攜帶遺傳標記的新型鵝細小病毒感染櫻桃谷北京鴨再現(xiàn)短喙與矮小綜合征

李勇霖,王 昱,張 偉,周 揚,李玉峰,蔣志偉,張建軍,朱國強,王建業(yè)*

(1.揚州大學 獸醫(yī)學院 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009;2.國藥集團揚州威克生物工程有限公司,江蘇 揚州 225100;3.山東省農(nóng)業(yè)科學院 家禽研究所,山東 濟南 250023)

2015年,短喙與矮小綜合征(short beak and dwarfism syndrome,SBDS)在中國的櫻桃谷北京鴨中暴發(fā),此后,此病陸續(xù)在國內(nèi)的騾鴨、麻鴨等品種中也有發(fā)生[1-4]。2019年,SBDS在埃及和波蘭開始流行,主要感染騾鴨和櫻桃谷北京鴨[5-6]。SBDS是一種傳染性疫病,在上世紀70年代已經(jīng)在法國騾鴨中流行[7]。該病的特征性臨床表現(xiàn)包括體型矮小、喙短、舌頭外伸、跛腳、不愿走動,發(fā)病率通常在10%～30%之間,死亡率不到5%,至上市階段,斷腿斷翅的比例明顯升高[8]。該病在國內(nèi)的出現(xiàn)給肉鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來了很大經(jīng)濟損失。

SBDS病原鑒定為鵝細小病毒(goose parvovirus,GPV)的變異株或稱之為新型鵝細小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)。研究顯示,NGPV與經(jīng)典型GPV之間擁有特征性的核苷酸和氨基酸差異[9]。經(jīng)典型GPV對雛鵝具有高致病性,但在自然條件下,對櫻桃谷北京鴨缺乏致病性。盡管已有報道表明用NGPV分離株感染櫻桃谷北京鴨能夠復制出SBDS,但在某些SBDS臨床病例中,發(fā)現(xiàn)存在鴨圓環(huán)病毒和NGPV的共感染[10-11]。因此,是否單獨的NGPV感染櫻桃谷北京鴨能夠復制出SBDS的所有臨床癥狀尚存疑問。本研究中,基于NGPV分離株SDJN19,構(gòu)建了包含其完整基因組的感染性質(zhì)粒pJN,并引入單個核苷酸點突變作為遺傳標記,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染櫻桃谷北京鴨胚拯救出感染性病毒rJNm。rJNm的鴨感染試驗表明,單獨的NGPV感染足以復制出典型的SBDS癥狀,且具有顯著的水平傳播能力。

1 材料與方法

1.1 病毒株和質(zhì)粒NGPV毒株SDJN19由本課題組分離,-80℃保存;經(jīng)過修飾的帶有NcoⅠ酶切位點的pBSKN質(zhì)粒由本課題組先前構(gòu)建[12]。

1.2 試劑各種限制性內(nèi)切酶均為NEB公司產(chǎn)品;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購自Invitrogen;高保真聚合酶PrimeSTAR Max 購自TaKaRa;質(zhì)粒純化及膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司。

1.3 病毒增殖和純化將SDJN19的種毒用滅菌生理鹽水做1∶50稀釋,并加入青、鏈霉素至終濃度各2 000 U/mL。病毒液以尿囊腔接種9日齡櫻桃谷北京鴨胚,置于37.8℃孵化箱繼續(xù)孵育,每天照蛋3次,48 h內(nèi)死亡胚棄去。48 h后死亡胚,檢出后置4℃放置6～10 h,收集死胚尿囊液,-20℃保存待用。病毒的純化、濃縮及核酸提取參照文獻[12]進行。核酸沉淀用30 μL STE(0.010 mol/L Tris、0.001 mol/L EDTA、0.100 mol/L NaCL, pH 8.0)溶解,然后置于95℃水浴作用5 min,再緩慢降溫至50℃,使得單鏈核酸退火形成雙股DNA分子,取10 μL進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 感染性質(zhì)粒pJN的構(gòu)建及遺傳標記引入取30 μL雙股DNA,用NcoⅠ單酶切,產(chǎn)生3.8,1.2 kb 2個亞基因組片段。2個片段經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后,切膠回收DNA片段。將左側(cè)3.8 kb 片段導入pBSKN 質(zhì)粒的HincⅡ和NcoⅠ酶切位點之間,獲得質(zhì)粒pBSKN-3.8。右側(cè)1.2 kb片段導入NcoⅠ和SmaⅠ位點之間,獲得質(zhì)粒 pBSKN-1.2。pBSKN-3.8用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切,將回收的3.8 kb片段插入pBSKN-1.2質(zhì)粒的NcoⅠ和XhoⅠ位點之間,最終獲得包含整個基因組的質(zhì)粒pJN。通過選擇合適的酶切位點和Overlap PCR,在pJN質(zhì)粒位于VP3基因區(qū)域的NdeⅠ位點中引入單個核苷酸點突變(A→G),但不改變密碼子,修飾后的質(zhì)粒定名為pJNm。所有連接產(chǎn)物均轉(zhuǎn)化于大腸桿菌SURE株制備的感受態(tài)細胞。

1.5 pJNm轉(zhuǎn)染和病毒拯救將pJNm質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000,按照1.0∶2.5的比例混合,靜置20 min后將轉(zhuǎn)染混合物以絨毛尿囊膜途徑接種9日齡櫻桃谷北京鴨胚,每個胚質(zhì)粒用量為2.0 μg。同時以轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒pBSKN作為同步對照。對48 h 后死亡的鴨胚,收集尿囊液并檢查胚體病變。將上述收集的尿囊液做1∶50稀釋,經(jīng)尿囊腔途徑接種5個9日齡櫻桃谷北京鴨胚,每個胚0.2 mL,收集48 h后的死亡胚胎尿囊液,-80℃保存。如此傳代2次,將拯救的病毒命名為 rJNm。

1.6 rJNm基因組序列分析和ELD50測定從尿囊液中提取rJNm病毒核酸,參照SDJN19的基因組序列(GenBank登錄號MN356044),設(shè)計5對重疊PCR引物,擴增rJNm基因組。PCR產(chǎn)物切膠回收后,送商業(yè)化公司進行測序,并與親本株SDJN19序列進行比對。將拯救病毒rJNm和親本株SDJN19分別做10倍梯度稀釋,每個梯度接種5個9日齡櫻桃谷北京鴨胚,0.2 mL/胚,連續(xù)觀察7 d,每天照胚3次,記錄死亡個數(shù)和死亡時間,按照Reed-Muench方法計算半數(shù)致死量(ELD50)[13]。

1.7 雛鴨感染試驗將2日齡櫻桃谷北京鴨分為2組,每組20只,分別飼養(yǎng)于隔離器中,自由飲食和飲水。感染組經(jīng)頸部皮下接種0.5 mL的rJNm,包含2.5×105ELD50。對照組鴨給予正常發(fā)育至14日齡的櫻桃谷北京鴨胚尿囊液,0.5 mL/只。飼養(yǎng)觀察32 d,在感染后7,14,21,28 d,分別測量體質(zhì)量、喙長和喙寬,對死亡鴨和存活鴨撲殺后予以剖檢,觀察病理變化,并做顯微組織學檢查。

1.8 水平傳播試驗設(shè)置3個組別,分別為感染組、水平接觸組和對照組,每組9只2日齡櫻桃谷雛鴨。感染組和水平接觸組飼養(yǎng)于同一間房的不同籠子,籠間距為10 cm,房間及籠子內(nèi)部空氣自由流通。對照組飼養(yǎng)于單獨房間。感染組鴨頸部皮下接種rJNm,劑量為2.5×105ELD50。3組鴨飼養(yǎng)觀察32 d,自由采食飲水。在感染后7,14,21,28 d分別測量體質(zhì)量、喙長、喙寬。對死亡病例及存活鴨予以剖檢,觀察病理變化,并做顯微組織學檢查。

1.9 病毒載量分析和抗體檢測對水平接觸組中31 d仍存活的鴨撲殺后,取其肝臟、脾臟和回腸,進行病毒載量分析和PCR鑒定,并與感染組中死亡鴨進行比較。qPCR上游引物為5′-caatgttggtcttcccggtgg-3′,下游引物為5′-agtatcctgtgcggctgggtg-3′。qPCR引物靶向NGPV Rep1基因,擴增片段為95 bp。通過瓊脂擴散試驗對31 d存活鴨的血清抗體水平進行檢測,以出現(xiàn)沉淀線的血清最大稀釋倍數(shù)以2為底數(shù)的負對數(shù)值表示為血清抗體效價。以SDJN19株鴨胚尿囊液濃縮50倍作為瓊擴抗原。

2 結(jié)果

2.1 pJN構(gòu)建通過對1.2,3.8 kb亞基因組片段進行克隆和組合,獲得包含SDJN19完整基因組的質(zhì)粒pJN。pJN用SphⅠ單酶切產(chǎn)生3.3,2.5,2.2 kb 3條DNA片段,用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后產(chǎn)生3.0 kb載體分子和5.0 kb插入的基因組(圖1)。

A.pJN 酶切鑒定(M.1 kb DNA Marker;1.SphⅠ單酶切產(chǎn)生3.3,2.5,2.2 kb DNA片段;2.XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切產(chǎn)生3.0 kb的pBSKN載體和5.0 kb插入基因組);B.pJN示意圖及主要酶切位點分布

2.2 產(chǎn)生攜帶遺傳標記的rJNm為了產(chǎn)生區(qū)別于野毒株的拯救病毒,在pJN質(zhì)粒VP3基因內(nèi)部NdeⅠ位點,通過Overlap PCR引入了1個同義核苷酸突變(A→G),產(chǎn)生質(zhì)粒pJNm。pJNm轉(zhuǎn)染9日齡櫻桃谷北京鴨胚,胚在120～136 h之間死亡,檢查胚體可見明顯充、出血。轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒pBSKN的鴨胚均存活。第1代拯救的病毒尿囊液傳代后可以穩(wěn)定在96～120 h致死櫻桃谷北京鴨胚。拯救病毒以rJNm表示。

2.3 rJNm基因組序列分析和ELD50測定對盲傳2代的rJNm基因組進行PCR擴增和序列分析,結(jié)果顯示,除人工引入的遺傳標記位點之外,rJNm與親本株SDJN19序列完全一致。對rJNm和親本株SDJN19的ELD50分別進行測定,結(jié)果顯示rJNm的ELD50達到5×106.25/mL,而親本株SDJN19的ELD50為5×105.38/mL。這表明拯救病毒rJNm具有與親本病毒相近的ELD50。

2.4 rJNm的櫻桃谷北京鴨感染試驗與對照組相比,感染組自第1周開始,生長速度就明顯放緩。在感染后7,14,21,28 d的體質(zhì)量分別為0.137,0.261,0.434和0.609 kg,而對照組體質(zhì)量則達到0.349,0.764,1.271 和1.656 kg,組間差異顯著(P<0.000 1)(圖2A)。感染組鴨喙的發(fā)育同樣受到抑制,在7,14,21,28 d,其喙長和喙寬均明顯低于對照組(P<0.000 1)(圖2B、C)。感染鴨不愿走動,大多時間呈蹲伏狀態(tài),很快這些鴨站立和走動愈發(fā)困難,跛腳,可見單只或2只腿后伸或向外呈劈叉姿勢(圖2E)。隨著病程發(fā)展,在感染鴨中出現(xiàn)死亡病例,觀察期內(nèi)總共8只鴨死亡,第1例出現(xiàn)在感染后7 d,最后1例在第15 天,總死亡率為40%(圖2D)。由于喙短,大多數(shù)鴨舌頭向外伸出、向下彎曲,在感染后第3周表現(xiàn)得尤為明顯。跖骨靠近關(guān)節(jié)處由于長期磨損,外觀上表現(xiàn)為紅腫(圖2E)。其他可見癥狀還有拉稀、換羽延遲,與對照組鴨相比叫聲低沉。無論在死亡鴨還是存活鴨,均無可見的神經(jīng)癥狀。

對死亡鴨進行解剖,主要病理變化體現(xiàn)在充、淤血,可見于肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、胰腺和心肌表面。腺胃和食道黏膜表面可見多量的灰白色黏液附著,膽汁暗綠色。十二指腸段外觀略顯松弛,腸黏膜變薄,內(nèi)有少量黃色炎性分泌物。對28 d仍存活的鴨進行了組織病理學檢查,結(jié)果顯示在肝臟、脾臟、十二指腸、空腸、回腸、心肌、腦、胸腺、肺臟、腺胃、法氏囊等器官組織中均未見有明顯的顯微病理學改變。

A～C.感染鴨體質(zhì)量、喙長、喙寬的變化;D.不同時間點鴨的死亡個數(shù);E.感染鴨的臨床表現(xiàn)

2.5 rJNm的水平傳播試驗水平接觸組鴨的體質(zhì)量,在感染后7,14,21,28 d均低于對照組(P<0.01),但高于感染組(P<0.05)。感染后7 d喙長與對照組差異不顯著,在14,21,28 d則低于對照組(P<0.01)(圖3A)。感染后28 d,水平接觸組鴨喙長只有4.22 cm,感染組為4.08 cm,兩者間差異不顯著(P>0.05),而對照組喙長則為5.67 cm(圖3B)。水平接觸組鴨喙寬在4個測量時間點始終低于對照組,感染后28 d的喙寬為2.46 cm,低于對照組(2.87 cm),但高于感染組(2.16 cm),差異均顯著(P<0.05)(圖3C)。整個觀察期,在水平接觸組未見死亡病例,6只鴨的舌頭明顯外伸,占比67%,感染后28 d尤為明顯(圖3D)。與對照組相比,水平接觸組鴨站立仍不夠持久、喜蹲伏,叫聲低沉。對水平接觸組鴨于感染后29 d進行剖檢,沒有發(fā)現(xiàn)特征性眼觀病理變化,主要內(nèi)部器官中也未觀察到任何顯微組織學病理變化。

A～C.水平接觸組鴨的體質(zhì)量、喙長和喙寬;D.水平接觸組鴨舌頭外伸、向下彎曲

2.6 病毒載量和血清抗體檢測對水平傳播試驗中感染組和水平接觸組的肝臟、脾臟、回腸的病毒載量進行了分析比較。在感染后31 d,水平接觸組鴨脾臟的病毒載量達到109.1/g,而感染組中死亡鴨的脾臟病毒載量為108.9/g,兩者間差異不顯著(P>0.05)(圖4A)。水平接觸組鴨的肝臟、回腸的病毒載量分別為106.5/g和108.2/g,低于感染組中死亡鴨(P<0.01),后者肝臟和回腸的病毒載量分別為108.8/g和109.7/g。進一步的PCR擴增結(jié)果顯示,從水平接觸組鴨的脾臟、回腸提取的核酸模板中均能特異性的擴增出約800 bp片段,肝臟樣品未能擴出條帶(圖4B)。序列分析顯示,除了作為遺傳標記位點的突變外,擴增序列與親本株SDJN19完全一致(圖4C)。試驗結(jié)果表明rJNm可以通過水平接觸感染櫻桃谷北京鴨。通過瓊脂擴散試驗對血清抗體進行檢測,感染后31 d,水平接觸組中9只存活鴨的瓊擴效價平均值為5.38,而感染組存活的6只鴨的瓊擴效價平均值為4.83(圖4D)。結(jié)果表明水平接觸組鴨已經(jīng)激發(fā)了高水平的針對NGPV的血清沉淀抗體。

3 討論

自SBDS在我國暴發(fā)以來,發(fā)現(xiàn)在部分臨床病料中存在NGPV和鴨圓環(huán)病毒的共感染[10],因此,NGPV單獨感染是否足以引發(fā)SBDS的所有臨床癥狀尚需要進一步澄清。本研究中,通過反向遺傳學技術(shù),構(gòu)建了帶有遺傳標記的病毒rJNm。人工感染及水平傳播試驗結(jié)果均表明,單獨的NGPV感染櫻桃谷北京鴨能夠復制出SBDS的所有特征性臨床癥狀。在雛鴨感染試驗中,累計死亡率40%,但從感染后7 d才出現(xiàn)死亡病例,到感染后15 d出現(xiàn)最后1例死亡病例,中間間隔8 d,并且這些鴨從出現(xiàn)站立、行走困難到死亡多需要數(shù)天時間。相比之下,經(jīng)典型GPV人工感染2日齡雛鵝,多呈現(xiàn)急性死亡特征[14]。這表明NGPV和經(jīng)典型GPV對各自宿主存在著明顯的致病性差異和不同的致病特征。水平傳播試驗還表明NGPV具有明顯的水平傳播能力,至感染后28 d,水平接觸組多數(shù)鴨呈現(xiàn)出SBDS的所有典型特征,如喙短、舌頭外伸、增重緩慢、發(fā)聲低沉等,但這些鴨無一死亡,這與田間患上SBDS的櫻桃谷北京鴨死亡率極低、但感染率相對較高(10%～30%)的特征相符合[8]。

A.水平接觸組感染后31 d存活鴨和感染組中死亡鴨的病毒載量比較;B.水平接觸組存活鴨內(nèi)臟器官核酸樣本的PCR擴增(M.DL2000 DNA Marker;1,4.肝臟;2,5.脾臟;3,6.回腸);C.樣品擴增序列與親本株SDJN19相比較;D.水平接觸組鴨和感染組存活鴨的血清瓊擴抗體測定

通過熒光定量PCR,對感染試驗中死亡及存活鴨的臟器病毒載量進行了分析比較。水平接觸組31 d存活鴨的脾臟病毒載量仍能達到109/g,與死亡鴨的病毒載量(108.9/g)基本處于同一水平。這提示NGPV人工感染中死亡的鴨,與高病毒血癥可能并無直接關(guān)聯(lián)。由于NGPV感染對鴨的骨骼發(fā)育造成的影響尤為突出,表現(xiàn)為站立、行走困難和喙畸形,這些癥狀的出現(xiàn)對鴨采食、飲水帶來極大不利,增加了死亡概率。麻疹病毒、犬瘟熱病毒感染導致人的骨質(zhì)代謝異常引發(fā)的疾病已有報道[15-16],但NGPV感染是如何影響鴨骨質(zhì)代謝相關(guān)信號通路,進而直接影響骨骼發(fā)育,尚需進一步深入研究。

本研究還表明,NGPV對櫻桃谷北京鴨具有持續(xù)性感染的一面。檢測發(fā)現(xiàn),31 d水平接觸組所有存活鴨體內(nèi)呈現(xiàn)了高水平血清沉淀抗體,平均效價在5log2以上。盡管如此,在這些鴨的脾臟、回腸及肝臟中仍能檢出較高的病毒載量,尤其是脾臟病毒載量和死亡鴨脾臟中病毒載量幾無差異。通過常規(guī)PCR,從這些存活鴨的脾臟、回腸樣品中能擴增出清晰核酸條帶。對擴增靶片段的測序結(jié)果顯示,除了引入的遺傳標記,其余核苷酸序列與親本株SDJN19完全一致。這些結(jié)果表明,NGPV感染櫻桃谷北京鴨誘導產(chǎn)生的血清沉淀抗體不足以阻斷和清除NGPV在體內(nèi)的復制,表現(xiàn)為持續(xù)性感染。已知在細小病毒科成員中,水貂阿留申細小病毒和B19細小病毒能夠分別在水貂和人引起慢性、持續(xù)性感染[17-18]。NGPV在櫻桃谷北京鴨上產(chǎn)生持續(xù)性感染的機制值得進一步深入研究。由于櫻桃谷北京鴨商品代通常在40 d左右即可上市,因此感染了NGPV的鴨很可能持續(xù)排毒至上市前。由于GPV為無囊膜病毒,對外界環(huán)境抵抗力強,在“全進全出”飼養(yǎng)模式下,為控制SBDS的早期感染和傳播,對飼養(yǎng)場地的嚴格消毒就顯得格外重要。

總之,本研究證實單獨的NGPV感染櫻桃谷北京鴨可以復制出典型的SBDS癥狀,且NGPV具有顯著的水平傳播和持續(xù)性感染能力。本研究結(jié)果為進一步探索NGPV致病機制奠定了基礎(chǔ)。