一株拮抗金黃色葡萄球菌的血鏈球菌的安全性評價

張家鑫 ，金慧 ，李新鳴 ，孫冶，高毅敏，耿大升,

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院 病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034；3.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 檢驗科，遼寧 沈陽 110034）

甲型溶血性鏈球菌是呼吸道常見的共生菌，其中血鏈球菌、口腔鏈球菌、唾液鏈球菌等均屬于此類。血鏈球菌（Streptococcus sanguinis）常寄居于上呼吸道、唾液、齦隙、口腔黏膜表面、消化道、女性生殖道，偶見于皮膚，是一種廣泛分布于牙周的有益菌［1-2］。血鏈球菌可以產(chǎn)生過氧化氫、血鏈素等細菌素而拮抗致病菌［3］。呼吸道內(nèi)也存在多種條件致病菌，主要包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉氏菌等。金黃色葡萄球菌常定植于呼吸道口咽、鼻前庭、鼻咽等部位［4］。呼吸道共生菌能通過免疫調(diào)節(jié)、拮抗定植、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來直接或間接抑制在同一生態(tài)位潛伏的條件致病菌，因而在健康人體內(nèi)并不會誘發(fā)呼吸道感染。

本課題組自健康青年口咽部分離到一株甲型溶血性鏈球菌，在分離篩選過程中發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌具有拮抗作用，經(jīng)過16S rRNA 序列比對后鑒定為血鏈球菌。本研究通過進行7 d 的小鼠急性毒性實驗來評價血鏈球菌cpnp 在體內(nèi)的安全性［5］，為日后血鏈球菌cpnp 作為呼吸道益生菌的候選菌株提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

血鏈球菌cpnp 由遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室分離并保存。中國廣東微生物保藏中心（GDMCC）保藏（GDMCC1.2587）。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術有限責任公司）；腦心浸出液肉湯（青島海博生物技術有限公司）；無菌脫纖維綿羊血（Beijing Solarbio Science and Technology 公司）；0.9%生理鹽水（遼寧民康制藥有限公司）；霧化機（可孚醫(yī)療科技股份有限公司）。

1.3 實驗動物

SPF 級昆明種小鼠48 只，雌雄各半，體質(zhì)量18～24 g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司［許可證號：SCXK（遼）2020-0001］。本研究中動物實驗嚴格遵守沈陽醫(yī)學院動物護理與實驗倫理委員會審查和批準的要求進行（動物倫理實驗編號為2021061302）。

1.4 小鼠安全性毒性檢測

菌液制備：取血鏈球菌cpnp 單菌落于含有5%脫纖維羊血的營養(yǎng)瓊脂平板上進行連續(xù)劃線。培養(yǎng)24 h 后刮取菌落接種于BHI 液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min 于搖床過夜培養(yǎng)。離心后采用生理鹽水調(diào)整菌體濃度至 1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL、1×108CFU/mL，分別作為高、中、低劑量組。

實驗方法：將健康昆明種小鼠48 只按隨機數(shù)字表法分為8 組，每組6 只，分為急性雌性對照組、急性雌性高劑量組、急性雌性中劑量組、急性雌性低劑量組；急性雄性對照組、急性雄性高劑量組、急性雄性中劑量組、急性雄性低劑量組，進行7 d 的急性毒性實驗。48 只小鼠適應環(huán)境7 d后，實驗組通過霧化吸入的方式每天分別給予高、中、低劑量菌液1 mL，對照組給予同體積生理鹽水。急性毒性實驗連續(xù)給予菌液7 d。在首次霧化給予菌液后4 h 內(nèi)，每隔20 min 對實驗小鼠是否出現(xiàn)異常狀態(tài)或死亡進行觀察。若發(fā)現(xiàn)小鼠在觀察期內(nèi)死亡，及時對死亡小鼠進行解剖并觀察其主要器官變化。每日對實驗小鼠體重、進食量進行稱量、記錄。在急性毒性實驗結束后禁食、禁水24 h，對小鼠進行解剖，對心、肝、脾、肺、腎進行稱重，計算臟器指數(shù)（器官重量/體重×100%）。

1.5 血常規(guī)檢測

在急性實驗結束后，采用活體眼球采血法分別采集雄性、雌性高劑量組和雄性、雌性對照組小鼠全血于含有K2EDTA 的抗凝管中，在2℃～6℃條件下保存，送至遼寧千一測試評價科技發(fā)展有限公司進行血常規(guī)測定。送檢項目包括紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、白細胞（WBC）、中性粒細胞（Gran）、血小板（PLT）。

1.6 耐藥性檢測

K-B 紙片擴散法：調(diào)整經(jīng)搖床過夜培養(yǎng)的血鏈球菌cpnp 菌懸液濃度于0.5 麥氏，取100 μL 均勻涂布于MH 固體培養(yǎng)基上，待培養(yǎng)基吸收完全后，將選取的8 種常見抗生素包括頭孢吡肟、紅霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、萬古霉素、青霉素、氯霉素、克拉霉素的藥敏紙片鋪在培養(yǎng)基上，靜置10 min 后于37℃倒置培養(yǎng)24 h。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。體重、進食量、臟器指數(shù)三個指標采用ANOVA 方差分析進行比較；血常規(guī)指標中服從正態(tài)分布采用兩獨立樣本t檢驗，不服從正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體重變化

在急性毒性實驗中，小鼠皮毛、飲水、軀體活動等狀態(tài)均表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象和中毒體征。通過對小鼠的體質(zhì)量進行分析，發(fā)現(xiàn)霧化給予小鼠血鏈球菌cpnp 后，各實驗組和對照組的小鼠體質(zhì)量均有不同程度的升高。急性毒性實驗中，不同劑量的雄性組和雌性組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.058,P=0.981；F=0.569,P=0.643）。實驗表明，霧化給予血鏈球菌cpnp 對小鼠的體重無影響，見表1。

表1 急性毒性實驗小鼠體重變化（n=6,,g）

表1 急性毒性實驗小鼠體重變化（n=6,,g）

2.2 進食量變化

對小鼠每日進食量進行分析后發(fā)現(xiàn)，在霧化小鼠期間，急性毒性實驗中各給藥組與對照組相比進食量輕度下降。但是急性毒性實驗中不同劑量的雄性組和雌性組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.458,P=0.285；t=0.158,P=0.917）。實驗表明，霧化給予血鏈球菌cpnp 對小鼠進食量無影響，見表2。

表2 急性毒性實驗小鼠進食量變化（n=6,,g）

表2 急性毒性實驗小鼠進食量變化（n=6,,g）

2.3 臟器指數(shù)變化

急性毒性實驗中，雄性各劑量實驗組心、肝、脾、肺、腎的臟器指數(shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（F=3.002,P=0.055；F=0.779,P=0.520；F=1.347,P=0.288；F=4.488,P=0.655；F=0.932,P=0.444）；雌性各劑量組各器官臟器指數(shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（F=0.357,P=0.784；F=0.891,P=0.463；F=0.825,P=0.495；F=0.517,P=0.675；F=0.631,P=0.604）。實驗結果表明，霧化菌株cpnp 對小鼠主要臟器沒有損害，見表3。

表3 急性毒性實驗小鼠臟器指數(shù)（n=6,）

表3 急性毒性實驗小鼠臟器指數(shù)（n=6,）

2.4 血常規(guī)指標分析

急性毒性實驗中，雄性高劑量實驗組RBC、HGB、WBC、Gran、PLT 與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.949,P=0.396；t=0.97,P=0.387；t=0.377,P=0.725；t=1.133，P=0.333；t=2.201,P=0.083）；雌性高劑量組RBC、HGB、WBC、Gran、PLT 與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.324,P=0.762；t=0.393,P=1.095；t=0.564,P=0.603；t=0.778,P=0.302；t=0.12,P=1.971）。結果表明，高劑量實驗組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，霧化給予血鏈球菌cpnp 未引起炎癥及毒性反應，見表4。

表4 急性毒性實驗小鼠血常規(guī)（）

表4 急性毒性實驗小鼠血常規(guī)（）

2.5 耐藥性檢測

本試驗對血鏈球菌cpnp 的耐藥性進行檢測，根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）M100 S27 標準進行判斷，實驗結果表明血鏈球菌cpnp對以上抗生素均具有較高敏感性，見表5。

表5 血鏈球菌cpnp 耐藥性結果

4 討論

甲型溶血性鏈球菌是口咽部定植的優(yōu)勢菌［6-7］，可以通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)如過氧化氫、分泌性蛋白類細菌素來抑制化膿性鏈球菌生長，以維持健康人體咽部微環(huán)境的穩(wěn)定［8］。近年來從呼吸道共生菌中分離優(yōu)勢菌群發(fā)現(xiàn)一些分離自呼吸道的甲型溶血性鏈球菌具有拮抗致病菌的作用。LI等［9］從健康兒童口咽部分離出了三株對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌均具有拮抗作用的甲型溶血性鏈球菌。SHEKHAR［10］發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻腔向小鼠注射鏈球菌后可以使小鼠通過免疫保護作用而保護小鼠免受肺炎鏈球菌引起的肺部感染。SINEM 等［11］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的唾液鏈球菌無細胞上清液對銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌的生長具有抑制作用，也會提高二者對頭孢哌酮的敏感性。目前已有甲型溶血性鏈球菌唾液鏈球菌K12 被確定為呼吸道益生菌，其可用于噴鼻劑、口含片以防治咽炎扁桃體炎等上呼吸道疾?。?2-14］。本研究所用菌株cpnp 為來自健康青年口咽部的甲型溶血性鏈球菌，在體外對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌具有菌株拮抗作用，本文對其體內(nèi)安全性進行評價，為篩選潛在的呼吸道益生菌提供實驗依據(jù)。

在給予被測物后于實驗早期觀察動物行為出現(xiàn)的變化稱為急性毒性體征［15-18］。本實驗霧化給予小鼠低、中、高劑量的血鏈球菌cpnp 的菌液，與對照組小鼠相比，在急性毒性實驗中，小鼠體征良好，生存狀態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)實驗小鼠出現(xiàn)皮膚、皮毛、黏膜等變化，同樣未有軀體活動異常情況發(fā)生，如震顫、抽搐等。飲食習慣正常，未出現(xiàn)腹瀉、流涎等狀況。說明在霧化小鼠期間未發(fā)生相關毒性反應，未出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。

在急性毒性實驗中，體重和進食量用以評價動物實驗中所給藥物對小鼠造成副作用的良好指標［19］。各實驗組小鼠的體重逐漸增加。急性毒性實驗中，各雄性給藥組進食量相較于對照組略微升高，雌性中、低劑量組進食量略微下降。盡管實驗中個別劑量組出現(xiàn)了進食量降低的情況，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，說明進食量的改變對小鼠無影響。

臟器指數(shù)作為動物毒性實驗中敏感易行的指標，可以評價動物臟器的受損情況［20-21］。在對小鼠進行解剖后，取心、肝、脾、肺、腎進行觀察稱重，發(fā)現(xiàn)各實驗組臟器指數(shù)與對照組相比均無統(tǒng)計學意義，說明霧化給予血鏈球菌cpnp 期間，小鼠各器官狀態(tài)正常，無臟器受損現(xiàn)象出現(xiàn)。

血常規(guī)?？梢詸z測動物機體是否處于健康狀態(tài)［22］，往往通過白細胞含量是否異常來評價機體的感染情況［23］。對急性毒性實驗中各劑量組小鼠進行血常規(guī)檢測后，發(fā)現(xiàn)各劑量組中血常規(guī)指標均處于標準范圍內(nèi)，未出現(xiàn)異常。說明霧化給予小鼠血鏈球菌cpnp 未引起炎癥及感染。

細菌耐藥性檢測是評價其安全性的重要部分。K-B 紙片擴散法不僅作為常用的耐藥性檢測方法之一，而且操作簡便、成本低，是目前常用的細菌耐藥性檢測方法［24］。本研究中采用紙片擴散法對血鏈球菌cpnp 進行耐藥性檢測，發(fā)現(xiàn)血鏈球菌cpnp 對常用抗生素具有敏感性。說明血鏈球菌cpnp 具有一定的安全性。

呼吸道共生菌對于抵抗呼吸道病原體感染、維持呼吸道微生態(tài)平衡具有重要意義。本研究證實以霧化形式給予小鼠血鏈球菌cpnp 后對小鼠無毒性作用，具體表現(xiàn)為小鼠無炎癥反應、各器官無受損現(xiàn)象，對常見抗生素敏感。初步說明血鏈球菌cpnp 具有良好的安全性。因此，可以將其用作呼吸道益生菌的候選菌株，為選擇呼吸道來源的益生性菌株提供依據(jù)。