雞傳染性支氣管炎病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立與初步應(yīng)用

趙 佳,郭夢嬌,,張成成,薄宗義,楚電峰,曹永忠,吳艷濤,,張小榮,*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院 江蘇省動物重要疫病預(yù)防控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.動物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266114;3.揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,江蘇 揚(yáng)州 225009)

雞傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病[1],臨床上主要以呼吸道損傷和間質(zhì)性腎炎,母雞早期感染后呈現(xiàn)生殖系統(tǒng)不可逆的損傷,形成所謂的“假母雞”[2]。我國目前同時(shí)存在多個基因型IBV流行,并且新的型還在不斷出現(xiàn)[3-5],使得IB的流行情況日益復(fù)雜。

ELISA廣泛用于各種病原微生物感染的監(jiān)測,具有成本低、易于操作以及能對群體進(jìn)行診斷的優(yōu)勢。對于IB而言,疫苗免疫和野毒感染后的抗體應(yīng)答水平存在較大差異,野毒感染產(chǎn)生的抗體水平通常要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于疫苗免疫。針對特定的養(yǎng)殖場,在免疫程序相對固定的情況下,雞群免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的抗體“基線”水平基本一致,如果在監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)某個時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)抗體水平異常升高且離散度增大的情況,一般即可判定該雞群可能發(fā)生了野毒感染。

N蛋白是構(gòu)成IBV病毒粒子最主要的結(jié)構(gòu)蛋白,在不同血清型的IBV中相對比較保守,在IBV感染后,機(jī)體產(chǎn)生針對N蛋白的特異性抗體相對于其他結(jié)構(gòu)蛋白出現(xiàn)時(shí)間更早[6],對于監(jiān)測野毒的早期感染具有重要意義。本試驗(yàn)旨在以大腸桿菌原核表達(dá)的IBV N蛋白作為包被抗原,建立一種在固定血清稀釋倍數(shù)下對IBV抗體終點(diǎn)滴度進(jìn)行定量檢測的間接ELISA方法,可應(yīng)用于臨床IBV感染監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料表達(dá)IBV N蛋白的菌株BL21(DE3)/pET-N、QX型IBV弱毒疫苗株QXL87和強(qiáng)毒株QXL均由本實(shí)驗(yàn)室保存[7];SPF雞購自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司;SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司;不同時(shí)間采集的商品雞血清樣品由江蘇康瑞生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供;SPF雞血清由國藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司提供;新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、H5、H7、H9亞型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)陽性血清由青島易邦生物工程有限公司提供;雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum,MG)、滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)、副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 主要試劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程有限公司;Ni-NTA親和層析介質(zhì)購自南京金斯瑞生物科技有限公司;IBV抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司;脫脂奶粉購自Biofroxx公司;牛血清白蛋白(BSA)購自上海雙洳生物有限公司;魚明膠、Tween-20購自Sigma公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗雞IgG購自Thermo Fisher公司;TMB雙組分顯色液購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 IBV N蛋白的表達(dá)與純化按照文獻(xiàn)[7]方法對IBV的N蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并使用Ni-NTA親和層析法純化,通過SDS-PAGE鑒定純化效果,使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 陰、陽性血清的制備及效價(jià)測定16只25日齡的SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器,免疫前翅靜脈采血分離血清,作為陰性對照血清。首次免疫用QXL87弱毒疫苗株進(jìn)行滴鼻,之后每隔2周用QXL強(qiáng)毒株經(jīng)滴鼻途徑攻毒,劑量均為105.0EID50/0.1 mL,第3次攻毒1周后,通過病毒微量中和試驗(yàn)測定血清效價(jià)[8],效價(jià)達(dá)標(biāo)后(NI50達(dá)到4.50～7.00)心臟采血,分離血清作為陽性對照血清。

1.5 ELISA技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化

1.5.1抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的確定 通過棋盤滴定法[9]確定抗原的最佳包被濃度及血清樣品的稀釋倍數(shù),用碳酸鹽緩沖液(pH=9.60)將純化的重組蛋白的質(zhì)量濃度從4.000 g/L倍比稀釋至3.125×10-2g/L,將IBV陰性、陽性血清分別進(jìn)行1∶125～1∶4 000倍比稀釋,進(jìn)行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值來確定抗原最佳包被濃度與血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.5.2酶標(biāo)板封閉條件的確定 分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00% BSA-PBST、1.00% 魚明膠-PBST及5.00% 脫脂奶粉-PBST作為封閉液,并設(shè)置2,3和4 h的封閉時(shí)間,設(shè)置3個重復(fù),進(jìn)行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定最佳封閉條件。

1.5.3抗體稀釋液的選擇 分別以PBST、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%,0.50%和1.00% BSA-PBST作為抗體稀釋液,設(shè)置3個重復(fù),進(jìn)行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定最佳抗體稀釋液。

1.5.4血清樣品孵育時(shí)間的確定 分別設(shè)置30,60和90 min作為血清樣品稀釋后的孵育時(shí)間,設(shè)置3個重復(fù),進(jìn)行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定血清樣品的孵育時(shí)間。

1.5.5酶標(biāo)抗體工作條件的確定 分別對酶標(biāo)抗體進(jìn)行1∶5 000,1∶10 000,1∶15 000,1∶20 000倍稀釋,設(shè)置30,60和90 min的孵育時(shí)間,設(shè)置3個重復(fù),進(jìn)行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定酶標(biāo)抗體的最佳反應(yīng)條件。

1.5.6顯色時(shí)間的確定 分別設(shè)置10,15和20 min 3個顯色時(shí)間,設(shè)置3個重復(fù),進(jìn)行間接ELISA,讀取D450 nm值,通過P/N值確定TMB最佳顯色時(shí)間。

1.5.8特異性試驗(yàn) 分別以IBV、AIV(H5、H7、H9)、NDV、MS、MG、Apg的單因子陽性血清及SPF雞血清作為測試樣品,每份血清設(shè)置3個重復(fù),進(jìn)行間接ELISA,以檢測該方法的特異性。

統(tǒng)計(jì)血清樣品在不同稀釋倍數(shù)下的D450 nm平均值,與PNT基線交點(diǎn)的最大稀釋倍數(shù)定義為該血清樣品的抗體ET。從中選取12份低滴度(ET ≤ 1 000)、19份中滴度(1 000 4 000)共50份血清樣品,使用GraphPad Prism 8.0軟件求解其最佳稀釋倍數(shù)處S/P值與ET的線性回歸方程,以此方程來預(yù)測血清樣品的ET,建立的檢測IBV抗體滴度的ELISA方法命名為IBVN-ELISA。

表1 Y03與Y04雞群免疫程序

2 結(jié)果

2.1 IBV N蛋白的表達(dá)與純化對IBV N蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)和純化,通過SDS-PAGE分析蛋白純化情況,與文獻(xiàn)[7]描述的純化結(jié)果相符,灰度分析顯示重組蛋白的純度達(dá)到86.37%,定量分裝后-70℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 陽性血清的制備及效價(jià)測定經(jīng)病毒微量中和試驗(yàn)測定,制備的陽性血清中和抗體效價(jià)為:NI50=11.80。

2.3 ELISA技術(shù)參數(shù)的確定經(jīng)過條件優(yōu)化,通過P/N最大值確定了最佳反應(yīng)條件,最終確定抗原包被質(zhì)量濃度為0.50 g/L,4℃包被過夜,次日棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.00% 的脫脂奶粉-PBST在37℃條件下封閉2 h,棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%的BSA-PBST抗體稀釋液對血清樣品進(jìn)行1∶500倍稀釋后37℃孵育30 min,棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;酶標(biāo)抗體進(jìn)行1∶5 000倍稀釋后37℃孵育30 min,棄去孔中液體,PBST洗滌4次并拍干;TMB避光顯色20 min,加入濃度為2 mol/L濃硫酸終止顯色,立刻讀取D450 nm值。

2.5 特異性試驗(yàn)對IBV、NDV、AIV(H5、H7、H9)、MS、MG、Apg單因子陽性血清及SPF血清進(jìn)行間接ELISA檢測,除IBV陽性血清外,其他血清的S/P值均低于臨界值0.385,說明建立的方法與其他陽性血清無交叉反應(yīng),具有良好的特異性。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表2,批內(nèi)變異系數(shù)為0.740%～2.850%,批間變異系數(shù)為4.382%～6.769%。變異系數(shù)均低于10.000%,說明具有較好的重復(fù)性。

2.7 計(jì)算IBV抗體ET方程的建立選取50份通過PNT基線確定了抗體ET的血清樣品,通過軟件分析得出血清1∶500稀釋倍數(shù)處S/P值與抗體ET的線性回歸方程:log(ET)= 1.222 × log(S/P)+3.285,結(jié)果見圖1,相關(guān)系數(shù)(R2)達(dá)到0.959 3(P<0.000 1)。

2.8 符合性試驗(yàn)

2.8.1陰、陽性符合率驗(yàn)證 檢測了2個雞群共461份不同日齡商品雞的血清樣品,統(tǒng)計(jì)2種ELISA方法的檢測結(jié)果,如表3所示,與IDEXX試劑盒相比,IBVN-ELISA方法的總體樣品檢測符合率為93.06%,陽性檢測符合率為98.45%,陰性檢測符合率為64.86%。IDEXX試劑盒檢測為陰性,IBVN-ELISA檢測為陽性的26份血清均在14,21和28日齡,PNT基線法測定的結(jié)果均為IBV抗體陽性,滴度范圍為1 000～4 000。

表2 批內(nèi)和批間重復(fù)性結(jié)果

圖1 ET與S/P值(1∶500稀釋倍數(shù)處)的線性回歸方程

表3 陰性、陽性符合率驗(yàn)證

2.8.2抗體ET的消漲趨勢比較 分別計(jì)算在不同日齡時(shí)Y03和Y04 2個雞群的平均抗體ET并繪制折線圖,如圖2所示,2種ELISA方法檢測的抗體ET消漲趨勢保持一致。

2.8.3抗體ET分布情況比較 統(tǒng)計(jì)2種ELISA方法測得的陰、陽性血清的抗體ET,并繪制抗體ET分布散點(diǎn)圖,如圖3所示,IBVN-ELISA方法與IDEXX試劑盒測試的抗體ET分布情況基本相似。

2.8.4敏感性與特異性比較 通過ROC曲線分析2種ELISA方法的敏感性和特異性,如圖4所示,曲線下面積(AUC)為0.999 6,IBVN-ELISA方法的特異性達(dá)到100.00%,敏感性達(dá)到99.75%(P<0.000 1),與IDEXX試劑盒的檢測結(jié)果高度一致。

A.Y03雞群抗體ET消漲趨勢;B.Y04雞群抗體ET消漲趨勢

A.IDEXX-ELISA抗體ET分布圖;B.IBVN-ELISA抗體ET分布圖

A.IDEXX-ELISA敏感性與特異性分析;B.IBVN-ELISA敏感性與特異性分析

3 討論

我國是家禽養(yǎng)殖和消費(fèi)大國,肉雞和蛋雞養(yǎng)殖規(guī)模增長迅速,雞群進(jìn)行疫苗接種依然是防控IB最有效的措施,然而IBV極易發(fā)生重組和突變[11],變異毒株經(jīng)常在接種疫苗的雞群中暴發(fā)感染,導(dǎo)致免疫失敗。因此越早地監(jiān)測到野毒傳播,就可以盡快采取措施,及時(shí)降低經(jīng)濟(jì)損失。尤其對于蛋雞而言,及早發(fā)現(xiàn)野毒感染,能減小“假母雞”帶來的負(fù)面影響。目前國內(nèi)使用的IBV抗體檢測ELISA試劑盒基本都是進(jìn)口產(chǎn)品,價(jià)格比較昂貴,檢測成本較高。大多數(shù)市售的ELISA試劑盒以IBV全病毒作為包被抗原[12],由于IBV的高度易變性, 包被全病毒抗原的試劑盒對于不同血清型野毒感染產(chǎn)生的抗體水平,測定結(jié)果可能存在一定的差異。但是不同血清型IBV的N蛋白較為保守,具有良好的免疫原性,針對不同血清型IBV感染后的抗體檢測結(jié)果更加穩(wěn)定[13]。

本研究以原核表達(dá)的IBV N蛋白作為包被抗原,建立了檢測IBV抗體ET的ELISA方法。批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10.00%,具有良好的重復(fù)性;包被抗原與常見病原的陽性血清無交叉反應(yīng),具有較好的特異性;使用IDEXX試劑盒與本研究建立的IBVN-ELISA對2個不同品種雞群每隔1周進(jìn)行連續(xù)抗體監(jiān)測,結(jié)果表明2種方法檢測抗體ET的消漲趨勢保持一致,抗體ET的分布情況基本吻合;IBVN-ELISA的陽性符合率達(dá)到98.45%,陰性符合率為64.86%,其中26份IDEXX試劑盒檢測為陰性,IBVN-ELISA檢測為陽性的血清樣品均在14,21和28日齡,PNT基線法測定的結(jié)果均為IBV抗體陽性,與IBVN-ELISA的檢測結(jié)果一致,表明IBVN-ELISA能夠更靈敏的檢測到IBV特異性抗體;從方法的敏感性和特異性來看,IBVN-ELISA具有較高的特異性(100.00%)和敏感性(99.75%),且敏感性略高于IDEXX試劑盒。

不同的免疫程序及雞群品種的不同是IBV抗體ET及其消漲趨勢存在差異的主要原因[14]。此次監(jiān)測了2個免疫程序相同但品種不同的雞群,結(jié)果表明:2個雞群的抗體ET值及其消漲趨勢并不完全相同,1日齡時(shí)2個雞群均以母源抗體為主,抗體ET最高,之后不斷下降。Y03雞群的抗體ET在21日齡時(shí)開始升高,在35日齡時(shí)達(dá)到峰值;而Y04雞群的抗體ET在14日齡時(shí)開始上升,ET峰值出現(xiàn)在42日齡。通過IBVN-ELISA監(jiān)測不同品種雞群抗體ET及其消漲的規(guī)律并建立其抗體ET的基線在后續(xù)的研究計(jì)劃中將是很有意義的工作。

綜上所述,本研究建立的ELISA方法研制成本較低,穩(wěn)定性良好,特異性及靈敏度較高,有著較好的檢測效果,能夠?yàn)轲B(yǎng)殖場在雞群抗體監(jiān)測過程中發(fā)揮有效的檢測效力,為有效防控IB提供了技術(shù)支撐,具有良好的應(yīng)用前景。