基于QuEChERS-超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的茶葉中甲胺磷及乙酰甲胺磷對(duì)映體拆分及定量

王麗

摘要采用QuEChERS法提取，在以Chiral-Pak IC-3為色譜柱的超臨界流體色譜上拆分，大氣壓化學(xué)電離后串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測(cè)定。結(jié)果表明，茶葉中（+）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷的檢出限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg，平均回收率為70.53%～110.61%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.92%～13.30%。該方法能夠有效拆分和定量甲胺磷和乙酰甲胺磷對(duì)映異構(gòu)體。

關(guān)鍵詞QuEChERS；超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；茶葉；甲胺磷；乙酰甲胺磷；對(duì)映異構(gòu)體

中圖分類(lèi)號(hào)TS272文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）11-0156-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.038開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Separation and Quantification of Methamidophos and Acephate Enantiomer in Tea Based on QuEChERS-Supercritical Fluid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

WANG Li（Beijing Institute of Food Inspection and Research （Beijing Food Safety Monitoring and Risk Assessment Center），Beijing 100094）

AbstractExtraction was performed by QuEChERS method，separated on supercritical fluid chromatography using Chiral Pak IC-3 as the chromatographic column，and determined by atmospheric pressure chemical ionization followed by tandem quadrupole mass spectrometry.The result showed that the detection limit of （+）-methamidophos and （+）-acephate in tea was 5 μg/kg，the limit of quantification was 10 μg/kg.The average recoveries were 70.53%-110.61% and RSD were 2.92%-13.30%.This method can effectively separate and quantify methamidophos and acephate enantiomer.

Key wordsQuEChERS;Supercritical fluids chromatography-tandem mass spectrometry;Tea;Methamidophos;Acephate;Enantiomer

手性是指物質(zhì)本身立體空間結(jié)構(gòu)左右對(duì)稱(chēng)呈鏡像，如同人的左右手，相似卻不能重疊，是自然界本質(zhì)屬性之一［1］。受生產(chǎn)技術(shù)、成本及實(shí)際使用等條件的約束，目前世界上有近25%的商用農(nóng)藥具有對(duì)映異構(gòu)體［1］，而在我國(guó)這一比例估計(jì)超過(guò)40%［2］。在農(nóng)藥中手性對(duì)映異構(gòu)體常表現(xiàn)出不同的生物活性，一種對(duì)映體具有高靶標(biāo)活性的同時(shí)，另一種可能是低效或無(wú)效的。另一方面多數(shù)手性農(nóng)藥其中一個(gè)對(duì)映體比其外消旋體顯示出更強(qiáng)的急性毒性，且與其余對(duì)映體的急性毒性存在顯著差異［3］。如腈菌唑的（+）-對(duì)映體的抗菌活性是（-）-對(duì)映體的1.79～1.96倍，同時(shí)其毒性也更大［4］；多效唑的殺菌活性（2R，3R）-（+）-對(duì)映體高于（2S，3S）-（-）-對(duì)映體，但對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)活性則恰好相反；不同銳勁特的對(duì)映體在網(wǎng)紋水蚤體內(nèi)所表現(xiàn)出的急性毒性［5］和生殖毒性［6］也不同。目前，為保護(hù)環(huán)境和人體健康，很多國(guó)家和地區(qū)立法限定外消旋農(nóng)藥的使用，要求必須使用具有正向活性的單一異構(gòu)體，減少低活性異構(gòu)體的使用［7-8］。

甲胺磷和乙酰甲胺磷是高效的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，其分子結(jié)構(gòu)中均包含1個(gè)磷原子手性中心，分別有2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體。根據(jù)Bertolazzi等［9］的研究，（+）-甲胺磷具有潛在的神經(jīng)毒性，而（-）-甲胺磷則無(wú)法引起神經(jīng)損傷。乙酰甲胺磷、甲胺磷的（+）-對(duì)映體對(duì)家蠅的毒性較（-）-對(duì)映體更大［10］。（+）-甲胺磷對(duì)大型蚤的毒性是（-）-甲胺磷的7倍，而在體外牛細(xì)胞試驗(yàn)中，（-）-甲胺磷對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用比（+）-甲胺磷強(qiáng)8.0～12.4倍［11］。由于甲胺磷毒性強(qiáng)烈，2008年我國(guó)就停止對(duì)其生產(chǎn)使用，而乙酰甲胺磷雖可使用，但在植物體內(nèi)會(huì)轉(zhuǎn)化成甲胺磷［12］。在我國(guó)現(xiàn)行有效的食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中，甲胺磷、乙酰甲胺磷在茶葉中的最大殘留限量均為50 μg/kg，但標(biāo)準(zhǔn)僅針對(duì)外消旋體含量制定，因此，研究毒性不同的對(duì)映體的識(shí)別和定量分析技術(shù)，有利于更科學(xué)地評(píng)估其使用過(guò)程中的安全性。

近年來(lái)，手性農(nóng)藥的拆分及定量分析技術(shù)逐漸發(fā)展，伴隨手性固定相的不斷開(kāi)發(fā)，包括液相色譜［13-15］、氣相色譜［16-17］、毛細(xì)管電泳［18］等分離技術(shù)被運(yùn)用在手性化合物拆分工作中，有報(bào)道使用手性液相色譜［19］和氣質(zhì)聯(lián)用法［20］對(duì)甲胺磷或乙酰甲胺磷進(jìn)行了對(duì)映體拆分。超臨界流體色譜作為一種新型的分離方法，在手性化合物拆分上有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［21-22］，目前，已在包括有機(jī)磷類(lèi)［23］、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)［24］、砜亞胺類(lèi)［25-26］、三唑類(lèi)［27-28］、苯氧羧酸類(lèi)［29］等手性農(nóng)藥的對(duì)映體拆分中得到了應(yīng)用，但鮮見(jiàn)采用超臨界流體色譜對(duì)甲胺磷或乙酰甲胺磷進(jìn)行對(duì)映體拆分的相關(guān)報(bào)道。該研究建立了基于QuEChERS前處理技術(shù)、超臨界流體色譜（SFC）分離、串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)的茶葉中甲胺磷、乙酰甲胺磷對(duì)映體拆分及定量檢測(cè)的技術(shù)方法，以期為對(duì)映體活性研究奠定工作基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑藥品甲胺磷外消旋體（CAS10265-92-6，純度99%），購(gòu)自德國(guó)Dr.Erenstofer公司；乙酰甲胺磷外消旋體（CAS30560-19-1，純度98%），購(gòu)自美國(guó)USP公司；甲醇、異丙醇、乙腈、乙醇和甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)thermo Fisher公司；二氧化碳（純度99.99%）、高純氮（純度≥99.999%）、高純氬（純度≥99.999%），購(gòu)自北京亞南氣體公司；QuEChERS試劑包，購(gòu)于美國(guó)安捷倫科技；試驗(yàn)用水來(lái)自Milli-Q純化水系統(tǒng)，電阻率18.2 MΩ·cm。

1.2儀器設(shè)備島津超臨界色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Nexera UC），配有LC-30ADSF二氧化碳輸送泵、LC-20ADXR四元溶劑輸送泵、SFC-30A背壓調(diào)節(jié)單元、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器，購(gòu)自日本島津公司。LCMS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀，配有大氣壓化學(xué)電離源，使用高純氮?dú)庾黛F化氣和干燥氣，高純氬氣為碰撞氣，購(gòu)自日本島津公司。操作軟件為島津Labsolution v.5.82 SP1。Thermo X1R高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技。水平振蕩器，購(gòu)自德國(guó)IKA公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)自日本東京理化株式會(huì)社。

1.3色譜條件色譜柱為Daicel Chiral-pak IC-3 SFC柱（3.0 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相A為超臨界二氧化碳，B為異丙醇；梯度洗脫：0～4.0 min 10%～42%B，4.0～6.0 min 42% B，6.0～6.5 min 42%～10% B，6.5～10.0 min 10% B；流速2 mL/min，柱溫20 ℃；背壓10 MPa，進(jìn)樣體積1 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度10 ℃，洗針溶液為乙腈。

1.4質(zhì)譜條件甲胺磷對(duì)映體的質(zhì)譜參數(shù)為母離子142.0（m/z）， Q1預(yù)四級(jí)桿電壓-12 V，子離子94.2/125.2（m/z），Q3預(yù)四級(jí)桿電壓-15 /-20 V，碰撞能量-15/-18 eV；乙酰甲胺磷對(duì)映體的質(zhì)譜參數(shù)為母離子183.7（m/z）， Q1預(yù)四級(jí)桿電壓-14 V，子離子143.2/125.2（m/z），Q3預(yù)四級(jí)桿電壓-25/-20 V，碰撞能量-11/-18 eV；添加劑為1% （V∶V）甲酸甲醇溶液，以流速0.2 mL/min在進(jìn)入質(zhì)譜前與色譜餾出液混合。采用大氣壓化學(xué)電離源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集。離子駐留時(shí)間50 ms，霧化氣流速3 L/min，干燥氣流速5 L/min，碰撞氣壓力270 kPa，離子傳輸管溫度150 ℃，加熱模塊溫度200 ℃，接口溫度300 ℃。

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取甲胺磷、乙酰甲胺磷外消旋體各10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到濃度為10 mg/mL的外消旋體溶液。由于外消旋體為摩爾比1∶1的對(duì)映體混合物，因此在溶液中（+）-甲胺磷、（-）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷和（-）-乙酰甲胺磷的濃度均為5 mg/mL。使用前根據(jù)需要用異丙醇稀釋。

1.6樣品前處理茶葉樣品均購(gòu)自本地市場(chǎng)，并保存于干燥通風(fēng)的室溫環(huán)境中。樣品經(jīng)粉碎后，稱(chēng)取2.0 g，置于50 mL旋蓋離心管中，加入20 mL水充分浸潤(rùn)2 h以上，加入20 mL乙腈、4 g無(wú)水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉和0.5 g 倍半水合檸檬酸氫二鈉，劇烈振搖1 min，在水平振蕩器上以300 r/min 的轉(zhuǎn)速振搖15 min以混合均勻。8 000 r/min離心10 min，取12 mL上層清液，置于含1 200 mg MgSO4、400 mg C₁₈、400 mg N-丙基乙二胺（PSA）、45 mg石墨化炭黑（GCB）的凈化管中，渦旋振蕩5 min，取10 mL上清液，于40 ℃下旋蒸至近干，加入1.0 mL異丙醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1對(duì)映體拆分條件的優(yōu)化保留因子（k1、k2）、分離因子（α）及分離度（Rs）均用來(lái)評(píng)價(jià)不同色譜條件下對(duì)映體拆分的效果。若需要在色譜系統(tǒng)上達(dá)到良好的分離度Rs，則需要評(píng)估所選用色譜系統(tǒng)中目標(biāo)化合物的k1、k2值及α值，其中k1、k2值更多與色譜系統(tǒng)的固定相、流動(dòng)相及溫度等條件相關(guān)。因此在對(duì)映體拆分的優(yōu)化過(guò)程中，對(duì)固定相、流動(dòng)相（改性劑）的選擇以及有可能影響化合物色譜保留的SFC背壓和柱溫條件進(jìn)行研究。

選擇了Chiral-pak IC-3［3.0 mm×150 mm，3 μm，固定相纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基甲酸酯），Daicel］、Chiral-pak AD-H［4.6 mm×250 mm，5 μm，固定相直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯），Daicel］、Chiral-pak ID-3（3.0 mm×150 mm，3 μm，固定相直鏈淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯，Daicel）3款手性色譜柱及一款常規(guī)反相色譜柱CAPCELL PAK MGⅢ C₁₈（2.0 mm×150 mm，3 μm，固定相C₁₈，Shiseido）作為對(duì)比。流動(dòng)相總流速設(shè)置為2 mL/min，分別使用甲醇、乙腈、異丙醇、乙醇作為改性劑，改性劑梯度比例根據(jù)不同色譜柱進(jìn)行調(diào)整以達(dá)到合適的保留時(shí)間（1.5～6.5? min）。對(duì)比了甲胺磷對(duì)映體和乙酰甲胺磷對(duì)映體在相應(yīng)色譜條件下的分離度Rs。

表1為各柱在不同改性劑條件下的保留因子、分離因子及分離度。在常規(guī)反相柱（MGⅢ）上，使用甲醇、乙醇和乙腈作為改性劑時(shí)化合物在柱上無(wú)保留，且在部分改性劑（異丙醇）條件下甲胺磷和乙酰甲胺磷的對(duì)映體不能有效分離（Rs<1）。在使用手性固定相的情況下，在以直鏈淀粉-3-氯苯基氨基甲酸酯為固定相的ID-3柱以及以直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）為固定相的AD-H柱上，甲胺磷對(duì)映體均不能有效分離。在IC-3柱上使用甲醇、乙醇作為改性劑時(shí)，乙酰甲胺磷對(duì)映體也不能得到分離，對(duì)比使用乙腈和異丙醇的情況（圖1），在乙腈作為改性劑時(shí)，色譜基線(xiàn)較高，雜質(zhì)峰明顯，雖分離度比使用異丙醇時(shí)略有提高，但依然不能達(dá)到后續(xù)工作的要求；在異丙醇作為改性劑時(shí)，兩對(duì)對(duì)映體達(dá)到有效分離，Rs均不低于1.5，同時(shí)基線(xiàn)平穩(wěn)，無(wú)明顯干擾峰。因此，選擇IC-3手性柱作為分離介質(zhì)，異丙醇作為SFC改性劑。

在確定了色譜固定相和流動(dòng)相之后，對(duì)同樣能夠影響色譜保留時(shí)間的SFC背壓及柱溫也進(jìn)行了優(yōu)化，這二者在SFC色譜中對(duì)超臨界二氧化碳（scCO₂）的狀態(tài)起關(guān)鍵作用，進(jìn)而影響目標(biāo)物質(zhì)的保留和選擇性。該研究對(duì)比了不同背壓壓力（10、12、15 MPa）及不同柱溫（15、20、30、40、50 ℃）的組合對(duì)保留和分離的影響。從表2可以看出，在不同背壓條件下，不論柱溫如何，目標(biāo)對(duì)映體的保留時(shí)間變化不明顯，同時(shí)分離度也沒(méi)有改變。另一方面，對(duì)比不同柱溫發(fā)現(xiàn)，隨著柱溫的下降，乙酰甲胺磷對(duì)映體的分離度不斷增加，在20 ℃時(shí)，分離度達(dá)到4.0，柱溫繼續(xù)下降至15 ℃，分離度不再增加。這可能是由于二氧化碳的超臨界點(diǎn)為31.1 ℃、7.29 MPa，在SFC系統(tǒng)中，若柱溫低于31 ℃，柱內(nèi)CO₂是以液態(tài)存在，對(duì)目標(biāo)化合物的溶解度下降，此時(shí)，對(duì)對(duì)映體的選擇性主要依靠異丙醇與固定相的相互作用，因此分離度增加，在20 ℃以下，柱內(nèi)CO₂已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定的液態(tài)狀態(tài)，此時(shí)，CO₂僅作為流動(dòng)相載體存在，不具有任何色譜洗脫能力，因此溫度繼續(xù)下降，對(duì)映體的保留時(shí)間和分離度也不再改變；當(dāng)柱溫高于31 ℃時(shí)，柱內(nèi)CO₂以超臨界流體的狀態(tài)存在，對(duì)甲胺磷和乙酰甲胺磷的溶解度增加，流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力增強(qiáng)，出峰加快，導(dǎo)致保留時(shí)間提前，分離度降低。

2.2對(duì)映體洗脫順序的確定確定了色譜條件后，使用柱后接收的方式，利用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，制備得到了濃度大于1 μg/mL的單體化合物樣品，并使用在線(xiàn)旋光檢測(cè)器對(duì)其旋光度進(jìn)行分析，判斷每個(gè)洗脫峰的手性構(gòu)型。在SFC系統(tǒng)中，在同一離子通道中，對(duì)映異構(gòu)體的洗脫順序?yàn)椋?）-甲胺磷早于（-）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷早于（-）-乙酰甲胺磷。

2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化在電離源的選擇上，對(duì)比了使用電噴霧電離源和大氣壓化學(xué)電離源時(shí)目標(biāo)化合物的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)兩對(duì)對(duì)映體在APCI源電離下響應(yīng)均明顯高于ESI源。為了提高目標(biāo)對(duì)映體在質(zhì)譜內(nèi)的響應(yīng)，同時(shí)又不影響SFC的色譜分離效果，采用了柱后補(bǔ)償?shù)姆绞?，加入一定量的添加劑，以促進(jìn)目標(biāo)化合物電離，增強(qiáng)響應(yīng)。由于甲胺磷和乙酰甲胺磷均包含有含N基團(tuán)，在源內(nèi)易形成正離子，故對(duì)比了不同酸性濃度的添加劑對(duì)目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)的影響。在0.2 mL/min的流速下，在柱后分別添加0.1%、0.5%、1.0%、2.0%的甲酸甲醇溶液，從圖3～4可以看出，隨著甲酸甲醇溶液濃度升高，對(duì)映體的質(zhì)譜信號(hào)呈上升趨勢(shì)，在1.0%時(shí)達(dá)到最大值，之后，酸度繼續(xù)提高，對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的增強(qiáng)效果不明顯。

使用單針進(jìn)樣的方式對(duì)接口溫度、離子傳輸管溫度和加熱模塊溫度進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化，其中接口溫度為300、350、400 ℃，離子傳輸管溫度為150、200、250 ℃，加熱模塊溫度為150、200、250 ℃。優(yōu)化試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算3次試驗(yàn)平均值來(lái)進(jìn)行結(jié)果分析，確保離子源參數(shù)優(yōu)化的準(zhǔn)確性。從表3可以看出，接口溫度300 ℃、離子傳輸管溫度150 ℃、加熱模塊200 ℃的組合是最優(yōu)化的離子源參數(shù)。

2.4樣品前處理方法的選擇及優(yōu)化QuEChERS法已經(jīng)被證實(shí)為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留前處理的首選方法，該研究根據(jù)前期報(bào)道，也采用了QuEChERS法作為前處理技術(shù)。針對(duì)茶葉基質(zhì)，其主要含有豐富的黃酮、少量淀粉、氨基酸、揮發(fā)性物質(zhì)、有機(jī)酸、微量的其他化學(xué)成分（如咖啡因、色素）以及有可能被人為或污染而含有的農(nóng)藥殘留及污染物等，為了去除這些干擾雜質(zhì)，對(duì)前處理過(guò)程中提取劑及凈化手段進(jìn)行了優(yōu)化。

該試驗(yàn)選擇了4種不同配比的脫水劑，分別為Original（4 g MgSO₄+1 g NaCl）、CEN（4 g MgSO₄+1 g NaCl+1 g Na₃Cit+0.5 g 2Na₂HCit·1.5H₂O）、Vet（4 g Na₂SO₄+1 g NaCl）、AOAC（6 g MgSO₄+1.5 g NaAC），對(duì)比了使用乙腈為提取溶劑的情況下不同脫水劑對(duì)提取效率的影響，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，使用CEN前處理的樣品回收率高于其他3者。這可能是因?yàn)橛袡幟仕峋彌_鹽的存在，改變了飽和鹽溶液的pH，促使甲胺磷及乙酰甲胺磷對(duì)映體電離平衡向分子方向移動(dòng)，從而使更多的目標(biāo)物溶解進(jìn)入乙腈提取液中。

在QuEChERS法中，凈化劑的選擇對(duì)于去除雜質(zhì)、提高目標(biāo)化合物色譜峰的信噪比至關(guān)重要。C₁₈、PSA、GCB是最為常見(jiàn)的凈化吸附劑［30］。該試驗(yàn)選擇5種不同配比的凈化吸附劑，分別為ALN（750 mg MgSO₄+150 mg PSA+150 mg_C18+150 mg 中性氧化鋁）、GCB（200 mg GCB）、GCB+C₁₈（900 mg MgSO₄+150 mg GCB+150 mg C₁₈）、0029（1 200 mg MgSO₄+400 mg PSA+400 mg C₁₈+45 mg GCB）、High Pigment（900 mg MgSO₄+150 mg PSA+45 mg GCB），對(duì)比不同凈化吸附劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，使用0029（1 200 mg MgSO₄+400 mg PSA+400 mg C₁₈+45 mg GCB）作為凈化吸附劑，4種對(duì)映體的回收率均最高。有研究表明，PSA對(duì)茶多酚、葉綠素有凈化作用，GCB對(duì)咖啡因有凈化作用［31］，都能夠?qū)⒉枞~中有較大影響的干擾物去除，因此，0029吸附劑達(dá)到了更好的凈化效果，從而降低了基質(zhì)效應(yīng)，得到了更好的回收率。這也與Andrade等［32］的研究結(jié)果相一致。

2.5方法驗(yàn)證茶葉中甲胺磷和乙酰甲胺磷對(duì)映體經(jīng)由QuEChERS法提取，在以Chiral-Pak IC-3為色譜柱的超臨界流體色譜上拆分，大氣壓化學(xué)電離后串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測(cè)定。對(duì)該定量方法的基質(zhì)效應(yīng)、線(xiàn)性、靈敏度、回收率和精密度等指標(biāo)進(jìn)行了考察。

2.5.1基質(zhì)效應(yīng)。使用空白茶葉基質(zhì)，按“1.6”方法進(jìn)行樣品提取、得到空白基質(zhì)溶液。使用空白基質(zhì)溶液和異丙醇分別配制濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液。由茶葉中各對(duì)映體的基質(zhì)效應(yīng)［33］情況（圖7）可知，由于茶葉中基質(zhì)對(duì)電離的干擾較大，4種異構(gòu)體均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中（+）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷和（-）-乙酰甲胺磷的基質(zhì)效應(yīng)超過(guò)40%，基質(zhì)效應(yīng)明顯，在測(cè)定中可選擇基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量。

2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及靈敏度。配制濃度分別為5、10、20、50、100、200 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以甲胺磷和乙酰甲胺磷對(duì)映體的響應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線(xiàn)。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限（LOD），以10倍信噪比計(jì)算方法定量限（LOQ）。（+）-甲胺磷、（-）-甲胺磷、（+）-乙酰甲胺磷、（-）-乙酰甲胺磷的線(xiàn)性方程、決定系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限及定量限結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，各對(duì)映體在5～200 μg/kg線(xiàn)性關(guān)系良好，茶葉中4種對(duì)映體的檢出限和定量限分別為5和10 μg/kg。圖8為檢出限濃度下加標(biāo)樣品的提取離子流圖。

2.5.3回收率與精密度。取空白茶葉樣品，根據(jù)GB/T 27404—2008的要求，甲胺磷和乙酰甲胺磷均為有最大殘留限量（MRL）的化合物，在GB 2763—2016中，茶葉中甲胺磷外消旋體的MRL為50 μg/kg，外消旋體是對(duì)映體的等摩爾混合物，因此對(duì)于各對(duì)映異構(gòu)體，可看作MRL為25 μg/kg，同樣，茶葉中乙酰甲胺磷的外消旋體MRL為 100 μg/kg，對(duì)映體MRL為50 μg/kg。 制備濃度分別為10 μg/kg（定量限點(diǎn)）、25 μg/kg（甲胺磷MRL點(diǎn)）、50 μg/kg（乙酰甲胺磷MRL點(diǎn)）3個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品，在優(yōu)化后的條件下測(cè)定目標(biāo)化合物，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，結(jié)果如表5所示。由表5可知，使用所建立的方法對(duì)茶葉中甲胺磷及乙酰甲胺磷對(duì)映體進(jìn)行定量測(cè)定，平均回收率為70.53%～110.61%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.92%～13.30%。

2.6實(shí)際樣品測(cè)定及方法對(duì)比購(gòu)入市售茶葉15份，涵蓋綠茶、花茶、紅茶等主要干制茶，按“1.6”方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。其中某一綠茶樣品檢出（+）-乙酰甲胺磷21.7 μg/kg、（-）-乙酰甲胺磷19.9 μg/kg，其離子流色譜圖見(jiàn)圖9，通過(guò)陽(yáng)性樣品的離子流色譜圖可以看出，乙酰甲胺磷對(duì)映體在茶葉上的殘留并不會(huì)隨時(shí)間的變化而互相轉(zhuǎn)化，按外消旋體進(jìn)行判別則此綠茶中乙酰甲胺磷的殘留量為41.6 μg/kg。在后續(xù)工作中對(duì)乙酰甲胺磷對(duì)映體的毒性進(jìn)行進(jìn)一步研究，可以開(kāi)展單一對(duì)映體農(nóng)藥的使用推廣，并進(jìn)一步針對(duì)每種對(duì)映體規(guī)范限量。

上述陽(yáng)性樣品的檢出值與使用GB 中氣相色譜法所得到的結(jié)果（外消旋體殘留量）進(jìn)行了對(duì)比，氣相色譜法所得到的結(jié)果為39.7 μg/kg。由此可見(jiàn)，所建立的SFC方法不僅試驗(yàn)的環(huán)境友好度更高、穩(wěn)定性更好，同時(shí)能在檢出值無(wú)明顯差別的情況下分離對(duì)映異構(gòu)體。

3結(jié)論

該研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的基于超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的茶葉中甲胺磷、乙酰甲胺磷對(duì)映體拆分及定量檢測(cè)方法。優(yōu)化了不同色譜柱、改性劑、柱溫和背壓等色譜條件，兩對(duì)對(duì)映體達(dá)到有效分離，基線(xiàn)平穩(wěn)，并優(yōu)化了質(zhì)譜條件以保證方法靈敏度。在基于QuEChERS法的前處理技術(shù)中經(jīng)優(yōu)化選擇了CEN（4 g MgSO₄+1 g NaCl+1 g Na₃Cit+0.5 g 2Na₂HCit·1.5H₂O作為脫水劑，0029（1 200 mg MgSO₄+400 mg PSA+400 mg C₁₈+45 mg GCB）為凈化吸附劑。經(jīng)方法確認(rèn)，方法檢出限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg，滿(mǎn)足已經(jīng)制定的MRL檢測(cè)的需求。同時(shí)線(xiàn)性、回收率、精密度等指標(biāo)均滿(mǎn)足相關(guān)方法學(xué)考察的要求。通過(guò)實(shí)際樣品測(cè)試及對(duì)比，該方法在檢測(cè)速度、準(zhǔn)確度及環(huán)境友好度上具有優(yōu)勢(shì)，并且能夠有效拆分和定量甲胺磷和乙酰甲胺磷對(duì)映異構(gòu)體，為進(jìn)一步研究提供方法參考。

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