可變剪接在小鼠早期胚胎發(fā)育中的作用研究進展

魏嘉瑞,代相鵬,張 勝,李子義

(吉林大學第一醫(yī)院 人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室,吉林 長春 130021)

胚胎發(fā)育是一系列復雜的細胞生物學事件所組成的有序動態(tài)過程,包括細胞分裂、生長以及向特定功能細胞命運分化的過程。著床前胚胎發(fā)育對胎兒的正常生長發(fā)育起著至關重要的作用,因此需要更為精確地調控。近年來,隨著高通量測序技術的出現(xiàn)以及不斷更新,使得對胚胎早期發(fā)育機制有了更深入的認知,尤其是胚胎發(fā)育過程中的mRNA選擇性剪接事件也不再神秘。先前大多數(shù)關于mRNA選擇性剪接調控的研究都是通過體外分析或基于細胞培養(yǎng)的系統(tǒng)進行的。直至近幾年,小鼠基因靶向技術的應用才提高了對剪接因子的生物學功能以及選擇性剪接產生特定蛋白異構體的重要性認識。因此,本綜述將簡要總結mRNA可變剪接在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中作用的研究進展以及相關剪接因子的敲除對早期胚胎發(fā)育的影響。

1 可變剪接

RNA前體的剪接,即內含子的去除和外顯子的連接,是成熟mRNA合成過程中一個關鍵且靈活的過程[1]。可變剪接(alternative splicing,AS)是指在前體mRNA中選擇不同的剪接位點,形成各種排列組合,從而擴大蛋白質組多樣性,其發(fā)生在被稱作剪接體的大型核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)復合體中[2-3]。

AS幾乎在真核生物的各個方面都發(fā)揮著重要作用,包括細胞生長、死亡、多能性維持、分化、發(fā)育和疾病等[4-6]。近期的高通量測序結果顯示,95%～100%的人類基因和63%的小鼠基因會發(fā)生剪接事件[7-8]。剪接包含以下幾種模式:外顯子跳躍(exon skipping,ES)、內含子保留(retention intron,RI)、可變的5′端(alternative 5′ splice site,A5SS)、可變的3′端(alternative 3′ splice site,A3SS)、可變第一外顯子(alternative first exon,AFE)、可變最末外顯子(alternative last exon,ALE)和互斥外顯子(mutually exclusive exon,MXE)[9-10]。

一般來說,剪接的過程是由復雜、動態(tài)的剪接體介導的。剪接體由5個小核糖核蛋白顆粒組成,包括U1、U2、U4/U6和U5。在剪接發(fā)生時,U1 snRNA(small nuclear RNA)以堿基互補的方式識別mRNA前體5′剪接位點,而結合在3′剪接點上游富含嘧啶區(qū)的U2AF識別3′剪接位點并引導U2 snRNP與分支點相結合,形成剪接前體。隨后,剪接前體與U4、U5和U6 snRNP三聚體相結合,形成60S的剪接體,此時內含子彎曲成套索狀,上、下游的外顯子相靠近,釋放U1、U4和U5、U2、U6形成催化中心,發(fā)生轉酯反應,引起前體RNA分子發(fā)生剪接(圖1)。

AS對于基因的表達及蛋白質的多樣性至關重要。REVIL等[11]研究了8～12 d小鼠胚胎中的剪接敏感外顯子芯片,發(fā)現(xiàn)AS在早期發(fā)育階段和組織中很常見。尤其是在哺乳動物植入前胚胎發(fā)育過程中非常普遍,其中ES和MXE類型占據(jù)很大比例。然而,AS在著床前發(fā)育過程中的具體調控模式尚不清楚。

圖1 可變剪接體的作用機制

2 早期胚胎發(fā)育過程中的AS

2.1 小鼠早期胚胎發(fā)育過程哺乳動物早期胚胎發(fā)育通過多個層次的細胞命運決定,最終形成了器官發(fā)生、形態(tài)建成的整個發(fā)育藍圖,是生命體誕生的最重要分子事件之一。哺乳動物的生命起始于精卵結合形成的受精卵,而后會經歷一段復雜的早期胚胎發(fā)育過程,即從1個細胞(受精卵)逐漸分裂分化形成1個含有上百種細胞類型、多種器官的復雜有機體。在小鼠中,早期胚胎發(fā)育包括受精(受精卵)和胚胎生長(2細胞、4細胞、8細胞、桑葚胚和囊胚)的序列成熟事件[12]。其中還包含合子基因組激活、胚胎致密化以及第1次細胞分化等多個關鍵事件,在這個過程中也受到表觀遺傳修飾、蛋白翻譯后修飾等多種途徑的調節(jié)。在囊胚階段出現(xiàn)內細胞團(inner cell mass,ICM)和滋養(yǎng)層細胞(trophectoderm,TE)的分化,然而最新研究表明,在4細胞或之前更早的時期就進行了第1次細胞命運決定,在這些過程中有多個轉錄因子和表觀修飾因子發(fā)揮重要作用。

研究表明,在哺乳動物的早期胚胎發(fā)育中AS是必不可少的[11]。然而,對其在早期胚胎發(fā)育中的范圍和功能的了解主要是基于一些單獨的案例研究。高通量測序技術的出現(xiàn)以及不斷更新,尤其是轉錄組測序(RNA-seq)技術的出現(xiàn),極大的推動了該方向相關的研究進程[13]。現(xiàn)在,選擇性剪接的研究己經從記錄單個剪接事件及其對蛋白質表達的影響,轉到描述全基因組范圍AS網(wǎng)絡及其如何進行分子協(xié)調上。使得對胚胎早期發(fā)育機制有了更加深入的了解。

2.2 胚胎在2細胞階段發(fā)生大量AS早期胚胎發(fā)育是一高度有序的過程,需要精確的時空基因表達調控。AS是1個重要的分子生物學事件,它將基因組指令轉變?yōu)楣δ艿鞍?在基因表達的調節(jié)中起著關鍵作用。通過對RNA-seq數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)AS在植入前的胚胎發(fā)育中非常普遍[14]。

AS調控著由單個細胞發(fā)育成1個成熟的生物體所需要的一系列形態(tài)變化事件,在近年來得到了廣泛研究,它可以大大增加轉錄組的復雜性[15]。然而,對于早期胚胎發(fā)育過程中AS調控的細節(jié)人們還知之甚少。

2010年REVIL等[11]利用微陣列芯片技術報道了小鼠胚胎8.5,9.5和11.5 d AS事件的發(fā)生。揭示了AS事件在整個發(fā)育階段和組織中都很常見,從而提出了AS對發(fā)育起著重要的調節(jié)作用[11]。然而,由于技術的限制,在植入前胚胎發(fā)育中的AS事件仍有待研究。隨著單細胞RNA測序的發(fā)展,成功形成了著床前胚胎發(fā)育中的轉錄組圖譜[16-17]。 2020年,TIAN等[14]發(fā)現(xiàn),AS事件在著床前胚胎發(fā)育過程中廣泛存在,并且鑒定出695個在2細胞發(fā)生AS的基因。發(fā)現(xiàn)與著床前胚胎發(fā)育的其他階段相比,AS事件在2細胞階段的發(fā)生更為廣泛。與此同時,XING等[18]也觀察到在受精卵和2細胞階段AS的發(fā)生數(shù)量顯著升高,提出AS可能在受精卵后被激活,尤其是在2細胞階段,這個過程被稱作合子AS活化(zygotic AS activation,ZASA)。通過觀察發(fā)現(xiàn)大多數(shù)AS事件屬于SE和MXE類型,這2種類型都常發(fā)生在2細胞階段。

3 剪接因子缺失導致胚胎發(fā)育阻滯

3.1 剪接因子剪接因子(splicing factor,SF)是參與前體RNA剪接過程的重要蛋白質因子,是所有AS調控的關鍵因素。SF表達異常會導致基因的AS發(fā)生改變,目前報道的SF主要包括hnRNP蛋白家族和SR蛋白家族。hnRNP蛋白主要抑制前體mRNA特定部位的剪接體形成,而SR蛋白主要促進剪接體的轉錄。目前2個蛋白家族已經得到了廣泛的研究。絕大部分SR蛋白對于個體的生長發(fā)育至關重要[19],特異性SR蛋白的失活可能會導致RNA代謝的多種缺陷,從而造成細胞死亡或影響早期胚胎發(fā)育,是調控剪接事件以及基因表達等方面的關鍵因素[20-21],并且它們經常與其他SF合作形成增強復合物,如TRA2、SRRM1和SRRM2[22]。

然而,SR蛋白和hnRNPs家族在選擇剪接位點和外顯子時通常有相反的作用,并以競爭的方式發(fā)揮作用[23]。ESEs和ISEs主要招募SR蛋白作為剪接激活因子,而ESSs和ISSs通常被hnRNPs蛋白識別,作為剪接抑制因子[24]。例如,β-原肌凝蛋白基因的6B外顯子的剪接依賴于G-rich內含子S3序列和6B外顯子的下游,它既可以作為增強子,也可以作為沉默子。ASF/SF2和SC35與S3結合,正向刺激6B外顯子的剪接,而hnRNPA1則競爭性地破壞它們的相互作用[25]。因此,SF的突變和剪接機制的失調會影響下游剪接靶點的網(wǎng)絡,導致癌癥、神經退行性疾病和代謝性疾病等人類疾病[26]。

3.2 剪接因子敲除致死事件剪接機制功能的完整性對于正常發(fā)育和組織特異性基因表達調控至關重要,人類疾病越來越多地歸因于剪接調控的紊亂。由于SF可能調節(jié)許多不同前體mRNA的選擇性剪接,在小鼠中敲除已知的SF通常對胚胎或者幼崽的生存能力有很大的影響。大多數(shù)SF敲除會導致胚胎發(fā)育停滯(表1)。能夠看到它們一部分在妊娠中期停止發(fā)育,一部分在臨產期或出生后幾周內死亡。這也更加印證了SF正確發(fā)揮作用在胚胎發(fā)育過程中的必要性。

更加徹底的分析需要基因靶向以及特異性的基因缺失,目前只對ASF/SF2和SC35進行了深入研究。ASF/SF2基因完全敲除缺失會導致7.5 d前的胚胎死亡;在心臟組織中特異性敲除發(fā)現(xiàn)這些小鼠以孟德爾比例出生,并開始正常發(fā)育,但在出生后6～8周死于心力衰竭[27]。此外,這些小鼠在大約4周齡時就出現(xiàn)了Ca2+代謝紊亂,并在整個剩余的生命周期中惡化,最終導致心臟收縮裝置的失效。SC35是一種典型的SR蛋白,最初被認為是參與剪接體組裝的多個步驟的必要SF[28-29],后來發(fā)現(xiàn)是可以影響選擇性剪接。SC35基因完全敲除同樣可導致7.5 d前的胚胎死亡,與心臟中ASF/SF2特異性缺失導致的出生后早期死亡相比,心臟中SC35特異缺失的小鼠表現(xiàn)出正常的活力[30-31]。然而,隨著年齡的增長,這些小鼠表現(xiàn)出擴張性心肌病的跡象。SRp20屬于高度保守的SR蛋白家族的SF[32],在體內組成性剪接和選擇性剪接的調控中具有重要作用。SRp20是第1個關于小鼠缺乏SR蛋白家族成員的報告,其被敲除后囊胚形成受阻,桑葚胚期著床前胚胎死亡[32]。PTB是一種廣泛表達的RNA結合蛋白,在RNA加工中發(fā)揮多種作用,包括選擇性外顯子的剪接、mRNA穩(wěn)定性以及mRNA的定位,2009年SHIBAYAMA等[33]報道了小鼠Ptb基因的純合子突變導致植入后不久的胚胎死亡。這些完全敲除或組織特異性敲除模型更加驗證了SF在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮了重要且非冗余的作用。

表1 剪接因子靶向缺失突變體的表型匯總

4 結語

前體mRNA的AS是基因表達調控的一種保守分子機制,在高等真核生物中普遍存在。隨著測序技術的不斷發(fā)展,人們建立了眾多數(shù)據(jù)庫用于對可變剪接體進行篩選,通過分子生物學驗證發(fā)現(xiàn),可變剪接體在調節(jié)動物發(fā)育和功能等方面具有十分重要的影響。目前,通過建立基因敲除模型,逐漸深入了可變剪接對胚胎發(fā)育的研究。然而,AS在發(fā)育過程中參與的信號通路、分子調控機制的研究中仍有很多空白需要填補。需要通過分子生物學技術與多組學技術的結合,對AS在胚胎植入前和植入后發(fā)育中的作用及分子機制展開更深層次的探究。