疾病模型近交系小鼠的繁殖保種方法及措施

張伶燕

（ 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所 北京協(xié)和醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)中心國家人類疾病動物模型資源庫 北京市人類重大疾病實驗動物模型，北京 100021 ）

小鼠是試驗中應(yīng)用最廣泛的動物，易繁殖和飼養(yǎng)，可應(yīng)用于各類生理、病理、藥理以及一些行為學(xué)試驗[1-4]，其中帶有疾病模型的小鼠在疾病相關(guān)研究中尤為重要。隨著醫(yī)學(xué)研究不斷深入、發(fā)展，學(xué)界對小鼠的繁殖質(zhì)量要求愈發(fā)重視，一些遺傳背景較復(fù)雜且應(yīng)用價值較高的品系的繁殖保種技術(shù)也越來越重要，保證小鼠質(zhì)量控制合格以及基因穩(wěn)定在小鼠應(yīng)用中起到至關(guān)重要的作用。在飼養(yǎng)繁殖過程中，近交系小鼠由于其遺傳均一性以及對各種反應(yīng)的一致性、可再觀性、敏感性等均較好的特點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的各項研究中[5-6]。但近交系因長期近交導(dǎo)致的近交衰退問題尚無很好的解決辦法，尤其一些疾病模型的品系由于其自發(fā)疾病或其他因素影響，極有可能出現(xiàn)斷種不繁殖的問題。因此，能夠持續(xù)性傳代成為繁殖保種過程中亟須解決的重要問題。文章主要針對疾病模型的近交系小鼠品系繁殖保種方法和采取措施進(jìn)行概述，以期為疾病模型近交系小鼠品系的穩(wěn)定遺傳和可持續(xù)繁殖以及動物醫(yī)學(xué)臨床研究提供參考。

1 飼養(yǎng)條件

試驗動物的繁殖性能與動物種系、環(huán)境條件、營養(yǎng)水平等諸多因素有關(guān)[7]，試驗動物房作為繁育、飼養(yǎng)、開展試驗的地點(diǎn)，此處的控制不僅關(guān)系到試驗動物的福利及健康，更是保障試驗數(shù)據(jù)可靠性和可重復(fù)性的關(guān)鍵，對生命科學(xué)研究的結(jié)果和水平具有深遠(yuǎn)影響[8-11]。環(huán)境控制是試驗動物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵因素之一[12]，也是試驗動物飼養(yǎng)控制中最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)，是保證試驗動物質(zhì)量的前提條件。

1.1 飼養(yǎng)環(huán)境

試驗小鼠飼養(yǎng)于隔離器內(nèi)，獨(dú)立送排風(fēng)系統(tǒng)過濾空氣后[6]進(jìn)入隔離器內(nèi)（空氣為初、中、高效三級過濾）。溫度20～26 ℃，若溫度超過30 ℃會造成雄鼠睪丸萎縮，精子生成能力下降，雌鼠性周期紊亂，泌乳能力下降或拒乳[13]；濕度40%～70%；光照：定時設(shè)定小鼠光照時間，每天光照12 h、黑暗12 h。

籠具和墊料：墊料選擇刨花木屑經(jīng)132 ℃、35 min 真空蒸汽高壓滅菌。每周更換飼養(yǎng)籠具和墊料，洗刷后均經(jīng)高溫高壓滅菌[14]。

豐容玩具：選擇可進(jìn)行高壓滅菌的隧道玩具，每2個月重新清洗并進(jìn)行高壓滅菌后使用。

1.2 飼料與飲水

本試驗選擇中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所常用飼料A 和免疫缺陷飼料B（高蛋白、高脂肪），依據(jù)GB 14924.3—2010[15]方法測定其營養(yǎng)水平，結(jié)果見表1。兩種飼料分別來自北京兩家試驗小鼠飼料生產(chǎn)廠，許可證號分別為SCXK（京）2019-0003 和SCXK（京）2019-0010。試驗鼠飲用水為酸化水pH 值2.5～3.0，121 ℃、35 min 真空蒸汽高壓滅菌，配置方法為1 mL 36%～38%鹽酸配15 L水。

表1 試驗小鼠飼料營養(yǎng)水平Tab.1 Feed nutrient levels of experimental mice 單位：g/kg

2 飼養(yǎng)方法

2.1 飼養(yǎng)管理

每周一至周三換窩，換窩完成后擦拭隔離器內(nèi)表面附著粉塵以及手套附著的臟墊料等，將隔離器內(nèi)物品碼放整齊。每天觀察小鼠繁殖情況，在繁殖卡片上記錄小鼠配種、新生、離乳、死亡、淘汰等數(shù)據(jù)，卡片記錄信息包括品系名稱、飼養(yǎng)編號、交配動物編號、出生日期、配種日期、代數(shù)、胎數(shù)以及父母編號等。新生仔鼠記錄胎數(shù)、出生日期、產(chǎn)仔數(shù)、離乳雌雄數(shù)、仔鼠編號以及離乳后飼養(yǎng)籠號。此外，還應(yīng)觀察每盒小鼠狀態(tài)，包括背毛是否順滑、有無腫瘤、創(chuàng)傷、爛尾、精神狀態(tài)、活動度等，出現(xiàn)異常狀態(tài)的小鼠及時淘汰處理。

2.2 近交系小鼠繁殖

小鼠8 周齡時達(dá)到性成熟[16]進(jìn)行配種，嚴(yán)格遵循同胞交配，繁殖鼠采用雌雄長期同居方法（公母比例為1∶1）[17]，繁育困難品系同窩很難形成一對繁殖對可選擇近親。選擇健壯、毛色順滑，無創(chuàng)傷、無遺傳缺陷的小鼠，無折尾、斷尾等情況留兩條繁殖線進(jìn)行同時傳代，留種選取2～4 胎。同時考慮在對其繁殖力無影響或影響較小的情況下，盡可能選擇胎次多的仔鼠育種[18]。每條繁殖線5 對繁殖對以上，留雌雄比例好的后備種，如可形成2∶2、3∶3、4∶4的繁殖對。若出現(xiàn)一條繁殖線無法傳代的情況，可從另一條繁殖線進(jìn)行再次分化成兩條繁殖線傳代。

2.3 近交系小鼠保種

采用修飾平行線法，分為上下兩條平行繁殖線。引種品系為1對種鼠，動物繁殖過程中原始引種第一交配對繁殖后，選留2 或4 對種鼠，上下兩條線各1 或2 對種鼠分別選種傳代。若引種品系為2對及以上種鼠繁殖過程中，原始引種隨機(jī)分成2條線分別繁殖。根據(jù)生殖能力系數(shù)=(總離乳數(shù)×7)/生產(chǎn)總天數(shù)，統(tǒng)計每條線綜合平均生殖能力系數(shù)，生產(chǎn)總數(shù)從同居配種當(dāng)日開始計算，根據(jù)Festing 設(shè)計的6代傳代法，繁殖代數(shù)以6代計，即每代上溯6代，從上溯6 代的分支中選擇一個分支向下傳遞，選擇計算平均生殖能力系數(shù)并根據(jù)其值判斷[19]，見圖1。

圖1 近交系小鼠繁殖譜系Fig.1 Breeding pedigree of inbred mice

支線1 平均生殖能力系數(shù)=（0.90+0.60+1.10+…+0.76）/11=0.66；支線2 平均生殖能力系數(shù)=0.30+0.47+0.89+…+0.80=0.42。

通過計算可知，支線1 的平均生殖能力系數(shù)高于支線2，故選擇支線1進(jìn)行傳代。若突然出現(xiàn)過高的繁殖能力且比較持續(xù)，應(yīng)懷疑品系是否出現(xiàn)污染情況，及時檢測遺傳位點(diǎn)是否一致。

2.4 小鼠淘汰（針對繁育好且穩(wěn)定的品系）

2.4.1 老種淘汰

8 月齡以上小鼠一般生6 胎左右可進(jìn)行淘汰，替換為年輕繁殖力旺盛的小鼠，以保證鼠群的健康以及保持較高生產(chǎn)率。每條線至少有2代小鼠（即父代、子代），有足夠空間可留3代再進(jìn)行更新?lián)Q代淘老種。

2.4.2 不繁育種子對淘汰

配種后1～2月未發(fā)生妊娠或無仔鼠出生，可進(jìn)行同胞間調(diào)種，若調(diào)種后1～2月仍未出現(xiàn)妊娠或生仔，表明小鼠不孕不育，需進(jìn)行淘汰。

2.4.3 根據(jù)動物福利選擇性淘汰

當(dāng)動物出現(xiàn)體重下降、消瘦；無法控制的疼痛；腫瘤過度增長或腹水；持續(xù)性倦怠伴隨背毛粗糙雜亂，無光澤、弓背；異常中樞神經(jīng)反應(yīng)（抽搐、顫抖、歪頭、癱瘓）；影響進(jìn)食和飲水等癥狀時，根據(jù)小鼠疼痛評估標(biāo)準(zhǔn)打分，判斷是否淘汰，評分累計3分及以上直接淘汰。小鼠疼痛評估標(biāo)準(zhǔn)見表2[20]。

表2 小鼠疼痛評估標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Pain evaluation criteria of mice

3 針對繁育中出現(xiàn)問題的調(diào)整措施

由于疾病模型的近交系小鼠在繁育過程中會出現(xiàn)多種情況導(dǎo)致繁育困難，因此，根據(jù)每個品系繁殖問題進(jìn)行針對性的調(diào)整和總結(jié)，主要分為以下幾種情況。

3.1 雌鼠多發(fā)疾病導(dǎo)致繁殖障礙或死亡

保留6～10對繁殖對，后備種4～6對左右即可。但對于雌鼠多發(fā)疾病的品系小鼠需要保證繁殖對12對以上，后備種至少10對，保種空間足夠的情況下留3～5只雌鼠用于繁殖障礙或死亡后進(jìn)行替換。

3.2 母鼠食仔、拒絕哺乳品系

針對母鼠食仔、拒絕哺乳品系可補(bǔ)充葵花籽、繁殖果凍。孕鼠受驚也會導(dǎo)致食仔和拒絕哺乳的現(xiàn)象[21]（見圖2），生產(chǎn)前后2～3 d 避免人為干擾。若發(fā)現(xiàn)有食仔或啃食仔鼠現(xiàn)象，應(yīng)及時取出死亡仔鼠，以免血腥味刺激母鼠進(jìn)一步吃仔。放入豐容玩具以增加母鼠安全感，在飼養(yǎng)過程中可發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)后母鼠多將幼仔放在玩具中，可增加其安全感，提升小鼠離乳率，減少食仔現(xiàn)象。

圖2 因母鼠拒絕哺乳導(dǎo)致新生小鼠死亡Fig.2 Newborn mice died when their mothers refused to breastfeed

3.3 攻擊性強(qiáng)小鼠

由于小鼠品系野性較強(qiáng)、好斗，配種后甚至出現(xiàn)小鼠打斗撕咬致死的情況。打斗情況不能緩解時，挑出最強(qiáng)者采取單籠飼養(yǎng)。但單籠飼養(yǎng)不符合3R 原則，可放置坐窩紙或豐容玩具[22]。此外，針對打斗嚴(yán)重的品系采取離乳后雌雄即開始共同飼養(yǎng)至配種。據(jù)觀察，個別品系由于攻擊性過強(qiáng)，至配種年齡再進(jìn)行合籠時極易出現(xiàn)追逐打斗情況，采用離乳后雌雄仔鼠同窩的方法可有效減少配種后打斗現(xiàn)象，提升雌鼠受孕率。每天觀察小鼠情況，一旦發(fā)現(xiàn)鼠籠中有撕咬打斗現(xiàn)象，除了單獨(dú)隔離最強(qiáng)者外，輕微受傷個體每天用碘伏消毒，一般5～7 d可痊愈；若撕咬傷口嚴(yán)重?zé)o法痊愈，應(yīng)予以剔除。此外，應(yīng)避免頻繁更換試驗人員，以降低不確定因素對小鼠的刺激[23]。

3.4 妊娠母鼠

妊娠母鼠腹部明顯膨大或見陰道口濕潤張開，表明即將生產(chǎn)（見圖3），此時進(jìn)行適當(dāng)遮光處理，減少打擾。若有必要可提前將母鼠單獨(dú)飼養(yǎng)并放置豐容玩具，并適量補(bǔ)充雞蛋等營養(yǎng)物質(zhì)。

圖3 妊娠母鼠及豐容玩具Fig.3 Pregnant female rats and toys

3.5 新生仔鼠

仔鼠出生第1 d 勤觀察仔鼠狀態(tài)，觀察胃部是否出現(xiàn)奶斑，見圖4。有奶斑即為帶仔，并減少打擾；仔鼠無奶斑且身上附著墊料、黏污，四處散落分布，沒有活力，表明母鼠不帶仔，此時應(yīng)及時采取代乳。

圖4 新生仔鼠狀態(tài)觀察Fig.4 Observation of neonatal rat status

3.6 配種后不繁殖的小鼠

在設(shè)繁育對的同時檢查雄鼠的生殖能力。選擇1只其他品系的雌鼠作為測試鼠（不同毛色，如C57、ICR等品系）放入繁育對的籠具內(nèi)，若3周后2只雌鼠均未受孕，則認(rèn)為該雄鼠不育，需更換雄鼠。若本品系雄鼠數(shù)量不足，可將雌鼠與其父本交配。若繁育對的雄鼠可育，配種后3周未見雌鼠妊娠，對雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵。首先將雌鼠取出單獨(dú)飼養(yǎng)1 周，觀察是否出現(xiàn)妊娠，若未發(fā)生妊娠則腹腔注射5 U 孕馬血清促性腺激素，46～48 h 后注射5 U 人絨毛膜促性腺激素，之后與雄鼠合籠。若超數(shù)排卵的雌鼠合籠3周后仍未妊娠，則認(rèn)為該雌鼠不育，需更換雌鼠。

3.7 對營養(yǎng)具有特殊需求的小鼠

3.7.1 肥胖小鼠

有研究表明，高脂肪日糧對血糖的影響呈劑量相關(guān)，并可能增加體內(nèi)對胰島素的需求[24]。胰島素不受控制的產(chǎn)生可能促進(jìn)脂肪合成，因此控制小鼠脂肪及糖分?jǐn)z入是控制小鼠體重的關(guān)鍵。糖尿病導(dǎo)致的肥胖小鼠體長、體重明顯大于一般小鼠，且多繁殖1～2胎便不再繁殖。針對肥胖小鼠，應(yīng)將其調(diào)整到6周齡配種；日常飼喂維持飼料保證其基本生長維持所需即可，維持飼料增加了纖維含量并降低了能量，減少肥胖小鼠能量攝入以控制體重；還可飼喂二甲雙胍緩釋片300～400 mg/L溶于飲水，控制其因2型糖尿病導(dǎo)致的過度肥胖，還可明顯提升經(jīng)產(chǎn)母鼠的胎次，從而提升整體小鼠品系的繁殖性能。

3.7.2 高蛋白、脂肪需求小鼠

在飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，一些小鼠飼喂免疫缺陷飼料（高蛋白、高脂肪）后產(chǎn)仔數(shù)明顯增加，且毛發(fā)更順滑。針對這些小鼠可飼喂前文中的飼料B（高蛋白、高脂肪），增加小鼠產(chǎn)仔數(shù)量從而提升其繁殖性能。

4 討論

與其他近交系小鼠相比，疾病模型近交系小鼠繁殖更為困難，難點(diǎn)主要在于需要克服其因長期近交導(dǎo)致的近交衰退和自身疾病原因?qū)е碌姆敝沉Σ钌踔敛环敝车葐栴}。試驗小鼠均為人工飼養(yǎng)，可通過人為方法控制其繁殖[25]。因此，掌握品系繁殖性能，再根據(jù)品系繁殖需要制定合理的繁育措施，方可更具有針對性地提升小鼠的繁殖能力。

通過本文中提出的措施調(diào)整，可觀察到一些繁殖困難的疾病模型小鼠出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，可以繼續(xù)傳代。試驗動物飼料中蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的含量偏低，易導(dǎo)致試驗動物個體偏小、體重偏輕，影響試驗動物的生理生化指標(biāo)，進(jìn)而對試驗動物造成不利影響[26]。有研究表明，在飼養(yǎng)過程中，飼料是保證試驗小鼠正常生長繁殖的前提，特別是蛋白質(zhì)和脂肪的含量對于小鼠的生長繁殖具有極其重要的影響[27]，合理選擇試驗動物飼料關(guān)系到試驗動物飼養(yǎng)的質(zhì)量以及研究的科學(xué)性[28]。

有些小鼠品系通過調(diào)整飼喂飼料B（高蛋白、高脂肪）可提升小鼠產(chǎn)仔數(shù)量，提升小鼠繁育性能，表明一些品系對蛋白和脂肪需求更高。通過對妊娠母鼠的特殊關(guān)照以及適當(dāng)增加一些豐容玩具以供其躲藏，發(fā)現(xiàn)母鼠的受孕率、仔鼠離乳率和孕鼠帶仔能力均有所提升。肥胖小鼠通過飼喂維持飼料和二甲雙胍緩釋片等措施，可有效控制體重，并通過提升其產(chǎn)仔量和經(jīng)產(chǎn)胎次提升小鼠繁殖性能，使小鼠穩(wěn)定傳代。但也不可過度限制營養(yǎng)，尤其是妊娠期、哺乳期母鼠，否則容易因營養(yǎng)不足而出現(xiàn)食仔現(xiàn)象。

5 結(jié)論

綜上所述，疾病模型近交系小鼠在繁殖保種過程中會遇到很多問題，也需要飼養(yǎng)人員更加細(xì)心的照料和觀察，結(jié)合科學(xué)規(guī)范的管理與飼養(yǎng)實踐中不斷完善的繁殖措施方可更好地維持和挽救小鼠品系，使其穩(wěn)定繁殖。

但隨著時間延續(xù)，常規(guī)活體保種方法的劣勢逐漸顯現(xiàn)，而建立胚胎冷凍保存技術(shù)體系可防止遺傳變異和斷種、斷線，并有效解決近交系小鼠生殖力低下等問題。今后可進(jìn)行疾病模型近交系小鼠活體保種并結(jié)合冷凍胚胎保種的相關(guān)研究與實踐，以期為疾病模型近交系小鼠品系的穩(wěn)定遺傳和可持續(xù)繁殖以及進(jìn)一步開展動物醫(yī)學(xué)臨床研究奠定基礎(chǔ)。