保定地區(qū)羊源致病性糞腸球菌的分離鑒定及其毒力性與耐藥性分析

林倩穎,侯銘源,賈 麗,楊 明,武英豪,李連敏,袁麗寧,馬玉忠*,楊 威

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000; 2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所,河北 保定 071000)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是一種兼性厭氧的革蘭陽性球菌,廣泛存在于自然界,是人和動物胃腸道內(nèi)定植的機會致病菌[1]。然而,根據(jù)近年來的研究發(fā)現(xiàn),人和動物感染糞腸球菌的病例不斷增加,在感染革蘭陽性菌的病例中,感染率僅次于葡萄球菌[2]。尿路感染、敗血癥、心內(nèi)膜炎等與糞腸球菌感染密切相關(guān)[3]。

近年來,抗生素在獸醫(yī)臨床與畜牧養(yǎng)殖上的廣泛使用導(dǎo)致動物源性糞腸球菌的耐藥性增強,感染率上升,為畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本試驗擬通過采集保定地區(qū)患有肺炎、腹瀉羊的樣本,對其進行藥敏試驗、致病性試驗、毒力基因檢測、耐藥基因檢測,探究河北保定地區(qū)羊源致病性糞腸球菌的毒力性與耐藥性,為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料KF鏈球菌瓊脂購自青島海博公司;LB肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基購自北京奧博星公司;藥敏片為杭州濱和微生物試劑公司生產(chǎn);2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker購自北京天根公司;16S rRNA基因通用引物、糞腸球菌毒力基因引物、耐藥基因引物由生工生物工程(上海)公司合成。6～7周齡SPF級BALB/c小鼠,雌、雄各1/2,體質(zhì)量20～24 g,購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 病料來源從保定地區(qū)選取同時發(fā)生肺炎和腹瀉的病羊30只,對病羊進行解剖和觀察病變組織,對病變組織拍照記錄并分析,取病羊肝臟、肺臟等病變組織,進行病原的分離鑒定。

1.3 細(xì)菌的分離純化將采集好的病變組織涂抹至營養(yǎng)瓊脂平板上,37℃ 恒溫培養(yǎng)24 h。挑取灰白色、針尖大小的圓形菌落,接種于LB肉湯中,37℃振蕩培養(yǎng)12 h,將菌液均勻涂布至KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,選擇深紅色圓形菌落純化培養(yǎng),隨后革蘭染色,鏡檢。

1.4 溶血性試驗將純化后的菌株接種至含有5%無菌綿羊血的營養(yǎng)瓊脂平板上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察其是否溶血,在5%綿羊血培養(yǎng)基上如有直徑1 mm左右圓形灰白色菌落,且呈現(xiàn)β溶血,可初步判斷為糞腸球菌。

1.5 16S rRNA鑒定采用水煮法提取細(xì)菌DNA作為模板,并用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)公司測序,測序結(jié)果在NCBI上BLAST比對。陽性菌株以菌液和滅菌甘油水1∶1 比例置于-20℃ 保存。

1.6 藥敏試驗采用K-B紙片擴散法,根據(jù)2018年美國臨床委員會(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn),對所分離出的糞腸球菌進行13種常見藥物的耐藥性測定。

1.7 致病性試驗將分離純化后的糞腸球菌接種至LB肉湯,37℃恒溫培養(yǎng)過夜,參考文獻[4]將菌液濃度調(diào)整至1.0×108CFU/mL。將90只小鼠隨機分為18組,每組5只,1組為對照組,其余17組為試驗組。試驗組小鼠分別腹腔注射0.2 mL菌液,對照組小鼠注射等量LB肉湯培養(yǎng)基,觀察其發(fā)病與死亡情況。剖檢死亡小鼠,記錄其病理剖檢變化。

1.8 毒力基因檢測采用PCR方法檢測膠原蛋白黏附素(ace)、表面蛋白(esp)、溶血素(cyl)、糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原(efaA)、蛋白明膠酶(gelE)、透明質(zhì)酸酶(hyl)、聚合物質(zhì)(asa1)等7種毒力基因。引物設(shè)計與退火溫度參照文獻[5-6],引物信息見表1。以待檢菌株DNA為模板進行擴增,將PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測。

表1 糞腸球菌毒力基因引物序列

1.9 耐藥基因檢測為檢測分離菌的耐藥基因攜帶情況,參考文獻[7-8]設(shè)計四環(huán)素類耐藥基因tetM、tetA,氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)、aph(2″)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅲa、ant(6)-Ⅰ,萬古霉素類耐藥基因vanM,大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB,β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM的引物,引物信息見表2。對目的菌株進行PCR檢測。

表2 糞腸球菌耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 病羊的病理剖檢變化剖檢病羊,觀察其組織器官病理變化,發(fā)現(xiàn)肺部淤血,呈暗紅色,表面有大量纖維素性滲出物,觸摸失去正常肺臟組織應(yīng)有的彈性(圖1);心臟壁變軟;膽囊腫脹,充滿膽汁(圖2);腎臟質(zhì)地變軟(圖3);皺胃黏膜出血,幽門部出血腫脹(圖4);盲腸出血,黏膜脫落。

2.2 細(xì)菌的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察分離出的細(xì)菌在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上長出表面光滑、圓形凸起、邊緣整齊、針尖大小的半透明菌落,呈β溶血,有溶血環(huán)(圖5)。革蘭染色鏡檢,油鏡下可見大量藍紫色球菌(圖6)。在KF 鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上長出紅色點狀菌落(圖7)。

2.3 16S rRNA鑒定以待測菌株DNA為模板,并用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI上BLAST比對,17株分離株與糞腸球菌的同源性為98%～99%,確定為糞腸球菌(圖8)。

圖1 肺部纖維素性滲出

圖2 膽囊腫脹

圖3 腎臟質(zhì)地變軟

圖4 皺胃黏膜出血

圖5 血平板上菌落形態(tài)

圖7 KF鏈球菌瓊脂平板上菌落形態(tài)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～11.被檢菌株

2.4 藥敏試驗?zāi)退幥闆r見表3,17株糞腸球菌對阿奇霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素4種藥物的耐藥率為100.00%。對氧氟沙星、萬古霉素、四環(huán)素、利福平的耐藥率較高,分別為88.24%,82.35%,64.71%和58.82%。對青霉素G耐藥率較低為0.00%。

表3 糞腸球菌耐藥率

2.5 致病性試驗試驗組小鼠注射菌液24 h內(nèi)出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、進食量減少等表現(xiàn),注射24 h 后開始出現(xiàn)死亡,72 h后試驗組小鼠全部死亡。對照組小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀。將死亡小鼠剖檢后發(fā)現(xiàn)(圖9),肝臟(圖10a)、脾臟(圖10c)腫大,脾臟表面有壞死灶,肺臟(圖10e)淤血,呈暗紅色,盲腸(圖10f)表面有出血點。死亡小鼠剖檢結(jié)果與病羊病理剖檢特點吻合,表明糞腸球菌感染可能是引起病羊發(fā)生肺炎、腹瀉的原因。

圖9 攻毒組小鼠剖檢圖

2.6 毒力基因共檢出6種毒力基因(表4,圖11～14),其中ace基因檢出率最高為100.00%。未檢出hyl基因。其中大多數(shù)菌株同時存在2種及以上毒力基因。

a.肝臟;b.心臟;c.脾臟;d.腎臟;e.肺臟;f.盲腸

M. DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

M. DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

表4 糞腸球菌毒力基因的檢測

2.7 耐藥基因共檢出5種耐藥基因(表5,圖16～18),大環(huán)內(nèi)酯類ermB基因(圖18)檢出率最高,為100%,β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因未檢出。

表5 糞腸球菌耐藥基因的檢測

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker ;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～5.被檢菌株

3 討論

糞腸球菌作為人和動物體內(nèi)的正常菌群發(fā)揮著重要的作用。近年來,糞腸球菌作為一種條件致病菌感染的病例越來越多,對人體健康和畜牧養(yǎng)殖都造成了嚴(yán)重的危害。研究表明,糞腸球菌與尿路感染、乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎、腦膜炎、感染性心內(nèi)膜炎等多重疾病的發(fā)生相關(guān)[9-10],而糞腸球菌與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)系報道較少。探究羊源致病性糞腸球菌的毒力性與耐藥性,對于指導(dǎo)對羊肺炎和腹瀉等疾病的用藥,控制該病的傳播具有重要意義。

本研究對河北保定地區(qū)發(fā)生肺炎和腹瀉的30只病羊進行剖檢,并對病變組織進行細(xì)菌的分離鑒定,共分離出17株糞腸球菌。將分離到的菌株接種到綿羊血瓊脂平板上,呈β溶血,證明分離到的糞腸球菌具有致病性,可以引起羊的敗血癥與菌血癥[11]。將分離到的菌株接種到小鼠體內(nèi),小鼠24 h內(nèi)出現(xiàn)臨床癥狀,72 h后全部死亡,說明分離到的糞腸球菌具有致病性。剖檢死亡小鼠可以發(fā)現(xiàn),肺部淤血,盲腸出血等癥狀,與病羊剖檢癥狀相吻合,表明糞腸球菌感染可能是引起病羊發(fā)生肺炎、腹瀉的原因。

本研究采用分子生物學(xué)的方法,對17株致病性糞腸球菌進行了7種常見的糞腸球菌毒力基因的檢測,均檢出了ace基因;此外,esp基因、gelE基因和efaA基因檢出率較高,與CRETI等[12]的檢測結(jié)果相似。ace基因為膠原蛋白黏附素,在糞腸球菌感染宿主細(xì)胞的過程中有輔助糞腸球菌黏附在宿主細(xì)胞表面并完成定殖的作用;efaA基因也是糞腸球菌的一種表面黏附蛋白;esp基因可以參與細(xì)胞壁的合成,有促進細(xì)菌黏附的作用;gelE基因與糞腸球菌生物膜的形成有關(guān),可編碼產(chǎn)生活性肽和自溶素,加速細(xì)菌的繁殖與擴散[13]。本試驗中糞腸球菌編碼黏附力的基因較多,細(xì)菌可能是由于較強的黏附性對機體造成的損傷;且具有能夠介導(dǎo)產(chǎn)生自溶素的基因,能使宿主細(xì)胞加速裂解,促進病原菌在宿主體內(nèi)擴散,這可能與糞腸球菌的致病性相關(guān),這與黃奕雯等[14]的觀點相似。本試驗檢出較多菌株同時含有多個毒力基因,因此糞腸球菌的致病過程可能與多種毒力基因共同作用有關(guān),這與王亞賓等[15]的研究結(jié)果相似。在致病性試驗中,試驗組小鼠被致病性糞腸球菌感染死亡,但存活時間均有差異,可能與不同致病性糞腸球菌菌株攜帶的毒力基因種類不同相關(guān)。

為探究分離株的耐藥性,本研究對其進行了藥敏試驗和耐藥基因的檢測。在13種常見藥物中,氨芐西林、阿莫西林、青霉素G等3種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率較低;在耐藥基因檢測中,β-內(nèi)酰胺類的耐藥基因未檢出。因此,在致病性糞腸球菌感染的病例治療過程中,可以優(yōu)先使用氨芐西林、阿莫西林、青霉素G等β-內(nèi)酰胺類藥物進行治療。在本試驗中,大多數(shù)藥物的耐藥率與其對應(yīng)種類藥物的耐藥基因檢出率相似或一致,如萬古霉素的耐藥率與萬古霉素類vanM基因的檢出率相同,均為82.35%;但也有個別藥物耐藥率與其對應(yīng)耐藥基因的檢出率的差異較明顯,如四環(huán)素的耐藥率和tetM基因的檢出率差異較大,分別為64.71%和35.29%。說明耐藥基因可以反映糞腸球菌的耐藥程度,但也可能會存在耐藥表型與耐藥基因不匹配的問題,造成差異的原因可能是耐藥基因未表達或存在其他耐藥機制,與鐘銳等[7]的試驗結(jié)果相似。通過藥敏試驗和耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn),糞腸球菌對阿奇霉素和紅霉素的耐藥性較強,且大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB的檢出率較高,可能由于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的濫用和養(yǎng)殖人員盲目用藥有關(guān),及時對疑似感染致病性糞腸球菌的病例進行病原菌分離鑒定與藥敏試驗對阻斷糞腸球菌的進一步感染具有重要意義。

本試驗通過對肺炎與腹瀉的病羊進行了糞腸球菌分離鑒定試驗,分析了保定地區(qū)羊源致病性糞腸球菌的毒力性與耐藥情況,為羊源致病性糞腸球菌的診斷和治療提供了依據(jù)。