1株黃牛源多源曼氏桿菌的分離鑒定與轉(zhuǎn)鐵結合蛋白B結構預測

朱玉紅,張疏桐,李志玲,徐雨蓓,楊雪贏,張貴東,韋國山,甘 玲,2*,郭建華,2*

(1.西南大學 動物醫(yī)學學院,重慶402460;2.西南大學 醫(yī)學研究院免疫學研究中心,重慶 402460)

牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)是一類多種病原、多種誘因?qū)е碌膫魅拘约膊?可引起牛肺炎、運輸熱、支氣管炎等病癥[1],嚴重危害肉牛養(yǎng)殖業(yè)[2]。導致牛呼吸道疾病綜合征的細菌性病原主要是多殺性巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、睡眠嗜血桿菌等巴氏桿菌科革蘭陰性菌[2]。其中,曼氏桿菌屬細菌是巴氏桿菌科中引起B(yǎng)RDC最重要的一個屬[3]。

曼氏桿菌屬(Mannheimia),原歸屬于溶血巴氏桿菌A型[4-5],ANGEN等[6]根據(jù)Southern雜交及16S rRNA序列分析的結果,建議建立這一新屬,至少包含5個種,分別為:溶血性曼氏桿菌(Mannheimiaheamolytica)、肉芽腫曼氏桿菌(Mannheimiagranulomatis)、葡萄糖苷曼氏桿菌(Mannheimiaglucosida)、反芻動物曼氏桿菌(Mannheimiaruminalis)、多源曼氏桿菌(Mannheimiavarigena)。其中,多源曼氏桿菌為多種反芻動物的上呼吸道及腸道的正常菌群,但當動物機體免疫力下降時,可引起牛的肺炎及乳腺炎,對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[7]。

轉(zhuǎn)鐵結合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)是一些革蘭陰性菌中暴露于外膜的脂蛋白,是巴氏桿菌科一些細菌重要的毒力因子,相對分子質(zhì)量通常在60～100 kDa之間,TbpB作為外周蛋白, 具有一定的抗原性,易表達純化而成為一個良好的疫苗設計的靶點,引起廣泛的研究興趣[8-10]。

本研究通過對某養(yǎng)殖場黃牛進行鼻拭子采集,從黃牛的鼻拭子中分離得到1株曼氏桿菌,并對該菌進行培養(yǎng)特性觀察、生化試驗、藥敏試驗、動物致病性試驗、16S rDNA PCR擴增及測序,并對其TbpB基因進行了擴增、測序和結構預測分析,旨在鑒定該病原菌的藥物敏感性和致病性,為疫病防制和疫苗研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病料采集及病原分離某肉牛養(yǎng)殖場老齡牛,呼吸困難、喘粗氣、流膿樣鼻涕、咳嗽劇烈、被毛粗亂、四肢乏力、便血、站立不穩(wěn)(圖1),剖檢發(fā)現(xiàn)肺纖維化嚴重,表面有白色滲出物,取剖檢后鼻咽拭子、肺內(nèi)容物等材料進行細菌細菌分離。將病料用無菌棉簽劃線接種于10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基,置于恒溫培養(yǎng)箱中,37℃燭缸培養(yǎng)24 h。經(jīng)分離純化后,得到1株細菌,命名為RC2110。

A.病牛臨床表現(xiàn);B.肺臟剖檢病變

1.2 形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察挑取培養(yǎng)物中灰白色針尖大小可疑菌落,挑取該菌落,于5 mL BHI(腦心浸出液肉湯)培養(yǎng)基中37℃,220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h,取37℃振蕩培養(yǎng)12 h的菌液2.5 μL進行涂片,分別進行革蘭染色、瑞氏-姬姆薩染色、孔雀石綠-番紅染色,鏡檢。取BHI培養(yǎng)基中菌種,稀釋至約109CFU/mL(D600=1.200),吸取菌液500 μL,加入500 μL 60%無菌甘油,置于-80℃保存。溶血性試驗,取5 μL菌液,劃線接種于10%綿羊血鮮血瓊脂培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察其是否出現(xiàn)溶血。

1.3 生化特性鑒定分離菌RC2110分別接種于葡萄糖、山梨醇、半乳糖、七葉苷、枸櫞酸鹽等生化反應管,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,進行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗吸取0.5麥氏濃度菌液200 μL,均勻涂布于BHI瓊脂平板,待菌液吸收后,37℃燭缸培養(yǎng)24 h后測量各藥物抑菌圈的大小(mm),根據(jù)藥敏紙片說明書及抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對各種藥物的敏感程度。

1.5 動物致病性試驗吸取1×109CFU/mL 分離株RC2110菌液0.2 mL,腹腔注射3周齡C57小鼠(體質(zhì)量約20 g),每只注射0.2 mL,對照組小鼠注射0.2 mL生理鹽水,每隔2 h觀察小鼠行為;若小鼠死亡,立即剖檢觀察并取病變器官進行涂片、瑞氏染色、鏡檢。

1.6 16S rDNA PCR與轉(zhuǎn)鐵結合蛋白B(tbpB)基因的擴增用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取細菌基因組根據(jù)文獻報道的16S rDNA通用引物及 GenBank中多源曼氏桿菌基因組,進行16S rDNA和tbpB基因PCR擴增,引物見表1,反應體系均為25 μL:Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye) 12.5 μL,上、下游引物(10 mmol/L,由重慶擎科興業(yè)生物技術有限公司合成)各1.0 μL,菌液(108CFU/mL)0.5 μL,以及將ddH2O補至25.0 μL。反應條件:95℃預變性5 min,95℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸90 s,共35個循環(huán);72℃10 min,4℃保溫。將PCR產(chǎn)物用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0膠回收試劑盒進行切膠回收后,送至重慶市擎科興業(yè)生物技術有限公司進行16S-27F單向測序和tbpB序列測通。

表1 試驗相關引物序列及擴增片段長度

1.7 16S rDNA基因序列及TbpB氨基酸序列進化分析根據(jù)GenBank中檢索巴氏桿菌科各種菌的代表菌株16S rDNA序列,與分離株RC2110進行序列比對分析,并構建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。同時,將測通后的tbpB基因序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列后,找到分離株RC2110 TbpB開放閱讀框,在NCBI上檢索流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、副豬嗜血桿菌(Haephilusparasuis)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、海藻糖比伯斯坦菌(Bibersteiniatrehalosi)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae) 等的tbpB,通過生物信息學軟件MEGA 7.0進行N-J系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.8 TbpB的結構預測分析通過I-tasser在線預測,以已經(jīng)發(fā)表的豬胸膜肺炎放線桿菌TbpB晶體結構為模板,對分離株RC2110 TbpB三維結構進行預測,保存為pdb格式。

2 結果

2.1 分離株RC2110生長狀況及形態(tài)

2.1.1分離株RC2110生長狀況 病牛鼻拭子培養(yǎng)物在巧克力瓊脂平板上可見生長良好,光滑、灰白色、透明、微凸起菌落,直徑2～3 mm,在10%綿羊血鮮血瓊脂上生長良好,有較明顯的溶血現(xiàn)象,在BHI液體培養(yǎng)基中生長良好,可在麥康凱瓊脂上貧瘠生長,48 h后可產(chǎn)生針尖大小紅色菌落,LB瓊脂不生長(圖2)。

A.10%兔血巧克力瓊脂培養(yǎng)基;B.10%綿羊血鮮血培養(yǎng)基;C.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基;D.LB瓊脂培養(yǎng)基

2.1.2分離株RC2110鏡檢形態(tài) 如圖3所示,革蘭染色可見革蘭陰性、短棒狀桿菌,可聚集成細長桿狀;瑞氏-姬姆薩染色可見明顯兩極著染桿菌,孔雀石綠-番紅染色未見芽孢。

A.革蘭染色 B.瑞氏-姬姆薩染色 C.孔雀石綠-番紅染色

2.2 細菌生化試驗由分離株RC2110生化試驗結果,可知分離株RC2110甲基紅、二乙酰、靛基質(zhì)等試驗為陰性,觸酶試驗、β-半乳糖苷試驗、硝酸鹽還原試驗為陽性,不發(fā)酵阿拉伯糖、半乳糖、海藻糖、麥芽糖等(表2),結合細菌生長狀況可鑒定為多源曼氏桿菌,與文獻[10]報道的生化結果一致。

表2 分離株RC2110生化鑒定結果

2.3 藥敏試驗如表3所示,該分離菌株對氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類抗生素有較強的耐藥性,對頭孢哌酮和氟喹諾酮類藥物敏感。

2.4 分離株動物致病性試驗結果注射菌液2 h后,小鼠精神沉郁、被毛粗亂、行動遲緩、呼吸急促,呈現(xiàn)腹式呼吸;4 h后,小鼠死亡1/2;6 h后小鼠全部死亡。將死亡小鼠剖檢,結果如圖4所示,與對照組(圖4A)相比,注射菌液死亡小鼠肺部腫脹,出血嚴重(圖4B),取肺臟組織進行觸片,瑞氏染色,油鏡下可見兩極著染桿菌(圖4C,紅圈處),與預期結果相符。

表3 藥敏試驗結果

2.5 16S rDNA與tbpB基因PCR結果如圖5所示,分離株RC2110 16S rDNA 和tbpBPCR擴增片段大小均與預期相符。

2.6 16S rDNA與TbpB系統(tǒng)發(fā)育樹構建結果采用Neighbor-Joining(NJ)法,利用生物信息學軟件MEGA7.0 對已完成測序分離株RC2110 16S rDNA和TbpB進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建,結果分別見圖6,7,結果顯示分離株16S rDNA基因序列與牛曼氏桿菌ZY190616株、肉芽腫曼氏桿菌ATCC49244株、多源曼氏桿菌10299株相似性最高,位于同一簇內(nèi),相似性超過97%,與腔隙莫拉菌相似性最低。分離株TbpB序列與溶血曼氏桿菌、多源曼氏桿菌相似性較高,位于同一簇內(nèi),但與其他菌的TbpB序列相似性較低。

A.對照組小鼠;B.注射菌液死亡小鼠;C.死亡小鼠肺臟觸片瑞氏染色結果

圖6 基于16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.7 TbpB結構預測分析結果分離株RC2110 TbpB是由586個氨基酸殘基構成的雙葉蛋白,由羧基端小葉(C-lobe)和氨基端小葉(N-lobe)組成,其中C-lobe有243個氨基酸殘基(綠色),N-lobe有278個氨基酸(洋紅色),紅色線狀結構為N末端,約66個氨基酸殘基,被稱為“錨定”結構,插入細菌外膜(圖8A)。每個小葉均由1個β-筒結構域(青色)和1個手柄結構(黃色)構成(圖8B)。

A.表面結構圖;B.卡通結構圖

3 討論

巴氏桿菌科細菌主要寄生于哺乳動物和鳥類上呼吸道和消化道黏膜上,產(chǎn)生致病作用,多為需氧及兼性厭氧菌[11]。曼氏桿菌屬作為巴氏桿菌科的一個屬,最初被認定為溶血巴氏桿菌,1999年,ANGEN等[6]通過Southern雜交和16S rRNA序列分析,確立了新的曼氏桿菌屬并將Mannheimiavarigena等6個種歸為新的曼氏桿菌屬[12]。

多源曼氏桿菌為革蘭陰性短桿菌,不發(fā)酵大多數(shù)糖、醇類物質(zhì)[4,7,13]。隨著貿(mào)易的發(fā)展,多源曼氏桿菌引起的疾病在國內(nèi)外時有發(fā)生,在我國吉林省[7]、愛爾蘭[14]、印度[6]和日本[15]均有該菌的分離報告。通過相關文獻可知,該菌可引起牛肺臟、腎臟、腦膜炎、乳房炎[16-17]等病變,并導致牛的死亡[14],可在牛乳中分離到該菌[13]。該菌對養(yǎng)牛業(yè)危害極大,但目前在我國報道較少。目前,細菌對抗生素的耐藥問題相當突出,細菌可通過減少抗生素流入量或增加抗生素外排、改變抗生素的分子性狀、修飾抗生素的靶標位點等方式使其產(chǎn)生抗生素耐藥性[17]。針對抗生素耐藥性,可通過使用抗菌肽、增強細菌代謝、選擇抗生素佐劑、選擇合適的細菌抗生素酶抑制劑、聯(lián)合用藥等[18-19]。結合本菌的藥敏試驗結果,可選擇喹諾酮類藥物和頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉進行聯(lián)合用藥抗菌治療。

TbpB是一種存在于細菌外膜表面的可溶性脂蛋白,2009年,有研究豬胸膜肺炎放線桿菌TbpB結構發(fā)現(xiàn),豬胸膜肺炎放線桿菌TbpB為雙亞基蛋白,有N-lobe(橙色)和C-lobe(黃色)2個亞基,每個亞基都含有1個8條肽鏈構成的β筒和1個富含β折疊結構的手柄結構域[20]。N-lobe位于細菌膜外,能與來自宿主的轉(zhuǎn)鐵蛋白直接進行結合[21]。TbpB包含1個N-末端延伸(藍色),稱為“錨定結構”,TbpB通過該結構插入細菌外膜[8,22]。此外,LEE等[23]發(fā)現(xiàn),TbpB作為外膜蛋白有較好的免疫原性,且在細菌鐵獲取中發(fā)揮重要作用,是細菌亞單位疫苗開發(fā)的理想蛋白。隨著結構生物學研究的不斷深入,越來越容易通過改變核酸堿基來改變蛋白結構,特別是在特定的位點改變重要氨基酸,來賦予新的蛋白新的功能。目前基于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為靶點的疫苗開發(fā)設計主要圍繞著TbpB進行,因為TbpB外在蛋白,直接暴露在細菌外膜外面,很容易在大腸桿菌表達與純化,被認為理想的疫苗設計靶點。一系列的TbpB結構被解析,各種來源的TbpB在結構上有保守性,通過在線預測與評價,本研究顯示曼氏桿菌TbpB結構與轉(zhuǎn)鐵蛋白一樣,也具有2個小葉組成:氨基端小葉(N-lobe)和羧基端小葉(C-lobe),且2個小葉各擁有1個β筒結構域和手柄結構域。

本研究對牛源多源曼氏桿菌進行了分離鑒定,并對其TbpB結構進行了模擬,為后續(xù)疫苗研發(fā)提供了理論基礎。