和厚樸酚抗結(jié)直腸癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及實驗驗證*

劉 靜,周 權(quán),葛娟娟,王德瑋,王希君,趙 元,朱 薿**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)工程與醫(yī)學(xué)影像學(xué)院)

結(jié)直腸癌是當(dāng)今世界致死率排名前三的癌癥類型,是最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床上治療結(jié)直腸癌的方式主要包括內(nèi)窺鏡和手術(shù)切除、放療、免疫治療、姑息性化療、靶向治療以及廣泛的手術(shù)和轉(zhuǎn)移灶的局部消融治療等,這些療法在一定程度上可延長結(jié)直腸癌患者的生存期[2]。但由于腫瘤耐藥性以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生,結(jié)直腸癌仍是目前醫(yī)學(xué)難以攻克的難題[3]。和厚樸酚(Honokiol)是中藥厚樸的活性成分之一,研究發(fā)現(xiàn)[4]和厚樸酚具有抗腫瘤、調(diào)控氧化應(yīng)激、抗菌、心臟保護、保肝、抗炎等多種生物學(xué)活性,也可顯著抑制結(jié)直腸癌增殖,但其機制不明。由此,本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究和厚樸酚抗結(jié)直腸癌作用機制,并細(xì)胞實驗驗證效果,為和厚樸酚對于結(jié)直腸癌的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞(LOT:CL-0144),結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞專用培養(yǎng)液(LOT:CM-0144)均選購于武漢普諾賽生命科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)用PBS(LOT:BL302A),0.25%胰蛋白酶(LOT:BL512A)、MTT粉末(LOT:BS186-1g)、二甲基亞砜(LOT:BS087-1000ml)均選購于白鯊公司;和厚樸酚(LOT:S31381)選購于上海源葉生物公司;CCL-170T-8型CO2培養(yǎng)箱(ESCO公司);SYNER-GY/HIX全自動酶標(biāo)儀(BioTek公司)。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1.1 和厚樸酚作用靶點篩選:以“Honokiol”為關(guān)鍵詞,通過篩選Genecards(www.genecards.org)、SwissTargetPrediction(http://swisstargetprediction.ch/index.php)數(shù)據(jù)庫得到和厚樸酚相關(guān)潛在作用靶點。

1.2.1.2 結(jié)直腸癌靶點篩選:在TCGA數(shù)據(jù)庫(www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)下載結(jié)直腸癌(Colon adenocarcinoma/Rectum adenocarcinoma Esophageal carcinoma,COADREAD)數(shù)據(jù),使用R語言中的“DESeq2”包數(shù)據(jù)分析,以p.adj<0.05 和|log2FC|>1為標(biāo)準(zhǔn),篩選出COADREAD的差異表達基因。COADREAD靶點和和厚樸酚預(yù)測靶點繪制韋恩圖,得到藥物-疾病共同靶點。

1.2.1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析:用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape(3.8.1)軟件Network Analyzer插件進行拓?fù)渲笜?biāo)分析,在cytoHubba插件中得到Top10的獲取和厚樸酚抗COADREAD的靶點核心靶點。

1.2.1.4 共同靶點富集分析:使用R語言“clusterProfiler”包和“org.Hs.eg.db”包對潛在(共同)基因進行KEGG(KEGG pathway)和GO(Gene Ontology基因本體)富集分析。以p.adj<0.05為篩選條件,并且用R語言繪制GO富集、KEGG氣泡圖。

1.2.1.5 “靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建:將和厚樸酚抗結(jié)直腸癌的作用靶點導(dǎo)入Cytoscape(3.8.1)軟件,根據(jù)富集通路分析結(jié)果,運用Cytoscape軟件構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 關(guān)鍵靶點分子對接分析

從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載和厚樸酚成分結(jié)構(gòu),從PDB(http://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶點結(jié)構(gòu),使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體,AutoDock軟件進行加氫、加電子、加ROOT等操作,最后用Autodock-vina進行分子對接,使用Pymol軟件對得到的最佳結(jié)果進行繪圖。

1.2.3 細(xì)胞實驗驗證

將結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于專用培養(yǎng)液中,置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至90%后,加入0.25%胰蛋白酶消化液進行消化,隨后加入專用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以備后續(xù)實驗。

取生長狀態(tài)良好并且無細(xì)胞老化的結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞,加無菌PBS清洗2～3次,加入0.25%胰蛋白酶進行消化,加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,按8000個細(xì)胞/100μL細(xì)胞密度將細(xì)胞加入到96孔板中,隨后放入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。當(dāng)細(xì)胞貼壁且漲至孔內(nèi)密度80%時,分別加入含0、5、10、20、40、80μmol/L和厚樸酚的細(xì)胞培養(yǎng)液,再置于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h后采用MTT法檢測細(xì)胞活力。每孔加入50μL的MTT(5mg/mL)溶液,避光放入培養(yǎng)箱4h,待與活細(xì)胞結(jié)合完成后棄掉未反應(yīng)的溶液,每孔加入150μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測OD 490nm處測量各孔的吸光值。細(xì)胞存活率=(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點篩選

合并去重復(fù)兩個數(shù)據(jù)庫篩選得到的和厚樸酚潛在藥物靶點,最終獲得177個和厚樸酚潛在作用靶點。另外,在TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得了5470個結(jié)直腸癌(COADREAD)相關(guān)靶點。將Honokiol的靶點與COADREAD靶點取交集,和厚樸酚與COADREAD共同靶點64個(見圖1)。

圖1 和厚樸酚和結(jié)直腸癌的交叉靶點Venn圖

2.2 共同靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape軟件獲得和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖2A),其中Top10的基因分別為:MYC、CCND1、CDKN1A、CDK4、EZH2、BIRC5、CDKN3、E2F1、PGR和ALB(圖2B)。

A.Cytoscape軟件構(gòu)建和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò);B.Cytoscape軟件MCC算法篩選TOP10關(guān)鍵基因圖2 和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和TOP10關(guān)鍵基因

2.3 GO與KEGG富集分析

對上述靶點進行GO和KEGG富集分析,64個共同靶點富集后在785個生物過程(biology process,BP)、49個細(xì)胞組成(cellular component,CC)、35個分子功能(molecular function,MF)和46個通路中,見圖3,富集結(jié)果顯示共同靶點主要與活性氧代謝過程、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期、突觸、神經(jīng)元細(xì)胞體、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、激酶調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子活性、輔酶結(jié)合、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路和MAPK信號通路等關(guān)系密切。

A.和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點GO功能富集分析;B.和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點KEGG功能富集分析圖3 和厚樸酚抗結(jié)直腸癌靶點GO和KEGG富集分析

2.4 “靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進一步探討和厚樸酚抗結(jié)直腸癌的作用機制,隨后構(gòu)建了共同靶點信號通路的網(wǎng)絡(luò)圖(圖4),每個通路都對應(yīng)于多個靶點,以及每個靶點與多通路相連,反映了和厚樸酚抗COADREAD的多靶點、多途徑機制。多種通路通過共同的靶點相互聯(lián)系,表明每種通路在治療COADREAD疾病中都起著協(xié)同作用。

圖4 和厚樸酚抗COADREAD的交叉靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

2.5 分子對接分析

將和厚樸酚與關(guān)鍵靶點MYC、CCND1、CDKN1A、CDK4、EZH2、BIRC5、CDKN3、E2F1、PGR、ALB進行結(jié)合能力預(yù)測,和厚樸酚與其中5個分子有較強的結(jié)合能力,如表1,這說明和厚樸酚能夠較好地重現(xiàn)原配體與蛋白的結(jié)合模式,對接結(jié)果具有較高可靠性。用PyMOL軟件對對接結(jié)果進行可視化,見圖5。

表1 分子對接模型的相關(guān)信息

A.和厚樸酚與MYC分子對接圖;B.和厚樸酚與CDK4分子對接圖;C.和厚樸酚與EZH2分子對接圖;D.和厚樸酚與PGR分子對接圖;E.和厚樸酚與ALB分子對接圖圖5 和厚樸酚與候選靶點分子對接圖

2.6 和厚樸酚抑制結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞增殖

用不同濃度和厚樸酚處理LoVo細(xì)胞48h后觀察細(xì)胞形態(tài),并檢測細(xì)胞存活率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對LoVo細(xì)胞的抑制作用呈濃度-時間依賴性(P<0.05,圖6)。和厚樸酚處理LoVo細(xì)胞48h的IC50為40.91 μmol/L。

與0 μmol/L組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖6 和厚樸酚對結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞有毒性作用(標(biāo)尺=100μm)

3 討 論

和厚樸酚是一種木脂素類化合物。研究發(fā)現(xiàn)[4]和厚樸酚具有抗結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等抗多種腫瘤作用,并且通過調(diào)控多種信號通路NF-κB、STAT3、EGFR和mTOR等發(fā)揮抗腫瘤作用,這些途徑在癌癥發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要意義。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出64個和厚樸酚與結(jié)直腸癌的潛在靶點,發(fā)現(xiàn)其主要富集在785個生物過程、49個細(xì)胞組成、35個分子功能和46個通路中,這些結(jié)果表明和厚樸酚可能通過與潛在靶點結(jié)合進而調(diào)控某些生物過程來作用于結(jié)直腸癌。目前研究[5]表明和厚樸酚對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖有抑制作用,并且發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可以對西妥昔單抗耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞有增敏作用[6],所以和厚樸酚有望作為臨床治療結(jié)直腸癌的有效藥物。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)篩選出和厚樸酚治療結(jié)直腸癌的5個關(guān)鍵靶點MYC、CDK4、EZH2、PGR、ALB。MYC是人類癌癥中最常失調(diào)的驅(qū)動基因之一[7],它在人類基因組中具有多種作用,包括對基因表達的調(diào)控和調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?在結(jié)直腸癌或者其他癌癥中均發(fā)現(xiàn)了MYC突變。MYC在結(jié)直腸癌中具有關(guān)鍵作用,通過多種細(xì)胞途徑協(xié)調(diào)其促進作用,因此,可以作為治療結(jié)直腸癌的靶點[8]。CDK4是一種細(xì)胞周期蛋白,它在細(xì)胞增殖及在癌細(xì)胞失調(diào)中具有核心作用[9]。EZH2是PRC2的酶亞基,可催化組蛋白3(H3K27me3)的賴氨酸三甲基化并導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默。EZH2目前在多種癌癥中被發(fā)現(xiàn)是高度表達的,并可以作為癌基因發(fā)揮作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11],結(jié)直腸癌組織中EZH2的含量明顯高于非癌癥組織,并且EZH2與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)。EGR是孕激素受體,目前在生殖腫瘤方面研究較廣,但與結(jié)直腸癌的關(guān)系還未闡明。ALB是白蛋白,有研究表明[12],白蛋白含量增多,患結(jié)直腸的風(fēng)險就會下降。因此,和厚樸酚可能通過細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄等多種機制調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞死亡。GO和KEGG結(jié)果也印證了和厚樸酚可能通過控制活性氧代謝、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期等生物過程來對結(jié)直腸癌進展產(chǎn)生影響。上述的結(jié)果也顯示和厚樸酚調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的進展主要基因富集在PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路上。目前已經(jīng)有研究表明和厚樸酚可以通過PI3K-AKT通路來調(diào)控骨肉瘤的凋亡和自噬[13],也可以通過誘導(dǎo)自噬和凋亡來抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖[14]以及抑制舌癌的增殖及遷移[15]。

本研究和厚樸酚能有效抑制結(jié)直腸癌SW480生長,48h的IC50為40.91μmol/L。研究發(fā)現(xiàn),和厚樸酚在PC9-BrM3 和H2030-BrM3肺癌細(xì)胞中48h的IC50分別為28.4和25.7μmol/L[16],在胰腺癌MiaPaCa細(xì)胞和Panc72細(xì)胞上作用48h的IC50為31.08和34.17μmol/L[17],在神經(jīng)母細(xì)胞瘤neuro-2a上作用72h的IC50為63.4μmol/L[18]。在不同腫瘤細(xì)胞中和厚樸酚IC50較為接近,說明和厚樸酚抗腫瘤效果較穩(wěn)定。在結(jié)直腸癌相關(guān)研究中[19],已發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可通過下調(diào)GPX4來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞鐵死亡。本研究未發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對GPX4的作用,這可能與數(shù)據(jù)庫中分子靶點未納入GPX4有關(guān),這也說明后厚樸酚的靶點機制有待進一步實驗探索。

總之,本文預(yù)測和厚樸酚可以與MYC、CDK4、EZH2、PGR、ALBz分子穩(wěn)定結(jié)合,抑制結(jié)直腸癌增殖,發(fā)揮抗結(jié)直腸癌作用。然而本文僅在理論層面分析論證和厚樸酚對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用機制,具體調(diào)控機制還有待進一步實驗論證。本研究為研究和厚樸酚抗結(jié)直腸癌作用機制提供新理論基礎(chǔ)。