金魚草TPS基因家族的全基因組鑒定和表達(dá)模式分析

石森堡,譙正林,王鳳儀,胡慧貞,陳龍清

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心,昆明 650224)

【研究意義】萜烯類化合物是植物中最大的一類次生代謝產(chǎn)物,在植物生長發(fā)育階段具有多種功能[1],例如吸引傳粉者、釋放揮發(fā)性報(bào)警素、抑菌等,在植物與環(huán)境互作過程中發(fā)揮著重要作用[2-4],引起人們廣泛關(guān)注。萜烯合酶(Terpenoid synthase, TPS)是合成萜烯類物質(zhì)的關(guān)鍵酶,在植物生長發(fā)育過程中具有多種功能。金魚草(AntirrhinummajusL.)為車前科金魚草屬多年生草本植物,其花型獨(dú)特、色澤豐富、花香濃郁,是重要的切花及花壇花卉;具有清熱解毒、涼血消腫之功效,藥用價(jià)值較高;種子營養(yǎng)豐富,可榨油食用。同時,金魚草是研究花卉發(fā)育的重要模式植物。萜烯類化合物作為金魚草花香揮發(fā)物中占比最大的一類,研究其形成機(jī)理對于金魚草花香種質(zhì)的創(chuàng)制及品種培育具有重要意義。萜烯合酶基因TPS是催化萜烯類有機(jī)化合物合成的關(guān)鍵酶基因,對TPS基因的鑒定和萜烯類化合物的合成機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】TPS基因有7個亞家族:TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h。其中,TPS-a、TPS-b和TPS-g是被子植物特有的分支,TPS-d主要集中在裸子植物中[5],而TPS-h到目前為止僅在卷柏中發(fā)現(xiàn)[6-7]。萜烯類化合物的合成途徑已較為清晰,主要由2條途徑生成,即甲羥戊酸途徑(MVA)[8]和甲基赤蘚醇磷酸途徑(MEP)[9]。MVA途徑發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中,兩分子的異戊烯基焦磷酸(IPP)和一分子的二甲基烯丙基焦磷酸鹽(DMAPP)在法尼基二磷酸合酶(FPPS)的催化下縮合生成法尼基二磷酸合酶(FPP),該物質(zhì)是倍半萜的天然前體[10]。MEP途徑在質(zhì)體中發(fā)生,一分子IPP和一分子DMAPP在香葉基二磷酸合酶(GPPS)催化下頭尾縮合形成的牻牛兒基二磷酸鹽(GPP)是所有單萜的普遍前體。一分子DMAPP與三分子IPP在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)的作用下縮合生成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP),是二萜合成的前體[3]。雖然MVA和MEP 2條途徑相互獨(dú)立,但I(xiàn)PP及其異構(gòu)體DMAPP是這2條途徑的通用前體,可以通過質(zhì)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[1,8]。2019年發(fā)布的金魚草全基因組精細(xì)圖譜[11]為金魚草基因功能研究和分子育種奠定了基礎(chǔ)。目前對金魚草萜烯類化合物的研究主要集中在相關(guān)單萜和倍半萜合酶基因的表達(dá)及驗(yàn)證上。例如橙花醇/芳樟醇(AmNES/LIS-1和AmNES/LIS-2)合酶為雙功能酶,在質(zhì)體中生成芳樟醇,而在胞質(zhì)中生成橙花醇[12-13]。羅勒烯合酶(ama0a23)與月桂烯合酶(ama1e20、ama0c15)基因也被分離并鑒定[13]。此外,Wright等[14]發(fā)現(xiàn),月桂烯和I-β-羅勒烯生物合成基因的表達(dá)和/或相應(yīng)酶會受到底物香葉基二磷酸親和力的控制,導(dǎo)致月桂烯和(E)-β-羅勒烯釋放量的不同。Zeng等[15]發(fā)現(xiàn),金魚草中兩種單萜烯[月桂烯和(E)-β-羅勒烯]的排放受內(nèi)源調(diào)節(jié)劑的影響。【本研究切入點(diǎn)】隨著越來越多的植物全基因組圖譜的發(fā)布,利用生物信息學(xué)來挖掘物種功能基因已成為重要手段。目前已完成擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、葡萄(VitisviniferaL.)、番茄(SolanumlycopersicumL.)等物種TPS基因家族鑒定和分析[16-19],但AmTPS基因家族的相關(guān)研究尚未報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以金魚草全基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),篩選AmTPS基因家族成員,利用生物信息學(xué)方法鑒定AmTPS基因,并對基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序、順式作用元件進(jìn)行分析,探討TPS基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位和共線性、相關(guān)酶蛋白質(zhì)理化性質(zhì)并進(jìn)行了亞細(xì)胞定位預(yù)測,通過qRT-PCR分析候選基因在不同器官中表達(dá)水平,并利用GC-MS測定其花香成分,確定金魚草主要花香揮發(fā)性萜烯類化合物生物合成的TPS基因,為進(jìn)一步解析AmTPS基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以金魚草矮株花雨系列粉色品種(A.majusL.‘Floral Showers Rose Pink’,以下簡寫為SR)為植物材料,栽植于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)后山溫室大棚內(nèi),在自然光和20 ～ 25 ℃下正常生長。在盛花期取其花、葉、莖、根等組織于凍存管中,立即放入液氮冷卻,后放入-80 ℃冰箱備用。

1.2 數(shù)據(jù)來源

本研究使用金魚草基因組數(shù)據(jù)[11]。從擬南芥信息資源網(wǎng)站TAIR(https://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥TPS蛋白序列,番茄TPS蛋白序列來自Falara[19]的研究,水稻、冷杉(Abiesfabri)、江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)的TPS蛋白序列來自Yu等[20]的研究。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金魚草TPSs基因家族鑒定 利用TBtools提取金魚草基因組CDS并轉(zhuǎn)化為蛋白序列。擬南芥的TPS蛋白序列與金魚草蛋白序列作BLAST比對(E-value<1×10-5),獲得候選AmTPS基因,將獲得的序列比對到SwissProt數(shù)據(jù)庫去除重復(fù),再利用NCBI的CDD-Search、PFAM、SMART進(jìn)一步篩選,同時含有PF03936、PF01397保守結(jié)構(gòu)域的為AmTPS基因。

1.3.2 保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析 利用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)對AmTPS基因進(jìn)行蛋白保守基序分析,根據(jù)AmTPS基因序列及基因組GFF3數(shù)據(jù)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析,TBtools可視化。

1.3.3 順式作用元件分析 為確定TPS基因在金魚草中的潛在生物學(xué)作用,提取AmTPS基因起始密碼子(ATG)上游2000 bp序列,利用線上軟件PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對AmTPS基因啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用1.2得到的蛋白數(shù)據(jù),使用軟件Clustal 11.0將AmTPS蛋白進(jìn)行序列比對,對gap或者兩端的冗余序列進(jìn)行處理,在序列較短的情況下,人為手動刪除、調(diào)整。使用軟件MEGA 11構(gòu)建鄰接法(Neighbor-Joining Method,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹,設(shè)置Bootstrap值為1000,并利用iTOL美化系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 染色體定位與共線性分析 使用金魚草基因組數(shù)據(jù),通過TBtools進(jìn)行利用染色體定位及可視化。

1.3.6 蛋白理化性質(zhì)分析 利用ExPASy(https://www.expasy.org/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測AmTPS蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、分子量、脂肪族系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、親水/疏水性等理化性質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測使用線上軟件Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)和WoLF PSORT tools(https://wolfpsort.hgc.jp/)。

1.3.7 不同器官的qRT-PCR表達(dá)分析 用北京艾德萊生物公司RNA試劑盒提取金魚草根、莖、葉、花(盛開期)的總RNA。用博邁德生物公司M-MLV4 First-Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA。通過軟件Premier 5進(jìn)行qRT-PCR引物設(shè)計(jì)(表1),以金魚草泛素基因(AmUBI)為內(nèi)參[21]。qRT-PCR參照HieffTM qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒(上海)說明書,反應(yīng)為體系20 μL;反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 5 s,72 ℃ 12 s,40個循環(huán);3次生物學(xué)重復(fù)?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算。

表1 金魚草AmTPS基因家族的 qRT-PCR引物

1.3.8 GC-MS花香成分測定 本研究采用固相頂空微萃取技術(shù)對金魚草盛花期花朵揮發(fā)物進(jìn)行收集,使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 金魚草TPSs成員的鑒定

以TPS蛋白保守的C端(PF03936)和N端(PF01397)結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(HMM)作為查詢文件,與金魚草基因組雙向BLAST。除去冗余序列,將所獲得的TPS基因提交到NCBI-CDD Search中進(jìn)一步驗(yàn)證TPS保守結(jié)構(gòu)域的存在,共鑒定出30個AmTPS基因,將已鑒定的AmTPS基因命名為AmTPS1～AmTPS30(表2)。

表2 金魚草TPS基因家族的基本特征

2.2 金魚草TPSs基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

如圖1所示,以AmTPSs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,30個AmTP蛋白分布在4個亞家族中?；蚪Y(jié)構(gòu)顯示,AmTPS基因外顯子數(shù)量在3～13個,其中AmTPS2含有外顯子數(shù)量最多(13個),而AmTPS8含有外顯子數(shù)量最少(3個)。17個AmTPS基因(56.7%)有7個外顯子。大多數(shù)聚類在一組的AmTPS基因有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu),特別是在外顯子長度與數(shù)量方面,相似的基因也會聚類在一起。

圖1 金魚草TPS基因結(jié)構(gòu)分析

對AmTPS蛋白的20個保守基序進(jìn)行分析表明(圖2),基序2(DD×XD)出現(xiàn)次數(shù)最多,每個基因均至少出現(xiàn)1次,共出現(xiàn)31次(AmTPS2出現(xiàn)2次)。其次為基序1,共出現(xiàn)29次,除AmTPS1、AmTPS10未出現(xiàn),AmTPS2出現(xiàn)2次外,剩余AmTPS蛋白均出現(xiàn)1次?；?6出現(xiàn)次數(shù)最少,僅出現(xiàn)6次。AmTPS2比較特殊,具有最多的保守基序,共出現(xiàn)32個保守基序,除基序15、基序17僅出現(xiàn)1次,基序16、基序18、基序20未出現(xiàn)外,其余基序均出現(xiàn)2次,且2次基序順序具有極高的一致性。AmTPS13、AmTPS7顯示最少的保守基序(僅7個),但后者基序11出現(xiàn)2次。盡管不同簇之間的基序類型不盡相同,但在同一簇內(nèi)的AmTPS蛋白通常具有相似的基序,暗示AmTPS蛋白系統(tǒng)發(fā)育模型可能受到基序位置的影響。

圖2 金魚草TPS蛋白保守基序分析

2.3 金魚草TPSs基因啟動子順式作用元件的鑒定

AmTPS基因順式作用元件可分為植物生長與發(fā)育,抗逆、脅迫響應(yīng)和植物激素響應(yīng)三類順式元件(圖3)。在植物生長與發(fā)育類元件(411/801)中,發(fā)現(xiàn)了13種參與光響應(yīng)、分生組織表達(dá)(CAT-box)、開花表達(dá)(CCAAT-box)、晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian)、柵欄葉肉細(xì)胞分化(HD-Zip1)、醇溶蛋白代謝(O2-site)和種子特異性調(diào)節(jié)(RY-element)的順式元件,其中G-box元件占比最高,為27%。在所有順式元件中,抗逆、脅迫響應(yīng)元件(69/801)較少,僅有5種,分別是缺氧誘導(dǎo)相關(guān)的GC-motif,低溫、干旱相關(guān)的LTR、MBS,防御壓力相關(guān)的TC-rich repeats,以及參與黃酮類合成的MBSI。激素響應(yīng)元件(321/801)數(shù)量僅次于植物生長與發(fā)育元件,由脫落酸響應(yīng)元件(ABRE、ARE)、赤霉素響應(yīng)元件(GARE-motif、P-box、TATC-box)、水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)以及生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core、TGA-box、TGA-element)組成。綜合上述,其生長與發(fā)育元件最多,抗逆、脅迫響應(yīng)元件較少,可能是長期人工種植的結(jié)果。

圖3 金魚草TPS啟動子中順式作用元件的分析

2.4 金魚草TPS蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明,TPS蛋白分為7個亞家族[5]。AmTPS家族成員含有4個亞家族,96.66%的AmTPS蛋白集中在3個亞家族TPS-a、TPS-b、TPS-g之中,分別占比15/30、5/30、9/30,其中2/3的AmTPS屬于TPS-a或TPS-b亞家族;TPS-e/f 亞家族中僅有AmTPS7。如圖4所示,在TPS-a亞家族中,雙子葉植物(金魚草、番茄、擬南芥)和單子葉植物(水稻)分別聚類,與前人研究結(jié)果TPS-a1、TPS-a2一致,表明TPS-a亞家族是獨(dú)立進(jìn)化的[6]。與之相似的還有TPS-c,在單子葉和雙子葉植物中分別聚類[22]。TPS-d亞家族并非裸子植物特有的,在菠蘿(Ananascomosus)與地錢(Marchantiapolymorph)中也有發(fā)現(xiàn)[7];而TPS-h僅存在于江南卷柏中[23]。

圖4 6種高等植物中TPS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 金魚草TPSs基因染色體定位和共線性分析

如圖5所示,AmTPS基因定位在1、2、5、6、8號染色體,其中2號染色體中TPS基因數(shù)量最多(19個)。其次為1號和5號染色體,各出現(xiàn)5和4個TPS基因,6號和8號染色體各有1個TPS基因。從亞家族分類情況來看,TPS-a在4條染色體中均有分布,但主要集中在2號染色體上;TPS-b主要集中在5號染色體上,在1號染色體中僅存在TPS17;TPS-e/f定位在2號染色體中;TPS-g僅出現(xiàn)在2號染色體上,且定位較為集中?；驈?fù)制事件顯示,AmTPS基因僅在AmTPS28和AmTPS12以及AmTPS5和AmTPS10之間存在串聯(lián)重復(fù)(圖4)。為研究AmTPS基因在進(jìn)化過程中受到何種選擇,計(jì)算了非同義突變頻率(Ka)和同義突變頻率(Ks)的比值(表3),發(fā)現(xiàn)AmTPS串聯(lián)復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks值為0.4078,比值小于1,說明所有AmTPS復(fù)制事件在金魚草進(jìn)化過程中都受到了純化選擇。

紅色、橙色、綠色和藍(lán)色分別表示TPS-a、TPS-b、TPS-g、TPS-e/f;紅弧線表示串聯(lián)重復(fù)。

表3 金魚草TPS基因同義和非同義替換率及其比值

2.6 金魚草TPS蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

如表2所示,AmTPS開放閱讀框(ORF)為873～3372 bp,預(yù)測氨基酸數(shù)量(AA)為291～1124 aa。蛋白分子量(MW)為34.392～131.778 KDa;理論等電點(diǎn)(pI)為4.98～6.98,均小于7,為酸性氨基酸;疏水平均值(GRAVY)為-0.464 ～ -0.24,均小于0,屬于親水蛋白;AmTPS蛋白的脂肪族指數(shù)(AI)為80.78～97.8;蛋白不穩(wěn)定指數(shù)(II)為34.19～56.58,11/30為穩(wěn)定蛋白,19/30為不穩(wěn)定蛋白。Plant-mPLoc預(yù)測除AmTPS7定位于細(xì)胞核中,其余基因均定位于葉綠體;WoLF-PSORT預(yù)測8/30定位于葉綠體,20/30定位于細(xì)胞質(zhì),僅2/30定位于細(xì)胞核中;AmTPS亞細(xì)胞定位復(fù)雜,準(zhǔn)確定位需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.7 金魚草TPSs基因在不同器官的表達(dá)水平

qRT-PCR分析表明,AmTPS基因具有不同的組織特異性,在特定組織部位高表達(dá),在部分組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)。如圖6所示,AmTPS14、AmTPS26在花中未表達(dá),AmTPS23、AmTPS28在葉片中未表達(dá),AmTPS11、AmTPS12、AmTPS20、AmTPS23、AmTPS28、AmTPS30在莖中沒有表達(dá),而在根部中,AmTPS14、AmTPS23、AmTPS26基因均未顯示表達(dá)量。此外,不同的亞家族基因的表達(dá)量也有所不同。在TPS-a亞家族(共15個基因)中,9個基因在葉中的表達(dá)量高于花,6個基因在花中的表達(dá)量高于葉,但兩者間的表達(dá)量無顯著差異。TPS-b亞家族中,除AmTPS18在葉中的表達(dá)量高于其它部位,其它基因在花中的表達(dá)量均最高。TPS-g亞家族(共9個基因)主要合成無環(huán)單萜,其中6個基因在花中的表達(dá)量極高,是葉中表達(dá)量的數(shù)十至數(shù)百倍,在莖、根中的表達(dá)量卻極低。金魚草TPS-e/f亞家族成員AmTPS7基因在花和葉中的表達(dá)量近似,根和莖中的表達(dá)量也相似。整體而言,AmTPS基因家族的表達(dá)量呈現(xiàn)出花中最高,葉中次之,根、莖最低的趨勢。

F.盛開期的花;L.葉;S.莖;R.根;灰色.無表達(dá)。

2.8 金魚草GC-MS花香成分分析

在金魚草盛花期共鑒定出11種化合物(表4),其中TPS-g亞家族基因特異合成的無環(huán)單萜羅勒烯、別羅勒烯、月桂烯和芳樟醇相對含量占比80.51%,而環(huán)狀單萜紫蘇醇僅為0.01%,此外也有少量苯類、酮、酚類等化合物。該結(jié)果與AmTPS家族基因表達(dá)模式吻合,TPS-g亞家族基因合成的無環(huán)單萜為金魚草花香揮發(fā)性萜烯化合物的主要貢獻(xiàn)者,在金魚草生命活動中具有重要生物學(xué)意義,值得后續(xù)進(jìn)一步研究。

表4 金魚草SR品種花香成分

3 討 論

萜烯類化合物是植物第一大類次生代謝產(chǎn)物[15],在植物生命活動中扮演重要角色,TPS基因?qū)χ参镙葡┗衔锖铣芍陵P(guān)重要。TPS基因家族屬于中等基因家族,在不同植物中的數(shù)量一般為20～150個[5]。目前,TPS家族在很多植物中已受到初步關(guān)注,大量TPS基因被鑒定出來,例如擬南芥(32個)[16]、番茄(29個)[19]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale,34個)[20]、葡萄(152個)[24]等。本研究在金魚草中共鑒定出30個TPS基因,分布在4個亞家族(TPS-a,TPS-b,TPS-c,TPS-e/f,TPS-g)中,其中TPS-a亞家族是倍半萜產(chǎn)生的主要合成酶,基因數(shù)量占整個金魚草AmTPS家族的一半,推測金魚草倍半萜種類較多;此外,基因組分析表明,TPS-a亞家族出現(xiàn)的2次串聯(lián)重復(fù)使該亞家族的基因數(shù)量得到拓展。TPS-g(9個)亞家族因缺乏保守結(jié)構(gòu)域R(R)x8W而合成無環(huán)單萜[25],在AmTPS家族中占比近1/3,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多數(shù)其它已報(bào)道的植物[23, 26-27],推測無環(huán)單萜類化合物種類在金魚草中占比較高。

啟動子是否具有光響應(yīng)元件對萜烯類化合物的合成規(guī)律有一定影響,在一定程度內(nèi),萜烯類化合物的產(chǎn)生與光照強(qiáng)度和光照時間成正比[21]。金魚草AmTPS啟動子含有大量光響應(yīng)元件,推測金魚草萜烯類化合物的合成、積累與釋放受到光的調(diào)控。TPS基因在很多植物中都具有組織特異性,尤其在花中表現(xiàn)明顯。PbTPS-b和PbTPS-e/f亞家族在熒光蝴蝶蘭(Phalaenopsisbellina)花瓣中表達(dá)量最高,合成大量單萜[28];春蘭(Cymbidiumgoeringii)中,CgTPS-a基因在花瓣中優(yōu)勢表達(dá),合成大量倍半萜[29];番茄(Solanumlycopersicum)中,揮發(fā)性單萜在花瓣和成熟葉片中釋放量明顯高于其他組織,且SlTPS-g相關(guān)基因在這兩個組織中也高表達(dá)[30]。本研究中金魚草AmTPS-g基因在花中優(yōu)勢表達(dá),合成并釋放大量無環(huán)單萜,表明上述TPS亞家族的表達(dá)受到嚴(yán)格的空間調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究共鑒定出30個AmTPS基因,序列長度差異較大,亞細(xì)胞定位比較復(fù)雜。順式作用元件分別為植物生長與發(fā)育,抗逆、脅迫響應(yīng)和植物激素響應(yīng)三類,其中生長發(fā)育中相關(guān)元件最豐富。30個AmTPS聚類在TPS-a、TPS-b、TPS-g和TPS-e/f亞族中,定位在5條染色體上。熒光定量結(jié)果顯示,AmTPS主要在花器官中高表達(dá),其中TPS-g亞家族差異表達(dá)量最高。而GC-MS結(jié)果顯示,金魚草花香成分中無環(huán)單萜為主要揮發(fā)物,推測TPS-g亞家族是金魚草無環(huán)單萜類揮發(fā)物合成的關(guān)鍵基因。以上結(jié)果為進(jìn)一步解析AmTPS基因功能提供一定方向。