蜂蜜植物源毒性成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

劉珈伶，韋 環(huán)

（廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧 530022）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。蜂蜜除含有大量葡萄糖、果糖等糖類物質(zhì)外，還富含維生素、蛋白質(zhì)及有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分[1]。其具有抑菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]，是深受公眾喜愛的藥食同源食物。隨著人們對(duì)蜂產(chǎn)品需求量的不斷增加，蜂蜜質(zhì)量安全問題引發(fā)大眾關(guān)注，食用蜂蜜中毒惡性事件引發(fā)了民眾恐慌。蜂蜜本無(wú)毒，但在生產(chǎn)過程中被污染或蜜蜂采集有毒花蜜釀制的蜂蜜，可能會(huì)引起中毒[4-5]。我國(guó)廣西、云南和貴州等地均有食用有毒蜂蜜而引發(fā)食源性疾病的報(bào)道[6-7]。食用有毒蜂蜜后會(huì)引發(fā)如頭暈頭疼、嘔吐腹瀉、四肢麻木、呼吸中樞麻痹等中毒癥狀[5-7]，甚至引發(fā)休克死亡，據(jù)統(tǒng)計(jì)野生蜂蜜引發(fā)中毒的死亡率在20%以上[8-9]。

蜂蜜有毒物質(zhì)主要來源于蜜蜂采集有毒蜜源植物花粉?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》（GB 14963—2011）中規(guī)定“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應(yīng)安全無(wú)毒，不得來源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物”。但標(biāo)準(zhǔn)未列出具體植物源毒性成分和相關(guān)檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)對(duì)有毒蜜源植物如雷公藤屬、博落回屬和鉤吻屬等毒性成分關(guān)注和研究較多[10-12]。但我國(guó)地大物博，除了上述有毒蜜源植物之外，還有毛茛科的烏頭屬、百合科的藜蘆屬和茄科的曼陀羅屬等多種毒性較高的毒源植物[5]。要預(yù)防和控制此類事件發(fā)生，快速準(zhǔn)確檢測(cè)出蜂蜜中植物源毒性成分十分重要。本文梳理了近年來報(bào)道的蜂蜜中主要的植物源毒性成分，對(duì)其前處理方法和檢測(cè)技術(shù)的特點(diǎn)和研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為提高蜂蜜中植物源毒性成分監(jiān)測(cè)水平提供幫助，助推蜂產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

1 蜂蜜中的植物源毒性成分及其分類

含有天然毒素成分的植物種類繁多，毒性成分和中毒臨床表現(xiàn)各異。生物堿和萜類化合物是最常見的天然毒素。生物堿（Alkaloid）是存在于自然界中的一類堿性含氮有機(jī)化合物，結(jié)構(gòu)多變，數(shù)量龐大，目前已發(fā)現(xiàn)的天然生物堿化合物就有2 萬(wàn)種以上[13]。分布最廣的為吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine Alkaloids，PAs），目前已發(fā)現(xiàn)超過600 多個(gè)不同結(jié)構(gòu)的PAs 及其N-氧化物，存在于世界各地的6 000多種植物中，大部分PAs 對(duì)人體肝臟有毒[14]。萜類化合物（Terpenoids）是自然界中分布廣泛的天然產(chǎn)物之一，雙環(huán)倍半萜內(nèi)酯類、二萜皂苷類和松香烷型二萜等是蜂蜜植物源毒性成分的來源。植物源毒性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，增加了研究難度。本文梳理了近年來國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的有關(guān)蜂蜜植物源毒性化合物，并按結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類，如表1 所示。

表1 蜂蜜中植物源毒性化合物名稱及分子式信息

由表1 可見，已報(bào)道的毒性物質(zhì)中PAs 及其N-氧化物占近五成，其次是具有中樞神經(jīng)毒性的二萜類和吲哚類生物堿。這些毒性化合物毒性大，中毒癥狀急，致死率高，是研究的重點(diǎn)。對(duì)于數(shù)目龐大的PAs 要逐一制定安全限量并不科學(xué)，歐盟2020 年新修訂的（EC）No. 1881/2006 以21 種PAs 總和正式設(shè)定了花粉等部分食品中PAs 的限量。盡管未涉及蜂蜜，但為開展蜂蜜中毒性物質(zhì)研究和制定合理限值提供了思路。

2 蜂蜜中植物源毒性成分的前處理

蜂蜜糖分高、黏度大、基質(zhì)干擾強(qiáng)，樣品前處理技術(shù)成為準(zhǔn)確檢測(cè)毒性成分的關(guān)鍵。傳統(tǒng)前處理技術(shù)有溶劑提取法、液液萃取法等，普遍存在操作步驟煩瑣、有機(jī)溶劑消耗量大、凈化能力弱等缺點(diǎn)。隨著前處理技術(shù)的迅速發(fā)展，固相萃取、加速溶劑萃取、頂空固相微萃取等新興技術(shù)在蜂蜜植物源毒性成分檢測(cè)中獲得了良好的應(yīng)用。本文重點(diǎn)介紹應(yīng)用最為廣泛的固相萃取技術(shù)，包括分散固相萃取法、磁性固相萃取法、離子交換固相萃取法等。

2.1 分散固相萃取

分散固相萃取技術(shù)也稱QuEChERS，簡(jiǎn)便快捷，操作方便，應(yīng)用廣泛。PAs 的N-氧化物極性較大，為便于后期分析需要用鋅粉在凈化時(shí)還原成游離的PAs[19,29]。還原法提高了PAs 含量，增加了檢測(cè)靈敏度，同時(shí)減少了PAs N-氧化物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用，某些無(wú)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的N-氧化物也能被檢測(cè)到。在進(jìn)行廣譜篩查時(shí)，常采用如NaCl+PSA 的簡(jiǎn)易QuEChERS法，減少吸附劑復(fù)雜造成的損失[12]。QuEChERS 法可以根據(jù)凈化目標(biāo)物不同，選擇適宜的分散劑。例如，中性氧化鋁適合芳香胺類化合物的萃取，張?jiān)萚30]使用中性氧化鋁提取雷公藤甲素。石墨化炭黑（Graphitized Carbon Blacks，GCB）對(duì)于平面分子或者含有平面芳香環(huán)的分子具有強(qiáng)烈的吸附作用，ROMERA-TORRES 等[25]使 用GCB 提 取 蜂 蜜 中9 種莨菪烷類生物堿。QuEChERS 法靈活便捷，已在蜂蜜基質(zhì)中多種植物毒素的廣譜性提取凈化中得到廣泛開發(fā)和研究，專屬性依凈化目標(biāo)物的不同予以調(diào)整。

2.2 磁性固相萃取

磁性固相萃取是以功能化超順磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）為吸附材料，只需要一個(gè)外部磁場(chǎng)即可從各種溶液基質(zhì)中分離目標(biāo)物。該方法簡(jiǎn)單快捷，易操作，專屬性強(qiáng)，適用于分離復(fù)雜基質(zhì)中的痕量目標(biāo)物。段蘇然等[31]采用MNPs改良了QuEChERS 技術(shù)凈化，提取蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤甲素，減少了因PSA 吸附造成的損失和C18對(duì)雷公藤甲素電負(fù)性的影響。

2.3 離子交換固相萃取

離子交換固相萃取適用于帶電化合物，大部分生物堿帶正電荷，混合型陽(yáng)離子交換固相萃?。∕CX）[4,22]和強(qiáng)陽(yáng)離子交換固相萃取（SCX）[15,17,20]電負(fù)性強(qiáng)，易發(fā)生陽(yáng)離子交換。MCX 能提供反相吸附和陽(yáng)離子交換雙重作用力，對(duì)堿性物質(zhì)保留能力更強(qiáng)，在生物堿中應(yīng)用更廣。使用MCX 提取PAs 時(shí)常以稀酸-甲醇為溶劑[22]，但馬桑亭類、鬧羊花類毒素等會(huì)因甲醇共流出而損失。為兼顧更多生物堿，韋環(huán)等[4]將溶劑換為水，在PAs、馬桑亭和鬧羊花等20 種不同類別植物毒素的凈化中得到較好應(yīng)用。

3 蜂蜜中植物源毒性成分的檢測(cè)技術(shù)

蜂蜜的植物源毒性成分種類多，毒源范圍廣，各種化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同分異構(gòu)體多，檢測(cè)難度大。其檢測(cè)方法主要包括基于視覺感官檢測(cè)的蜂蜜孢粉學(xué)[11,21-22]、色譜檢測(cè)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)[18]等。蜂蜜孢粉學(xué)能提供蜜源信息，但無(wú)法對(duì)毒性物質(zhì)定

性和定量。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)需要抗原與抗體有特異反應(yīng)，目前還無(wú)法達(dá)到多有毒物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)。色譜技術(shù)具有強(qiáng)大分離功能，操作方便，條件溫和，方法多樣，使得多毒素同時(shí)定性定量成為可能。薄層色譜法是簡(jiǎn)單的色譜分析方法，操作簡(jiǎn)便，早期也用于快速檢測(cè)植物毒素，但靈敏度不高，分離能力有限，對(duì)部分毒性物質(zhì)的專一性不夠，目前已被其他分離能力更高的技術(shù)所取代。

3.1 高效液相色譜法

高 效 液 相 色 譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、熱不穩(wěn)定有機(jī)化合物的重要分離分析技術(shù)。一般采用C18作為分離柱，甲醇/乙腈-水作為流動(dòng)相檢測(cè)蜂蜜中的植物毒素[11,21]。降低柱溫對(duì)分離有利，HUNGERFORD 等[15]使用5 ℃的低溫HPLC 實(shí)現(xiàn)昆士蘭蜂蜜中Indicine 和Lycopsamine 兩種PAs 的立體異構(gòu)體分離。HPLC 與二極管陣列檢測(cè)器（Photo-Diode Array，PDA）聯(lián)用時(shí)，可得任意時(shí)間的光譜圖，相當(dāng)于與紫外聯(lián)用[21]。但HPLC 基質(zhì)干擾嚴(yán)重，靈敏度不足，因此逐步被色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所取代。

3.2 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的化合物，商業(yè)化的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索功能實(shí)現(xiàn)了未知/已知物的定性。GC-MS 對(duì)目標(biāo)物分子量和熱穩(wěn)定性要求高，部分毒性物質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配度低，部分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中缺乏對(duì)應(yīng)信息的N-氧化物，定性困難。

3.3 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）的質(zhì)譜一般是指低分辨率的四極桿（QQQ）和離子阱（Trap）質(zhì)譜。它對(duì)高沸點(diǎn)、不揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物在定性、定量分析方面具有特殊優(yōu)勢(shì)，是蜂蜜中毒性物質(zhì)檢測(cè)最通用和最有用的方法。大氣壓電離化學(xué)電離離子源（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）不能生成一系列多電荷離子，一般用于弱極性、小分子有機(jī)物。如PAs 的N-氧化物極性強(qiáng)，需要還原后使用APCI 源檢測(cè)蜂蜜中PAs 總量[20]。ESI 源是主要的離子源，多位學(xué)者建立了ESI 模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）測(cè)定PAs、雷公藤毒素、馬桑毒素的定量方法[19,27,31]。離子阱質(zhì)譜可得到多級(jí)質(zhì)譜離子碎片，用于推導(dǎo)未知化合物結(jié)構(gòu)。SIXTO 等[16]采用3 種離子檢測(cè)模式在沒有分析標(biāo)準(zhǔn)的情況下定性和定量蜂蜜中毒性最大的PAs。低分辨率質(zhì)譜雖然痕量分析準(zhǔn)確，但基質(zhì)干擾嚴(yán)重，不能有效區(qū)分目標(biāo)化合物和干擾化合物，存在假陽(yáng)性。

3.4 超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法

高分辨 質(zhì) 譜（High Resolution Mass Spectrum，HRMS）提供的精確質(zhì)量信息可以用來確定離子峰的元素組成，比低分辨質(zhì)譜儀定性結(jié)果更準(zhǔn)確，靈敏度更高，類型包括四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Triple Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer，Q-TOF MS）、 靜 電 軌 道 阱 質(zhì) 譜（Orbitrap Mass Spectrometer，Orbitrap MS）、傅立葉變換質(zhì)譜等。其中，傅立葉變換質(zhì)譜價(jià)格高昂難操作，應(yīng)用少。Q-TOF MS 和Orbitrap MS 分辨能力和價(jià)格同比略低，但質(zhì)量范圍寬、掃描速度快、維護(hù)簡(jiǎn)單，是最常見、普及最廣的高分辨質(zhì)譜。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）可提供瞬時(shí)高精度全譜譜圖，信息量全。相較而言TOF MS 分辨率較低，質(zhì)量穩(wěn)定性較差，需與其他串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用才能實(shí)現(xiàn)多級(jí)質(zhì)譜功能，用于鑒別未知分析物[23]。靜電軌道離子阱質(zhì)譜（Orbitrap MS）是一種基于靜電場(chǎng)電磁理論的新型高分辨質(zhì)量分析器，已經(jīng)在藥物、食品、環(huán)境等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。相比Q-TOF MS，該方法能提供更高的質(zhì)量精度和穩(wěn)定性，但采集速率較低，在高速掃描時(shí)，分辨率會(huì)顯著下降。常用掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)掃描（Full MS/ddMS2），即單個(gè)分析周期獲得精確質(zhì)量的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜。以已知毒物的精準(zhǔn)特征離子質(zhì)譜信息建立專屬數(shù)據(jù)庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的非靶向篩查[4,15,17]。Orbitrap MS 的Targeted-SIM 采集模式還有媲美四極桿質(zhì)譜的定量能力。甘源等[10]以此建立蜂蜜中5 種雷公藤毒素的高分辨質(zhì)譜定量分析方法。Orbitrap MS 強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù)、高質(zhì)量的質(zhì)譜圖，可輕松實(shí)現(xiàn)定性和定量。

4 結(jié)語(yǔ)

蜂蜜中毒事件偶發(fā)性高、致死率高、危害性強(qiáng)。目前食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅列舉了幾種毒性較大的蜜源植物名稱，未明確主要毒性成分及其檢測(cè)方法。植物源毒性物質(zhì)來源廣、種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得植物源毒性成分檢測(cè)和研究面臨巨大的挑戰(zhàn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并建立了上百種物質(zhì)的鑒定檢測(cè)方法，但自然界中有毒物質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些，新的毒性物質(zhì)亟待去發(fā)現(xiàn)和研究。QuEChERs、MCX、MNPs 等高效固相萃取技術(shù)在樣品預(yù)處理中發(fā)揮越來越大的作用。QuEChERS 適于大量樣品的批量前處理需求，可與多種固相萃取技術(shù)靈活結(jié)合，提高專屬性。MCX 對(duì)堿性和中性化合物有很好的選擇性，受到了廣泛的關(guān)注及應(yīng)用。UPLC-MS/MS 具有痕量的檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確的定量分析能力，成為植物毒素檢測(cè)研究和標(biāo)準(zhǔn)制定的重要參考方法。具有強(qiáng)大定性能力和全譜完整信息的UPLC-HRMS 大受青睞。靜電軌道阱質(zhì)譜憑借其精確質(zhì)量的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜建立的蜂蜜中植物源毒性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)蜂蜜中毒事件發(fā)生時(shí)能實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品非靶向高通量篩查，已成為未知毒物定性檢測(cè)的利器。上述新方法、新技術(shù)的應(yīng)用亟待建立快速高效、易于操作并且適用范圍較廣的檢測(cè)方法，從而提高蜂蜜中植物源毒性分的監(jiān)管力度，為蜂蜜的安全管理提供技術(shù)支持。