狀態(tài),克隆細胞狀態(tài)良好。

紅色箭頭:葡萄串狀生殖細胞團塊;藍色箭頭:SSC克隆;綠色箭頭:未進入增殖狀態(tài)的原代生殖細胞圖3 高齡小鼠睪丸消化細胞中SSC差異貼壁富集、原代培養(yǎng)SSC克隆形成和傳代培養(yǎng)(Bar=100μm)

2.4 體外培養(yǎng)高齡小鼠SSC克隆具有堿性磷酸酶活性,表達精原干細胞標記物

免疫熒光檢測顯示高齡小鼠SSC克隆表達ThY-1、PLZF、OCT-4 3種未分化精原細胞標記蛋白(圖4a-i),不表達c-KIT分化精原細胞蛋白(圖4j-l)和SCP3精母細胞蛋白(圖4m-o);AKP染色顯示高齡小鼠SSC克隆表達堿性磷酸酶(圖4s);RT-PCR結(jié)果顯示高齡小鼠SSC克隆表達未分化精原細胞標記物Gfra1、Oct-4、Ssea-1 mRNA,也表達分化精原細胞標記物c-Kit mRNA和精母細胞標記物Scp3 mRNA(圖4t)。

a-r:免疫熒光,第一列代表SSC克隆抗體熒光染色,第二列代表SSC克隆DAPI復(fù)染,第三列代表SSC克隆明場形態(tài),Negative代表陰性對照;s:AKP染色;t:RT-PCR,Primer代表陰性對照圖4 免疫熒光、AKP染色和RT-PCR檢測高齡小鼠SSC克隆的干細胞活性和精原干細胞標記物在蛋白和mRNA水平的表達情況(Bar=100μm)

3 討 論

3.1 高齡小鼠睪丸微環(huán)境更有利于A型精原細胞增殖與存活

在正常睪丸發(fā)育過程中,PLZF高表達于Aun而弱表達于Adiff[10]。本研究IHC顯示在高齡小鼠睪丸中PLZF除了Aun與Adiff精原細胞之外,還表達于In分化精原細胞,提示高齡小鼠睪丸微環(huán)境可能促進cKITpos分化精原細胞的去分化,以及PLZFPOS的Aun和Adiff精原細胞存活和增殖,與文獻報道結(jié)果一致[11]。文獻研究結(jié)果表明,高齡小鼠睪丸微環(huán)境發(fā)生氧化應(yīng)激改變[12],導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高,ROS激活Myc基因表達,促進精原細胞增殖而使精曲小管內(nèi)其余生精細胞凋亡[13-14]。

3.2 通過優(yōu)化睪丸消化分離富集步驟,最大程度獲取單只高齡小鼠睪丸來源精曲小管和有活力的單細胞

8月齡高齡小鼠成批獲取較困難,本課題組選擇每次進行單只高齡小鼠的睪丸細胞消化富集和原代培養(yǎng)。根據(jù)前期經(jīng)驗,第一步消化時剪碎的精曲小管片段和消化下來的間質(zhì)細胞團塊比重相似,造成靜置沉降時精曲小管片段與間質(zhì)細胞團塊都沉降在管底,導(dǎo)致消化的單細胞中存在間質(zhì)成纖維細胞污染,需要經(jīng)歷多輪差異貼壁甚至多次傳代才能夠去除[15]。在本研究中,我們通過消化前機械去除間質(zhì)組織和血管,第一步消化分離殘留間質(zhì)組織同時保持精曲小管的完整性,提高靜置沉降時精曲小管與間質(zhì)的比重差,保證沉降的精曲小管純度,減少間質(zhì)成纖維細胞對SSC原代培養(yǎng)過程的污染[16-17]。

3.3 高齡小鼠來源SSC體外培養(yǎng)需要高密度飼養(yǎng)層、條件培養(yǎng)基和高濃度生長因子及胎牛血清支持

精原干細胞原代培養(yǎng)克隆形成與增殖能力和飼養(yǎng)層種類、飼養(yǎng)層密度、生長因子種類、生長因子濃度、血清濃度均有密切關(guān)系[18-19]。本課題組在單只高齡小鼠來源精原干細胞原代培養(yǎng)進行了優(yōu)化改進:采用CF-1小鼠來源胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)作為飼養(yǎng)層[18,20],提高MEF飼養(yǎng)層密度,填加條件培養(yǎng)基,提高胎牛血清與生長因子濃度,加入GDNF受體GFRa1可溶性成分,成功促進高齡小鼠SSC原代培養(yǎng)克隆形成并增殖傳代保持長達6月。

3.4 高齡SSC克隆是包含未分化和分化精原細胞的異質(zhì)性克隆

高齡小鼠體外培養(yǎng)的SSC克隆在逐漸降低胎牛血清濃度和飼養(yǎng)層密度后,可維持長期穩(wěn)定增殖,具有干細胞的堿性磷酸酶活性,免疫熒光染色顯示這些SSC克隆表達ThY-1、PLZF和OCT-4等A型精原細胞標記蛋白,不表達cKIT分化精原細胞和SCP3精母細胞標記蛋白;但是在mRNA水平,這些高齡小鼠來源SSC克隆除了表達Gfra1、Ssca-1、Oct-4等未分化精原細胞標記物之外,也表達c-kit分化精原細胞和Scp3精母細胞標記物;研究顯示[21-22],在精原細胞分化以及減數(shù)分裂啟動過程中主要涉及到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制,提示本研究中單只高齡小鼠來源SSC克隆是由未分化、分化精原細胞構(gòu)成的異質(zhì)性克隆,與文獻報道結(jié)果相符[23]。

總之,本研究通過在第一步消化中有效清除睪丸成纖維細胞,提高精原細胞接種密度、優(yōu)化飼養(yǎng)層和生長因子、FBS組合等措施,成功建立單只8月齡昆明白來源高齡小鼠的SSC體外長期培養(yǎng)體系,該SSC克隆可以長期穩(wěn)定傳代,具有干細胞活性,是一株同時表達未分化和分化精原細胞標記物的異質(zhì)性原代培養(yǎng)SSC細胞系。后續(xù)還需要進行SSC克隆同種異體移植進行功能表型鑒定,SSC轉(zhuǎn)錄組、表觀組學(xué)檢測將有利于我們深入理解高齡小鼠來源SSC的基因表達和表觀調(diào)控情況。本研究為高齡男性SSC的體外功能表型和分子機制研究提供一種新的細胞工具。