一種基于兒茶素的多酚氧化酶交聯(lián)聚集體制備及其高效催化合成茶黃素-3,3′-雙沒(méi)食子酸酯研究

周晶輝，劉昌偉，張盛，許崗，胥偉，黃建安，劉仲華*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；5. 醫(yī)藥工業(yè)用酶技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心湖南福來(lái)格生物技術(shù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410100；6. 精制川茶四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000

茶黃素（Theaflavin，TFs）是紅茶中重要的色素，對(duì)紅茶風(fēng)味品質(zhì)形成貢獻(xiàn)巨大[1]。在紅茶發(fā)酵過(guò)程中，不同類(lèi)型的兒茶素（兒茶酚型和鄰苯三酚型）被多酚氧化酶（PPO：兒茶酚氧化酶；酪氨酸酶；漆酶）氧化形成鄰醌，鄰醌不穩(wěn)定，會(huì)自縮合和脫碳形成不同的 TFs（圖1）[2]。紅茶中主要的 TFs 是茶黃素（Theaflavin，TF1）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin 3-O-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3′-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3′-O-gallate，TF-3′-G）和茶黃素-3,3′-沒(méi)食子酸酯（Theaflavine-3,3'-digallate，TFDG）。

圖1 茶黃素的形成過(guò)程Fig. 1 Theaflavin formation process

大量研究表明，TFs 特別是TFDG，對(duì)人體許多方面具有健康功效。其中包括保護(hù)心肌細(xì)胞[3]，抑制癌細(xì)胞增殖[4-5]，發(fā)揮抗炎作用[6]，抗氧化作用[7]，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥等[8]。由于TFs存在的藥用特性和健康益處，開(kāi)發(fā)TFs 及其衍生物具有非常廣闊的商業(yè)前景。由于TFs 僅占紅茶干重的2%～6%[9]，直接從紅茶中提取成本高昂，而采用當(dāng)代生物技術(shù)，開(kāi)發(fā)固定化的多酚氧化酶重復(fù)多批次的酶促合成TFDG 是一種高效、經(jīng)濟(jì)且最具工業(yè)化應(yīng)用前景的方法[10]。

交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）是荷蘭 Roger Shelldon 教授在2000 年提出的一種新型無(wú)載體固定化技術(shù)[11]。CLEAs 的制備分為以下幾步：首先，通過(guò)微生物發(fā)酵或組織提取獲得液態(tài)粗酶蛋白；其次，將沉淀劑（如硫酸銨、有機(jī)溶劑、非離子聚合物和其他沉淀劑）添加到含有酶的水溶液中，使酶蛋白通過(guò)非共價(jià)鍵形成超分子結(jié)構(gòu)-不可溶的物理聚集體，從而產(chǎn)生粗酶聚合[12]；第三步，以戊二醛為交聯(lián)劑，將酶物理聚合體共價(jià)連接，形成CLEAs（圖2A），酶聚集體通過(guò)游離氨基與戊二醛的兩個(gè)醛基之間的共價(jià)鍵不可逆結(jié)合。

圖2 傳統(tǒng)交聯(lián)方法和酶交聯(lián)方法示意圖Fig. 2 Schematic diagram of traditional and enzymatic cross-linking methods

諸多研究表明，CLEAs 與游離酶相比具有更好的性能，如更高的催化活性，更好的熱穩(wěn)定性和可回收性等[13]。使用這種方法，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種CLEAs 的固定化酶，如用漆酶和酪氨酸酶結(jié)合形成CLEAs，能將廢水中的對(duì)乙酰氨基酚轉(zhuǎn)化為酚類(lèi)化合物[14]；脂肪酶B的CLEAs 可以高效合成奧伐尼[15]；黑曲霉脂肪酶CLEAs 的制備，可增強(qiáng)其在有機(jī)溶劑和水溶劑中的活性[16]；酪氨酸酶CLEAs 在有機(jī)溶劑和離子液體中的活性和穩(wěn)定性都有明顯的提升[17]；此外，蘑菇酪氨酸酶CLEAs 被用作催化劑，可以以L-酪氨酸為底物制備L-3,4-二羥基苯丙氨酸（L-Dopa）[18]。上述傳統(tǒng)的CLEAs 制備方法都需要用到交聯(lián)試劑戊二醛，該化學(xué)試劑有毒且對(duì)環(huán)境不友好。兒茶素是茶葉中的一類(lèi)天然產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)形成非共價(jià)和共價(jià)相互作用[14,19]（圖2B）。非共價(jià)相互作用包括氫鍵、疏水相互作用、范德華力和離子相互作用[20]。這些相互作用通常是可逆的，并且比共價(jià)相互作用弱[21]。共價(jià)鍵是指多酚在堿性條件下（pH＞9.0）或有氧存在的酶催化下容易氧化形成醌或半醌自由基。這些醌或半醌中間體很容易與蛋白質(zhì)的親核基團(tuán)（如賴(lài)氨酸、半胱氨酸和色氨酸）發(fā)生反應(yīng)[22]，并能在蛋白質(zhì)和多酚氧化產(chǎn)物之間形成共價(jià)交聯(lián)（C-N 或C-S）絡(luò)合物聚集體[19]。茶多酚與蛋白質(zhì)之間形成的共價(jià)鍵是通過(guò)席夫堿和邁克爾加成反應(yīng)進(jìn)行。因此，我們認(rèn)為兒茶素可以作為天然交聯(lián)劑用于CLEAs 的制備。

本研究采用兒茶素作為蛋白交聯(lián)試劑，對(duì)CLEAs 制備的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)CLEAs和游離酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究，以及對(duì)TFDG 的催化驗(yàn)證，以期為茶黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供低成本和更高效的制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有巨大芽孢桿菌來(lái)源的酪氨酸酶突變體[基因登錄號(hào)：MN509467.1，載體pET30a-Bmtyrc/BL21（DE3）]工程菌株為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存[23]。本試驗(yàn)中所用試劑均（分析純）采購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)有限公司。蛋白分離純化用試劑盒購(gòu)買(mǎi)于QIAGEN 公司。兒茶素單體為湖南三福生物技術(shù)有限公司饋贈(zèng)，純度98%以上的TFDG 標(biāo)準(zhǔn)品采購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司（上海）。

1.2 液態(tài)酶的制備與活性分析

從-80 ℃冰箱中取出酪氨酸酶突變體重組菌株劃線活化，按照文獻(xiàn)[23]中所述方法進(jìn)行菌株的發(fā)酵、目的蛋白的表達(dá)與分離純化、蛋白濃度及其活性測(cè)定。其中酪氨酸酶的活性檢測(cè)參考文獻(xiàn)[24]方法并做了適當(dāng)?shù)男薷?，具體的反應(yīng)體系如下：反應(yīng)底物用 0.1 mol·L-1pH 7.0 的磷酸緩沖液充分溶解1 mmol·L-1的L-Dopa（添加0.1 mmol·L-1Cu2+），在1.5 mL的EP 管中分別加入450 μL 的底物溶液和50 μL的酶溶液，輕微混勻后，于30 ℃反應(yīng)5 min，然后加入 50 μL 20%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，12 000 r·min-1離心5 min，取適量上清液于475 nm 處進(jìn)行OD 值檢測(cè)，以未加酶液的樣品作為空白對(duì)照。在上述條件下，以每分鐘吸光值變化為0.01 的數(shù)值定義為1 個(gè)單位。TFDG 的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[23]中方法執(zhí)行。

1.3 酪氨酸酶交聯(lián)聚集體（CLEAs）的制備與參數(shù)優(yōu)化

選擇不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.5、1、2、4、6、8、10 mg·mL-1）的兒茶素（EC、ECG、EGC、EGCG）作為交聯(lián)劑進(jìn)行CLEAs 的制備，酪氨酸酶的交聯(lián)反應(yīng)在1.5 mL 的EP 管中進(jìn)行，依次加入不同濃度的兒茶素溶液450 μL（pH 7.0 0.1 mol·L-1磷酸鹽配制），酪氨酸酶溶液50 μL（蛋白質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1，酶活力單位為100 U），迅速置于30 ℃條件下的搖床中，以轉(zhuǎn)速為120 r·min-1進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)60 min 后，12 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀，即得酪氨酸酶與多酚氧化產(chǎn)物交聯(lián)聚集體，用適量緩沖液洗滌2～3 次，以終質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的L-Dopa 溶液為底物測(cè)定活力并進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。選擇不同pH、溫度、交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行CLEAs 制備參數(shù)優(yōu)化，與傳統(tǒng)的蛋白沉淀試劑如硫酸銨，聚乙二醇進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算酶活回收率。

1.4 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

用0.1 mol·L-1pH 4.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制不同質(zhì)量濃度的兒茶素底物溶液（ECG 為0～8 mg·mL-1，EGCG 為0～16 mg·mL-1），添加相同酶活的CLEAs 和游離酪氨酸酶，于30 ℃反應(yīng)5 min，測(cè)定相關(guān)數(shù)據(jù)，所有試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行樣，利用Lineweaver-Burk 的方法作圖，計(jì)算出酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

1.5 CLEAs 的結(jié)構(gòu)與催化性能

為了研究CLEAs 的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇EGCG 為對(duì)照樣品，以及在此基礎(chǔ)上制備的CLEAs 樣品為研究對(duì)象，將二者干燥后制備成粉末，在粉末上添加一層導(dǎo)電涂層，厚度約為2～3 nm，利用掃描電鏡（ZEISS Sigma 300德國(guó)）對(duì)CLEAs 進(jìn)行形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的觀察和分析，以未加酶的交聯(lián)劑EGCG 作為對(duì)照；進(jìn)一步對(duì)CLEAs 進(jìn)行傅立葉變換紅外吸收光譜FTIR 分析，考察交聯(lián)前后官能團(tuán)的差異，利用紅外吸收光譜儀（Thermo Scientific Nicolet iS20 FT-IR）進(jìn)行了光譜掃描分析（波長(zhǎng)范圍：500～4 000 cm-1），以未加酶的交聯(lián)劑作為對(duì)照樣品。對(duì)CLEAs 和游離酶的催化特性進(jìn)行研究，以L-Dopa 為底物，測(cè)定在不同條件下（乙醇耐受性、pH、熱穩(wěn)定性、底物耐受性）二者的催化性能。

1.6 CLEAs 與游離酶催化合成茶黃素TFDG

分別利用CLEAs 和游離酶進(jìn)行催化合成茶黃素，底物EGCG 和ECG用15 mL 0.1 mol·L-1pH 4.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液溶解，EGCG 和ECG 用量比為2∶1（4 mmol·L-1∶2 mmol·L-1），反應(yīng)溫度30 ℃、pH 4.0、時(shí)間30 min，酪氨酸酶的活力為100 U。待反應(yīng)結(jié)束后，離心取上清液進(jìn)行TFDG 濃度測(cè)定，過(guò)濾后的固體重新加入底物溶液進(jìn)行下一批次反應(yīng)。反應(yīng)以游離液態(tài)酶作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶交聯(lián)聚集體的最適條件

選擇不同兒茶素作為交聯(lián)試劑對(duì)酶的交聯(lián)情況進(jìn)行測(cè)試，以酶交聯(lián)產(chǎn)率作為參考指標(biāo)，從圖3 中可以看出，與傳統(tǒng)的固定化方法相比，利用EGCG 作為交聯(lián)反應(yīng)的底物時(shí)，能獲得最大的酶活回收率（84.65%），其次為EC（84.55%），而采用傳統(tǒng)的硫酸銨沉淀和聚乙二醇（PEG）的方法，其酶活回收率分別為65.00%和74.41%（表1）。由此說(shuō)明，選擇以?xún)翰杷貫榈孜镞M(jìn)行酪氨酸酶的交聯(lián)比傳統(tǒng)沉淀（交聯(lián)）試劑方法具有優(yōu)越性，一方面省略了蛋白沉淀的步驟，另一方面兒茶素交聯(lián)的酶活回收率高。

表1 不同沉淀劑的酶活回收率對(duì)比Table 1 Comparison of enzyme activity recovery with different precipitators

圖3 不同兒茶素對(duì)酶交聯(lián)產(chǎn)率的影響Fig. 3 Effects of different catechins on enzyme cross-linking yield

通過(guò)對(duì)酪氨酸酶交聯(lián)的時(shí)間、pH、溫度條件的優(yōu)化，結(jié)果表明（圖4），交聯(lián)反應(yīng)最佳條件為40 ℃，pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間50 min。

SDS-PAGE 電泳檢測(cè)結(jié)果表明（圖5），酪氨酸酶交聯(lián)前單體分子量為 35 kDa 左右（圖5A 和圖5B 泳道1），隨著交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，酪氨酸酶的分子量逐漸變大，且呈現(xiàn)不同大小的分子量表現(xiàn)出彌散的條帶，說(shuō)明經(jīng)過(guò)交聯(lián)，酪氨酸酶形成了大小不一的復(fù)合物（圖5A 泳道2～7，圖5B 泳道2～3），且交聯(lián)后的蛋白大多數(shù)以不可溶的沉淀形式存在（圖5A泳道3）。

圖4 酪氨酸交聯(lián)酶聚集體制備參數(shù)條件優(yōu)化Fig. 4 Optimization of preparation parameters of tyrosine cross-linked enzyme aggregates

圖5 酶交聯(lián)產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳分析Fig. 5 Analysis of enzyme crosslinking products by SDS-PAGE electrophoresis

2.2 催化性能分析

通過(guò)對(duì)游離酶和CLEAs 的催化性能進(jìn)行對(duì)比分析，從圖6A 中可看出，在偏酸性pH條件（pH＜6.0），交聯(lián)酶的催化活性相對(duì)游離酶而言，略有提升，更有利于茶黃素TFDG 的形成；溫度耐受性分析結(jié)果表明（圖6B），交聯(lián)酶和游離酶在溫度55 ℃以下表現(xiàn)穩(wěn)定，當(dāng)溫度＞60 ℃時(shí)，游離酶的穩(wěn)定性急劇下降，65 ℃活力完全丟失，而交聯(lián)酶此時(shí)仍然保持有95%以上的催化活性，由此說(shuō)明交聯(lián)酶相比游離酶具有較好的熱穩(wěn)定性，更適合于工業(yè)化應(yīng)用；在有機(jī)溶劑耐受性方面（圖6C），可以看出當(dāng)體系中乙醇體積濃度為60%左右時(shí)會(huì)對(duì)酶的催化性能有明顯提升，且交聯(lián)酶的催化性能提升要優(yōu)于游離酶，提升了約180%；在底物耐受性方面（圖6D），可以看出當(dāng)反應(yīng)體系中多酚溶液質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1時(shí)，會(huì)對(duì)游離酶和交聯(lián)酶的催化活性有明顯抑制作用，其對(duì)游離酶的活性抑制最大，殘留活性?xún)H為25%左右，而此時(shí)交聯(lián)酶的殘留活性為60%以上，說(shuō)明了交聯(lián)酶相比游離酶具有較好的底物耐受性。

圖6 游離酶和交聯(lián)酶的催化性能對(duì)比Fig. 6 Comparison of catalytic performance of free and cross-linked enzymes

游離酶和CLEAs 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定分析可以看出（表2），二者對(duì)底物EGCG 的km值相差不大，說(shuō)明二者對(duì)底物EGCG 的親和性接近，而以ECG 為底物，游離酶的km值明顯高于交聯(lián)酶，說(shuō)明交聯(lián)酶對(duì)底物ECG 具有較高的親和性，Vmax/km的分析表明CLEAs 的比值明顯高于游離酶，說(shuō)明其具有較好的催化性能。

2.3 交聯(lián)酶的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)

為了研究交聯(lián)酶的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的差異，以EGCG 和EGCG+酪氨酸酶交聯(lián)產(chǎn)物為研究對(duì)象，對(duì)二者分別進(jìn)行了電鏡掃描（SEM）和傅里葉變換光譜（FTIR）分析。從交聯(lián)前EGCG的電鏡掃描圖可以看出，EGCG 的結(jié)構(gòu)較為平滑（圖7A-C），而EGCG+酪氨酸酶交聯(lián)后產(chǎn)物結(jié)合能與EGCG 緊密結(jié)合形成交聯(lián)復(fù)合物，這可能是CLEAs 相比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性和更高的催化性能的原因。

圖7 EGCG 和EGCG+酪氨酸酶復(fù)合物的掃描電鏡圖Fig. 7 SEM view of EGCG and EGCG + tyrosinase complex

表2 游離酶和交聯(lián)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of free and cross-linked enzymes

為了進(jìn)一步研究底物EGCG 與酪氨酸酶交聯(lián)前后官能團(tuán)的變化，分別對(duì) EGCG 和EGCG+酪氨酸酶復(fù)合物進(jìn)行傅里葉變換光譜分析，從圖8A 可以分析看出，EGCG 在3 500～3 750 cm-1，1 650～1 700 cm-1和1 600～1 650 cm-1處都有明顯的吸收峰，分別代表著-OH 的伸縮振動(dòng)、-C=O 的伸縮振動(dòng)，以及-C=C 的伸縮振動(dòng)；當(dāng)EGCG 與酪氨酸酶形成交聯(lián)復(fù)合物后，吸收峰的強(qiáng)度明顯減少，尤其是-OH 的伸縮振動(dòng)變?nèi)酰f(shuō)明交聯(lián)酶復(fù)合物的形成，導(dǎo)致EGCG 底物上的酚羥基明顯減少，交聯(lián)形成了更復(fù)雜的大分子結(jié)構(gòu)（圖8B）。

圖8 EGCG 和EGCG+酪氨酸酶復(fù)合物（CLEAs）的FTIR 光譜分析Fig. 8 Analysis of EGCG and EGCG + tyrosinase complexes（CLEAs）by FTIR spectroscopy

2.4 交聯(lián)酶催化合成TFDG

通過(guò)對(duì)CLEAs 與游離酶的催化性能對(duì)比分析可知，交聯(lián)酶相比游離酶在熱穩(wěn)定性、底物耐受性、有機(jī)溶劑的耐受性等方面具有較好的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)CLEAs 可以通過(guò)簡(jiǎn)單地離心洗滌即可回收重復(fù)利用，降低工業(yè)化應(yīng)用的成本。對(duì)CLEAs 催化合成TFDG 的能力進(jìn)行評(píng)估，從圖9A 可以看出，CLEAs 催化合成TFDG具有較好的效果，第1 批次反應(yīng)，體系中TFDG的質(zhì)量濃度可達(dá)800 μg·mL-1左右，且連續(xù)3個(gè)批次反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量濃度都＞700 μg·mL-1，說(shuō)明前3 個(gè)批次的穩(wěn)定性非常好，隨著反應(yīng)批次的增加，產(chǎn)物濃度呈逐漸下降的趨勢(shì)，分析原因一方面可能是由于多酚對(duì)酶具有抑制作用，另一方面可能是多酚、產(chǎn)物也容易與TFDG 形成更復(fù)雜的復(fù)合物，導(dǎo)致底物與酶的結(jié)合困難，活性降低。由圖9B 中可知，不同批次反應(yīng)，體系中的顏色由深變淺，與TFDG 的產(chǎn)量具有相對(duì)應(yīng)的關(guān)系。

圖9 酪氨酸酶交聯(lián)聚集體催化合成TFDG 產(chǎn)量Fig. 9 Yield of TFDG synthesis catalyzed by tyrosinase cross-linked aggregates

3 討論

游離酶應(yīng)用于工業(yè)化主要的限制因素在于其只能使用1 批次，成本過(guò)高，通過(guò)技術(shù)改進(jìn)實(shí)現(xiàn)酶的多批次重復(fù)利用是減少酶成本的重要途徑。固定化酶由于具有穩(wěn)定性好、回收率高可重復(fù)使用、催化活性高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生物催化中。在前期研究中，我們選擇了丙烯酸樹(shù)脂Eupergit C 作為酪氨酸酶的固定化載體進(jìn)行了固定化研究，結(jié)果表明，用該樹(shù)脂可以成功將酪氨酸酶進(jìn)行固定化，并進(jìn)行了TFDG 的合成，但是該固定化酶使用1批次就丟失了大部分的活性，分析原因在于一方面產(chǎn)物茶黃素能與固定化酶顆粒形成緊密結(jié)合，形成了有顏色的復(fù)合物，阻塞了固定化酶的孔徑，影響了底物的進(jìn)入導(dǎo)致了酶活性的丟失；另一方面固定化酪氨酶的活性可能會(huì)受到底物多酚的抑制作用，導(dǎo)致活性丟失。因此，該固定化方式制備的酪氨酸酶無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)規(guī)?；瘧?yīng)用，酶的多批次使用問(wèn)題仍未得到有效解決。酶交聯(lián)聚集體是一種無(wú)載體的固定化技術(shù)，該技術(shù)路線可以分為兩個(gè)步驟，即酶的濃縮沉淀和酶的交聯(lián)?，F(xiàn)有報(bào)道中幾乎所有酶交聯(lián)聚集體的制備所用的交聯(lián)劑都需要戊二醛，且易被帶入下游產(chǎn)物，而戊二醛對(duì)人體具有毒性。因此開(kāi)發(fā)環(huán)保、便捷、高效的酶交聯(lián)聚集體應(yīng)用于茶黃素的合成具有十分重要的意義。

多酚化合物廣泛存在于植物中，可以通過(guò)共價(jià)和非共價(jià)的結(jié)合方式與蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合從而改變蛋白結(jié)構(gòu)，同時(shí)多酚與蛋白結(jié)合形成蛋白多酚復(fù)合物也可以影響蛋白的功能，如蛋白多酚結(jié)合復(fù)合物可以影響蛋白的二維和三維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氨基酸親水和疏水性的變化從而增加蛋白的可溶性；蛋白多酚復(fù)合物還能增加溶液的乳化作用，如研究表明大豆分離的蛋白和花青素形成的復(fù)合物能顯著提高溶液的乳化性能；此外，研究還表明沒(méi)食子酸對(duì)蛋白質(zhì)凝膠的性質(zhì)也有一定的影響，一定濃度的沒(méi)食子酸可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集形成不溶性聚合物。由于酪氨酸酶是一種同時(shí)具有單酚酶和二酚酶活性的加氧酶，可以將茶多酚氧化成醌，然后自聚合形成絡(luò)合物。基于此，本研究選擇茶多酚作為酶蛋白交聯(lián)的底物。采用不同濃度、不同類(lèi)型的多酚作為酪氨酸酶的交聯(lián)試劑。結(jié)果表明，底物EGCG 氧化產(chǎn)物具有較高的交聯(lián)回收率。這可能是因?yàn)镋GCG 含有更多的酚羥基，可以更好地與酶蛋白分子交聯(lián)。通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)形成的CLEAs 在各種失活條件（有機(jī)溶劑、溫度、pH 和底物濃度）下表現(xiàn)出更高的穩(wěn)定性。采用CLEAs 和游離酶（活性相同）催化合成TFDG，CLEAs 的產(chǎn)率明顯高于游離酶，且CLEAs 可連續(xù)5 批次反應(yīng)，顯著降低了TFDG 的生產(chǎn)成本。

但是，用多酚作為交聯(lián)反應(yīng)的底物也有一定的局限性。一方面，多酚能與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響催化活性；另一方面，一定濃度的多酚對(duì)酶蛋白有較強(qiáng)的抑制作用，會(huì)導(dǎo)致酶活性的喪失。因此，利用多酚（氧化產(chǎn)物）進(jìn)行酶蛋白交聯(lián)需要考慮以下因素：首先，需要針對(duì)特定的酶蛋白開(kāi)發(fā)相應(yīng)的交聯(lián)方法，不同酶蛋白與不同底物多酚的交聯(lián)效果可能不同，最佳反應(yīng)條件有待探索；其次，有些酶蛋白可能不適合多酚作為交聯(lián)劑，因?yàn)槎喾拥拇嬖跁?huì)嚴(yán)重影響酶的活性；再次，多酚氧化產(chǎn)物的濃度需要定量檢測(cè)和分析，由于多酚氧化產(chǎn)物不穩(wěn)定，目前還沒(méi)有方便的檢測(cè)分析方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。

基于此，未來(lái)可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步提升酶的使用效率：（1）可以選擇與載體共固定的CLEAs 制備，EGCG 作為交聯(lián)劑進(jìn)行酶的交聯(lián)其機(jī)械穩(wěn)定性不高，多批次使用后容易被外界壓力或機(jī)械剪切力所破壞，導(dǎo)致活性損失，這也是多批次反應(yīng)后TFDG 產(chǎn)率下降的原因，因此選擇穩(wěn)定的載體和CLEAs 相互結(jié)合的方法有望進(jìn)一步提升酶的穩(wěn)定性和催化性能；（2）繼續(xù)對(duì)多酚氧化酶進(jìn)行改造和篩選，進(jìn)行以多酚為底物的酶耐受性、催化活性的篩選，提升酶的催化性能，最終獲得滿足工業(yè)化應(yīng)用屬性的CLEAs。

本研究針對(duì)底物兒茶素的特性，創(chuàng)新性的利用兒茶素作為交聯(lián)試劑對(duì)酪氨酸酶進(jìn)行了固定化，制備獲得了CLEAs，并應(yīng)用于茶黃素-3,3′-雙沒(méi)食子酸酯的合成。交聯(lián)酶較游離酶表現(xiàn)出更優(yōu)異的催化性能（熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、底物耐受性）。交聯(lián)酶被用于合成茶黃素-3,3′-雙沒(méi)食子酸酯時(shí)，產(chǎn)物質(zhì)量濃度可達(dá)800 μg·mL-1，且交聯(lián)酶能被重復(fù)循環(huán)使用至少3 個(gè)批次，利用該方法制備茶黃素，可以顯著降低酶的應(yīng)用成本，具有潛在工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。