1例補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血性貧血鑒定分析*

鄒 昕,范小杰

1.江蘇省常州市中心血站輸血研究室,江蘇常州 213004;2.江蘇省常州市第一人民醫(yī)院檢驗科,江蘇常州 213004

自身免疫性溶血性貧血(AIHA)是指人類免疫功能紊亂產(chǎn)生抗自身紅細(xì)胞的抗體,與紅細(xì)胞表面的抗原相結(jié)合或激活補(bǔ)體使紅細(xì)胞壽命縮短的一種獲得性疾病。根據(jù)自身抗體不同,AIHA的自身抗體可分為溫抗體、冷抗體、溫冷抗體混合3種類型[1],其中溫冷抗體混合型比較少見。補(bǔ)體是先天免疫的主要參與者之一。抗原抗體復(fù)合物可以通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體形成膜攻擊復(fù)合物導(dǎo)致紅細(xì)胞直接裂解或被肝脾捕獲參與溶血?，F(xiàn)對1例補(bǔ)體介導(dǎo)的溫冷自身抗體引起的AIHA鑒定過程報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者,女,72歲,2019年1月因貧血而輸注輻照洗滌紅細(xì)胞4 U,2022年2月5日因反復(fù)黃疸伴茶色尿6年余,重度貧血入院,血紅蛋白 56 g/L,網(wǎng)織紅細(xì)胞百分率1.8%,超敏C反應(yīng)蛋白97.85 mg/L,總膽紅素23.5 μmol/L,直接膽紅素9.4 μmol/L,乳酸脫氫酶439 U/L,血糖21.7 mol/L,此次交叉配血中發(fā)現(xiàn)ABO血型鑒定困難,直接抗球蛋白試驗(DAT)陽性,遂送常州市中心血站輸血研究室進(jìn)行交叉配血。

1.2儀器與試劑 抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號:20191119);抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號:20200301101);ABO血型反定型紅細(xì)胞(北京金豪制藥股份有限公司,批號:20200701016);抗體篩選細(xì)胞(德國CE公司,批號:702101);譜細(xì)胞(德國CE公司,批號:732103; 荷蘭Sanquin公司,批號:8000453184);抗球蛋白凝膠卡(上海潤普生物技術(shù)有限公司,批號:10210801;長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號:202100307/20211103);酸放散試劑盒(上海申型醫(yī)學(xué)科技有限公司,批號:20212101); 2-巰基乙醇 (2-Me,上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,批號:20217701)。貝克曼高速離心機(jī),久保田KA-2200血清學(xué)專用離心機(jī);37 ℃/56 ℃恒溫水浴箱;配套卡式離心機(jī)。

1.3方法

1.3.1血清學(xué)檢測 采用試管法和微柱凝膠法檢測患者 ABO及 RhD血型,以及進(jìn)行DAT、間接抗球蛋白試驗(IAT);在不同的條件下進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查(血清在56 ℃滅活、加入新鮮補(bǔ)體試驗,2-Me處理);應(yīng)用譜細(xì)胞進(jìn)行不規(guī)則抗體鑒定;采用等比稀釋法進(jìn)行抗體效價檢測。所有試驗嚴(yán)格按照第18版AABB[2]和《輸血技術(shù)操作規(guī)程:輸血科部分》[3]操作規(guī)程進(jìn)行操作。

1.3.2吸收放散試驗 患者自體細(xì)胞45 ℃放散至DAT陰性,再做自身吸收放散試驗。放散試驗按照酸放散試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3.3溫度依賴性補(bǔ)體結(jié)合試驗 采集ABO同型獻(xiàn)血者不抗凝和EDTA抗凝血標(biāo)本,以獲得新鮮血清和紅細(xì)胞。取洗滌過的紅細(xì)胞20 μL(用生理鹽水配成50%的細(xì)胞懸液)在37 ℃和22 ℃恒溫下孵育15 min,將患者和供體的血清或血漿預(yù)熱至相同溫度,平衡溫度后,在預(yù)熱的紅細(xì)胞中加入100 μL患者血清和100 μL供體血清(含新鮮補(bǔ)體),相應(yīng)溫度下孵育1、2、3、4、5、6、7、8 h觀察溶血情況[4]。

2 結(jié) 果

2.1血型血清學(xué)檢測 ABO血型血清學(xué)鑒定結(jié)果:鹽水介質(zhì)立即離心(IS),正定型A抗原與抗-A反應(yīng)可達(dá)4+,B抗原與抗-B反應(yīng)達(dá)1+,抗-D反應(yīng)4+;反定型IS法均有凝集。溫鹽水洗滌患者紅細(xì)胞6次后繼續(xù)試驗,ABO正定型為A型;反定型在37 ℃孵育1 min后鑒定為A型。正反定型一致。

2.2DAT結(jié)果 直接試管法DAT試驗結(jié)果多抗和抗-C3d均為4+,抗-IgG為弱凝集。同時抗人球蛋白凝膠卡試驗結(jié)果多抗為4+,抗-IgG為2+。AB型血漿對照陰性。

2.3血清和血漿不同條件下抗體篩選結(jié)果 血清和血漿抗篩結(jié)果不一致,37 ℃恒溫孵育15 min 后凝集消失,2-Me處理IgM冷抗體后抗篩結(jié)果仍為陽性。自身對照始終為陽性。具體結(jié)果如表1。

血清在56 ℃孵育30 min滅活后做抗篩試驗,見表2,鹽水中抗篩結(jié)果全陽性,而IAT結(jié)果全為陰性。加入新鮮血清后,IAT結(jié)果又復(fù)為陽性?？贵w鑒定結(jié)果與抗篩結(jié)果一致,沒有特異性。

表2 血清補(bǔ)體試驗結(jié)果(試管法)

2.4抗體效價及性質(zhì)測定 原始血清用鹽水法在4 ℃時效價為256;在22 ℃時效價為16。2-Me處理血清用IAT法在37 ℃時效價為4。

2.5自身吸收和放散試驗 取45 ℃放散成DAT為陰性的患者紅細(xì)胞0.5 mL與自身血清在4 ℃、37 ℃吸收1 h,吸收后的血清抗篩結(jié)果為陰性,表明無其他特異性同種抗體。取未處理的0.5 mL患者壓積紅細(xì)胞進(jìn)行酸放散試驗,在酸放散液中進(jìn)行抗體篩選,結(jié)果IS和IAT試驗全陰性。

2.6溫度依賴性補(bǔ)體結(jié)合試驗 溫度依賴性補(bǔ)體結(jié)合試驗結(jié)果37 ℃組在試驗開始1 h出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,而22 ℃組在4 h出現(xiàn)溶血,兩組隨著時間的延長溶血程度均有增加。

3 討 論

臨床上AIHA患者體內(nèi),自身抗體和同種抗體往往同時存在且呈泛反應(yīng)現(xiàn)象,此類患者大多數(shù)DAT呈陽性[5]。鑒別紅細(xì)胞上的抗體非常重要,該類患者若進(jìn)行不相容輸血后,其自身抗體會對供者紅細(xì)胞產(chǎn)生致敏反應(yīng),且在補(bǔ)體作用下極易發(fā)生溶血現(xiàn)象。

結(jié)合本例患者病史、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查依據(jù),包括總膽紅素、直接膽紅素、乳酸脫氫酶等,均證明紅細(xì)胞有溶血現(xiàn)象。本案例DAT試驗證明以抗-C3d陽性為主。高效價的冷抗體致使紅細(xì)胞自凝,在溫鹽水洗滌以及37 ℃孵育后檢出患者血型為A型、RhD陽性。該患者原始血清和血漿抗篩結(jié)果截然相反,這是由于EDTA抗凝劑能夠結(jié)合Ca2+離子,抑制了補(bǔ)體的激活途徑,此抗體可能是具有廣譜特異性的自身抗體[6]。在實驗室檢測時把血清在56 ℃滅活30 min,IAT結(jié)果為陰性,而增加新鮮血清即補(bǔ)體,IAT結(jié)果又為陽性,這進(jìn)一步證明補(bǔ)體介導(dǎo)抗體引起溶血[7]。在原始血清中的IAT(抗-IgG+抗-C3d、抗-IgG)均為陽性,與試管法結(jié)果一致。進(jìn)一步嘗試證明補(bǔ)體介導(dǎo)的是冷抗體或溫抗體還是溫冷混合自身抗體引起的溶血。用2-Me破壞IgM抗體后再進(jìn)行抗篩,結(jié)果凝集強(qiáng)度下降,說明補(bǔ)體介導(dǎo)了溫冷混合自身抗體引起溶血。該抗體在4 ℃時效價高達(dá)256,而37 ℃時(IAT法)效價為4,證明本例患者主要以冷抗體為主[8]。酸放散抗篩結(jié)果全為陰性,原因可能是IgM/IgG抗體量少,低于檢測閾值而未檢出或沒有,只有補(bǔ)體致敏紅細(xì)胞,今后可以考慮其他放散方法,如56 ℃熱放散等方法[9]。用自身抗體進(jìn)行冷吸收后發(fā)現(xiàn)吸收后的血清抗體篩查陰性,進(jìn)一步排除有同種抗體存在,且該自身抗體既有冷抗體的特性又有溫抗體的特性。AIHA患者如何輸注血液是關(guān)鍵。溫度依賴性補(bǔ)體結(jié)合試驗原理是在體外將患者血漿中的溶血相關(guān)抗體置于37 ℃和22 ℃充分致敏供者紅細(xì)胞,加入補(bǔ)體使其吸附于抗原抗體上,通過補(bǔ)體的激活作用在紅細(xì)胞膜上形成一個通道,使紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白溢出,發(fā)生溶血現(xiàn)象[10-13]。

本例患者溫度依賴性補(bǔ)體結(jié)合試驗在37 ℃和22 ℃配血均有溶血現(xiàn)象,說明患者體內(nèi)存在能與輸入紅細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體,并且有補(bǔ)體特異性,存在輸入后產(chǎn)生血管內(nèi)急性溶血性輸血反應(yīng)的因素,后來跟醫(yī)院協(xié)商患者暫時不輸血。此類患者只在血清中檢出抗體,而臨床上相當(dāng)一部分醫(yī)院只用EDTA抗凝管的血漿進(jìn)行抗體篩查和交叉配血,容易漏檢,輸血風(fēng)險很大。如必須輸血的話盡量選擇常規(guī)配血加溶血試驗,降低溶血性輸血反應(yīng)及其他不良反應(yīng)的發(fā)生。