表達表皮生長因子釀酒酵母對長江水系中華絨螯蟹生長性能?免疫功能和腸道發(fā)育的影響

徐文俊　李鳳華　周煒　夏兵兵　趙俊

摘要［目的］研究表達表皮生長因子釀酒酵母對長江絨螯蟹生長性能、免疫功能以及腸道發(fā)育的影響。［方法］試驗分為2組，對照組飼喂基礎日糧，試驗組在1 kg基礎日糧基礎上添加5 mL表達表皮生長因子釀酒酵母發(fā)酵液，螃蟹按照15 000 只/hm2進行投放，試驗周期為9個月。［結果］與對照組相比，添加釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹存活率（P＜0.05），存活率提高了6.1%；但添加釀酒酵母對螃蟹血液中溶菌酶含量和組織中SOD和MDA含量沒有顯著性影響；而添加釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹后腸腸道上皮細胞高度（P＜0.05）。［結論］在長江絨螯蟹飼料中添加表達EGF釀酒酵母能夠提高機體非特異性免疫力，促進腸道生長發(fā)育，提高螃蟹平均體重和存活率。

關鍵詞 釀酒酵母；表皮生長因子；中華絨螯蟹；生長性能；免疫功能；腸道發(fā)育

中圖分類號 S963 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）06-0078-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.020

Effects of Saccharomyces cerevisiae Expressing Epidermal Growth Factor on Growth Performance，Immune Function and Intestinal Development of Mitten Crab from the Yangtze River System

XU Wen－jun1，LI Feng－h(huán)ua2，3，ZHOU Wei1 et al

（1.Wuhu Interferon Biological Products Industrial Research Institute Co.，Ltd.，Wuhu，Anhui 241000;2.Shandong Xundakang Veterinary Medicine Co.，Ltd.，Jinan，Shandong 250000;3.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract ［Objective］ The purpose of the experiment was to study the effect of Saccharomyces cerevisiae expressing epidermal growth factor on the growth performance，immune function and intestinal development of mitten crab.［Method］ The mitten crab was divided into two groups.The control group was fed the basal diet，and the experimental group was fed the basal diet supplementing with 5 mL Saccharomyces cerevisiae expressing epidermal growth factor.The crabs were released at a rate of 15 000 inds per hectare.The experiment period was 9 months.［Result］The results showed that compared with the control group， the addition of Saccharomyces cerevisiae could significantly improve the survival rate of mitten crab （P<0.05）， the survival rate increased by 6.1%. The addition of Saccharomyces cerevisiae had no significant effect on the contents of lysozyme in blood and SOD and MDA in mitten crab tissues; the addition of Saccharomyces cerevisiaecan could significantly increase the height of intestinal villi in the hindgut of mitten crab （P<0.05）.［Conclusion］Adding Saccharomyces cerevisiae expressing epidermal growth factor to the basal diet could improve the non－specific immunity，promote intestinal growth and development，and improve the average weight and survival rate of mitten crab.

Key words Saccharomyces cerevisiae;Epidermal growth factor;Mitten crab;Growth performance;Immune function;Intestinal development

隨著抗生素在飼料中逐步禁止使用，人們不斷開發(fā)出新的抗生素替代品。在水產養(yǎng)殖中，益生菌是一種最有潛力的抗生素替代品［1］，釀酒酵母作為益生菌的一種，能夠有效增強水產動物的消化吸收率，提高生長性能，同時增強動物的免疫水平，提高動物的存活率［2-3］，酵母菌和酵母細胞壁中富含的β-葡聚糖和甘露寡糖能夠競爭性抑制病原菌在腸道上定植，減少病原數量，維持腸道菌群的平衡［4-5］。

表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）作為一種有絲分裂原，能夠促進細胞的增殖與分化［6］，其在畜禽養(yǎng)殖無抗生產中也得到研究與應用。有研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加EGF能夠提高仔豬日增重，刺激腸道緊密連接蛋白mRNA的表達，抑制炎癥基因mRNA表達，抑制有害菌的繁殖［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼料中添加EGF能夠顯著提高肉雞生長性能、免疫功能，并且促進肉雞的腸道發(fā)育［8］。該試驗旨在研究釀酒酵母表達EGF對長江水系中華絨螯蟹生長性能、腸道發(fā)育以及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗用長江水系中華絨螯蟹蟹苗購自南京高淳，蟹苗按照15 000只/hm2的密度投放至池塘中。

試驗用表達表皮生長因子釀酒酵母由蕪湖英特菲爾生物制品產業(yè)研究院有限公司生產。試驗用飼料為海大螃蟹膨化配合飼料，主要營養(yǎng)成分：粗蛋白≥36.0%，粗纖維≤6.0%，粗灰分≤16.0%，粗脂肪≥4.0%，賴氨酸≥1.8%。

1.2 試驗時間與場地 試驗時間：2021年3—11月；試驗場地：無為縣賢銘特種水產養(yǎng)殖有限公司。

1.3 試驗設計 試驗將螃蟹隨機分為2組，對照組池塘面積0.285 hm2，全程飼喂海大螃蟹配合飼料，試驗組池塘面積0.315 hm2，試驗組在1 kg配合飼料中添加5 mL的表達表皮生長因子釀酒酵母發(fā)酵液，飼料經攪拌均勻后，室內低溫晾干保存，并對試驗組螃蟹進行全程飼喂。

試驗過程中飼養(yǎng)管理按照養(yǎng)殖場養(yǎng)殖規(guī)范進行，整個試驗過程對照組和試驗組的藥物、添加劑等產品試用均保證一致。

1.4 生長指標測定 試驗結束后，統(tǒng)計對照組和試驗組的螃蟹數量、體重，按下方公式計算螃蟹平均體重、單位面積螃蟹數量、螃蟹存活率、單位面積螃蟹產量。

螃蟹平均體重（g/只）=m/n

單位面積螃蟹數量（只/hm2）=n/t

螃蟹存活率（%）=n/（t×15 000）×100

單位面積螃蟹產量（kg/hm2）=m/t

式中，m為試驗結束時所有螃蟹總體重，n為試驗結束時螃蟹數量，t為試驗池塘大小。

1.5 血清溶菌酶測定 試驗結束后，在試驗組和對照組中分別隨機抽取6只大小接近的螃蟹將河蟹螯足第2對關節(jié)處折斷取血淋巴，置于離心管中4 ℃過夜，經冷凍高速離心機4 000 r/min離心后吸出血清，-20 ℃保存?zhèn)溆茫芫富钚圆捎媚暇┙ǔ缮锕こ萄芯克噭┖袦y定。

1.6 組織超氧化物歧化酶和丙二醛含量測定 試驗結束后，分別將2組螃蟹的肝臟、性腺和肌肉組織，按照重量體重比加入生理鹽水制備成10%的組織勻漿，1 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃保存，用于超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的測定。SOD活性用呤氧化酶法測定，MDA含量用過氧化脂質硫代巴比妥酸分光光度計法測定，兩者均采用南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定。

1.7 腸道粘膜的組織學觀察 分別取出2組螃蟹的后腸，4 ℃預冷1×PBS輕輕漂洗，然后投入預先配好的10%福爾馬林固定液中，固定完成后進行脫水透明、浸蠟包埋、制片和HE染色的步驟，利用尼康E-CLIPSE80i型高級研究用正置生物數碼攝影顯微鏡觀察切片，測定腸上皮細胞高度和腸絨毛高度。

1.8 統(tǒng)計分析 試驗數據用Excel 2016進行初步處理，用

SPSS 18.0軟件進行t檢驗，分析差異顯著性，試驗數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 表達EGF釀酒酵母對中華絨螯蟹生產性能的影響

由表1可看出，與對照組相比，在飼料中添加表達EGF釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹存活率（P＜0.05），存活率提高了6.1百分點，而對螃蟹的平均體重提高了3.33 g/只，同時螃蟹產量提高201.00 kg/hm2，預計經濟效益可提高20 100元/hm2（中華絨螯蟹單價約為100元/kg）。

2.2 表達EGF釀酒酵母對中華絨螯蟹血清溶菌酶含量和組織中SOD和MDA含量的影響

試驗結果表明，與對照組相比，在飼料中添加表達EGF釀酒酵母對中華絨螯蟹血清溶菌酶含量影響不顯著，對照組和試驗組含量分別為44.44和66.67 U/mL。由表2可看出，與對照組相比，在飼料中添加表達EGF釀酒酵母對肝臟、性腺、肌肉組織中SOD和MDA的含量影響不顯著（P＞0.05）。

2.3 表達EGF釀酒酵母對中華絨螯蟹腸道生長發(fā)育的影響

由圖1腸道組織形態(tài)學可以看出，與對照組相比，試驗組腸道組織形態(tài)完整，腸壁內外層分層清晰，腸上皮細胞連接緊密，沒有明顯的細胞損傷和脫落；由表3可看出，與對照組相比，在飼料中添加釀酒酵母能夠顯著提高螃蟹后腸上皮細胞高度（P＜0.05），對后腸絨毛高度有提高趨勢。

3 討論

中華絨螯蟹是我國重要的水產經濟動物之一，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和密度的不斷增加，細菌性和病毒性的疾病也越來越多，嚴重影響了其生產和經濟效益［9］。釀酒酵母作為一種益生菌和工程菌，利用其表達表皮生長因子既能發(fā)揮益生菌的功效，又能通過表達表皮生長因子發(fā)揮其有絲分裂原的功能，是一種具有潛力的微生態(tài)飼料添加劑［10］。

釀酒酵母發(fā)酵液中含有豐富的營養(yǎng)物質，包括酵母細胞壁和細胞溶解物質，其能夠提高動物機體免疫力［11］，酵母細胞壁中含有的β-葡聚糖和甘露寡糖能夠與巨噬細胞表面的糖蛋白結合激活巨噬細胞，同時增加免疫球蛋白的數量，提高動物的存活率［12］。溶菌酶是水產動物機體重要的非特異性免疫因子之一［13］，其通過催化水解細菌的細胞壁使得細菌滅亡，同時增強其他免疫因子活性，協(xié)同抵抗外源致病菌的侵襲［14］。也有研究表明，在日糧中添加EGF能夠促進斷奶仔豬機體免疫功能的發(fā)育，提高腸道的免疫屏障功能［15］。該試驗發(fā)現(xiàn)，在中華絨螯蟹飼料中添加表達表皮生長因子釀酒酵母有提高血清溶菌酶含量的趨勢，提高了螃蟹機體的非特異性免疫功能，從而提高螃蟹養(yǎng)殖過程中的存活率。

利用益生菌表達EGF促進腸道發(fā)育已有一定的研究。劉淑杰等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在結腸炎模型小鼠中添加表達EGF的乳酸乳球菌能夠修復腸道損傷，改善腸道屏障；Zhou等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞日糧中添加表達EGF乳酸乳球菌能夠提高肉雞的生長性能，促進肉雞腸道的發(fā)育；Wang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬日糧中添加表達EGF的釀酒酵母能夠促進仔豬腸道絨毛高度、絨毛隱窩比以及腸道的發(fā)育。該試驗發(fā)現(xiàn)，在螃蟹飼料中添加表達表皮生長因子釀酒酵母能夠促進螃蟹腸道發(fā)育，提高腸絨毛高度和腸上皮細胞的高度。這可能跟釀酒酵母與EGF的生物活性有關，酵母菌進入動物機體胃腸后能夠產生多胺類的物質，多胺類物質能夠直接參與細胞的增殖分化，以及核酸蛋白質的合成［18］。同時釀酒酵母表達的EGF能夠與腸上皮細胞和微絨毛中豐富的EGFR受體結合，通過激活MAPK和PI3K型號通路促進細胞的增殖與分化，同時刺激杯狀細胞分泌Muc2黏蛋白，減少有害菌的定位和遷移，維持腸道固有屏障功能［19-20］，從而促進腸道的生長發(fā)育。飼喂活的酵母菌能夠提高水產動物消化酶的活性，如淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶，促進水產動物的消化吸收能力提升［21］。外源性添加EGF也能夠顯著提高動物胃腸道消化酶的活性，如α-淀粉酶、堿性蛋白酶、脂肪酶、堿性磷酸酶、肌酸激酶及乳酸脫氫酶等［10，22-23］。該試驗結果表明，添加表達EGF釀酒酵母能夠提高螃蟹的平均體重和產量，這可能與螃蟹中胃腸道消化酶的活性提高與腸道上皮細胞生長發(fā)育相關。

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基金項目 安徽省自然科學基金（1808085MC75）；蕪湖市重點研發(fā)計劃（2019YF44）；蕪湖市發(fā)明專利技術成果產業(yè)化計劃（202021）。

作者簡介 徐文俊（1991—），男，安徽蕪湖人，碩士，從事飼料添加劑的研發(fā)。*通信作者，講師，博士，從事生物制品的研究與開發(fā)。

收稿日期 2022-04-11；修回日期 2022-05-09