健脾補(bǔ)腎法對(duì)人結(jié)直腸癌移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的影響

王夢(mèng)涵 姚欣 袁婉婧 李梅 黃興瑜 孫怡 曾宏亮 謝彪

摘要：目的 探討健脾補(bǔ)腎法對(duì)人結(jié)直腸癌移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的影響。方法 于裸鼠右腿內(nèi)側(cè)接種人結(jié)腸癌細(xì)胞，建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，15d后脫頸處死剝離瘤體。對(duì)照組用生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組用健脾補(bǔ)腎中藥灌胃，免疫組化法檢測(cè)2組移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB及CD34、D2-40的表達(dá)。結(jié)果 免疫組化顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB的表達(dá)均明顯下調(diào)（P<0.05），微血管CD34及淋巴管D2-40也明顯下調(diào)（P<0.005）。結(jié)論 健脾補(bǔ)腎法能明顯下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織炎癥受體TLR4及RAGE、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、腫瘤新生血管標(biāo)記物CD34及腫瘤新生淋巴管標(biāo)記物D2-40的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：健脾補(bǔ)腎法；結(jié)直腸癌；TLR4；RAGE；NF-κB；CD34；D2-40

中圖分類號(hào)：R735.3+7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2023）03-0078-05

Effects of Spleen-and-Kidney Invigorating Method on TLR4， RAGE， NF-κB， CD34， D2-40 in Human Colorectal Cancer Transplanted Tumor Tissue

WANG Meng-han¹， YAO Xin¹， YUAN Wan-jing²， LI Mei²， HUANG Xing-yu²， SUN Yi¹， ZENG Hong-liang³， XIE Biao²

（1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410005， China; 3. Hunan Institute of Traditional Chinese Medicine， Changsha 410031， China）

【Abstract】To study the effect of spleen-and-kidney invigorating method on TLR4， RAGE， NF-κB， CD34， D2-40 in human colorectal cancer transplanted tumor tissue. Methods： Human colorectal cancer cells were inoculated on the inside of the right leg of nude mice to establish a subcutaneous tumor transplantation model of human colorectal cancer in nude mice and the mice was sacrificed to remove the tumor from the neck 15 days later. The control group was given intragastric administration with normal salt and the experimental group was intragastrically given with decoction for invigorating spleen and kidney. The expressions of TLR4， RAGE， NF-κB， CD34 and D2-40 in the transplanted tumor tissues were detected by immunohistochemical method. Results： Compared with that of the control group， the expressions of TLR4， RAGE and NF-κB in the experimental group were significantly down-regulated（P<0.05）， and the expressions of CD34 in microvessels and D2-40 in lymphatic vessels were also significantly down-regulated（P<0.005）. Conclusion： The spleen-and-kidney invigorating method can significantly down-regulate the expression of inflammatory receptor TLR4 and RAGE， nuclear transcription factor NF-κB， tumor neovascularization marker CD34 and tumor neovascularization marker D2-40 in human colorectal cancer graft tissue.

【Key words】Spleen-And-Kidney Invigorating Method；Colorectal Cancer；TLR4；RAGE；NF-κB；CD34；D2-40

結(jié)直腸癌在我國(guó)癌癥病例中位于前5位，其發(fā)病率和死亡率也在逐年上升^［1-2］。結(jié)直腸癌目前治療以手術(shù)切除、放化療、靶向治療為主，但其復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率及病死率仍較高。相較于傳統(tǒng)手術(shù)治療，中醫(yī)藥對(duì)惡性腫瘤的治療也起到關(guān)鍵作用，具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，是我國(guó)治療惡性腫瘤的特色療法^［3］。腎為先天之本，脾為后天之本，脾腎不足則氣血生化乏源，使臟腑功能失調(diào)，氣血津液運(yùn)行不暢，痰濕瘀毒內(nèi)阻，日久則產(chǎn)生腫瘤。通過采取健脾補(bǔ)腎法治療結(jié)直腸癌能夠改善氣血津液的運(yùn)行，提高機(jī)體的抵抗力，改善患者的生活質(zhì)量。

腫瘤的增殖與炎癥微環(huán)境、腫瘤新生血管及淋巴管有密切關(guān)系。TLR4的表達(dá)在啟動(dòng)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)腫瘤周圍的炎性環(huán)境起著關(guān)鍵作用^［4］。

研究發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）與炎性反應(yīng)、腫瘤侵襲力及血管再生均有關(guān)聯(lián)^［5］。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［6］。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中微血管CD34、微淋巴管D2-40表達(dá)明顯高于其在癌旁組織及正常組織^［7-8］，CD34、D2-40的表達(dá)上調(diào)可能在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有重要作用。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)直腸癌移植瘤組織為研究對(duì)象，通過免疫組化法檢測(cè)2組移植瘤組織中炎性受體TLR4、RAGE，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及微血管CD34、微淋巴管D2-40的表達(dá)情況，探討健脾補(bǔ)腎法對(duì)人結(jié)直腸癌移植瘤組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF及裸鼠16只，雌雄各半，體重（18±2）g。購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2020-0008）。自由飲水和進(jìn)食，動(dòng)物房恒溫24℃，相對(duì)濕度60%。

1.2 主要儀器 石蠟包埋機(jī)（YB-8LF）、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（RM2245）、生物組織攤烤片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司 YT-7F型）、自動(dòng)組織脫水機(jī)（HP300）、顯微鏡（奧林巴斯 BX53）、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）。

1.3 藥品與試劑 健脾補(bǔ)腎類中藥顆粒購(gòu)買于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（人參、黃芪、砂仁、白術(shù)、茯苓、陳皮、半夏、山藥、女貞子、墨旱蓮、菟絲子、枸杞、雞血藤、白花蛇舌草、三七、半枝蓮、甘草），每袋含13.8 g，用熱水調(diào)制成77 mL的中藥溶液（等效濃度）。NF-κB抗體、RAGE抗體、TLR4抗體、CD34抗體、D2-40抗體均購(gòu)買于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（HCT116）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.4 分組、造模及給藥 16只裸鼠適應(yīng)約一周后進(jìn)行腫瘤模型的建立。于右腿內(nèi)側(cè)皮下注射人結(jié)直腸癌細(xì)胞株（HCT116）0.15 mL（含細(xì)胞1×10⁷個(gè)）。造模后隨機(jī)分成對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每組各8只。對(duì)照組灌胃0.9%氯化鈉溶液0.4 mL·d^-1，實(shí)驗(yàn)組灌胃健脾補(bǔ)腎類中藥23.4 g·kg^-1，2組均隔天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.5 取材 15d時(shí)脫頸處死裸鼠，剝離瘤體，眼科剪將其剪成兩塊，一塊常規(guī)石蠟包埋，一塊置于-80℃冰箱凍存待用。

1.6 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織NF-κB、RAGE、TLR4、CD34、D2-40的表達(dá) 石蠟包埋組織切片、脫蠟處理、流水沖洗后用蒸餾水浸泡5 min；將切片置于pH值6.0的檸檬酸鈉緩沖液中煮沸15 min、流水沖洗；將切片浸泡于3%過氧化氫溶液20分鐘、PBS沖洗三次；封閉后分別加一抗NF-κB（1∶100）、RAGE（1∶100）、TLR4、CD34，4 ℃冰箱過夜，加二抗37℃烤箱內(nèi)孵育30 min、PBS沖洗三次；DAB顯色、蘇木素染液襯染；脫水、透明、封片。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：由病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片。

NF-κB、TLR4顯示胞質(zhì)及胞膜陽性（有黃色或棕褐色顆粒）、RAGE顯示胞核及胞質(zhì)陽性（有黃色或黃棕色顆粒）。陽性細(xì)胞<5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別對(duì)應(yīng)0，1，2，3，4分。

微血管CD34及微淋巴管D2-40均在每張切片取5個(gè)400倍視野數(shù)血管及淋巴管總數(shù)，然后取其平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較符合正態(tài)分布采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組裸鼠移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB免疫組化表達(dá)情況 結(jié)果顯示，TLR4、RAGE、NF-κB在對(duì)照組中呈現(xiàn)高表達(dá)，經(jīng)健脾補(bǔ)腎中藥干預(yù)后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB的表達(dá)明顯下調(diào)，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1、表1。

2.2 2組裸鼠移植瘤組織微血管CD34、微淋巴管D2-40免疫組化表達(dá)情況 結(jié)果顯示，經(jīng)健脾補(bǔ)腎中藥干預(yù)后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中的血管CD34及淋巴管D2-40明顯減少，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005），見圖2、表2。

3 討論

結(jié)直腸癌屬中醫(yī)學(xué)“腸溜”“腸澼”“積聚”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本虛標(biāo)實(shí)是結(jié)直腸癌的病機(jī)特點(diǎn)，本虛為脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)為濕熱毒邪積聚。健脾補(bǔ)腎法以益氣補(bǔ)腎健脾為主，兼以解毒消腫散結(jié)，從而達(dá)到“扶正不助邪，驅(qū)邪不傷正”的目的。現(xiàn)代藥理研究表明，人參具有抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)神經(jīng)、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性^［9］，茯苓具有抗炎和抗腫瘤的作用^［10］，黃芪、白花蛇舌草也具有抗癌作用^［11-12］，補(bǔ)腎類中藥可改善腎功能，延緩腎功能衰竭進(jìn)展^［13］。

近年研究表明，慢性炎癥與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，而介導(dǎo)炎癥的TLR4、RAGE、NF-κB在許多癌細(xì)胞系和腫瘤組織都有表達(dá)，且與大部分癌癥的發(fā)展情況正相關(guān)^［14-15］。中醫(yī)藥在治療腫瘤疾病時(shí)也能下調(diào)TLR4、RAGE、NF-κB的表達(dá)^［16］。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健脾補(bǔ)腎法能夠下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織中TLR4、RAGE、NF-κB的表達(dá)，表明健脾補(bǔ)腎法能對(duì)抑制人結(jié)直腸癌移植瘤的增殖有效果。

健脾補(bǔ)腎法抑制腫瘤增殖可能通過減少腫瘤新生血管及淋巴管有關(guān)。CD34是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些干細(xì)胞及祖細(xì)胞等表達(dá)的跨膜糖蛋白，是目前腫瘤新生小血管特異性相對(duì)較好的標(biāo)記物^［17］。CD34陽性血管的微血管密度與結(jié)直腸癌的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)^［18］。D2-40是腫瘤微淋巴管的特異標(biāo)記物，對(duì)微淋巴管內(nèi)皮具有選擇性免疫反應(yīng)性，研究表明腫瘤組織微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的D2-40的表達(dá)要高于癌旁組織^［19］。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)健脾補(bǔ)腎法能下調(diào)人結(jié)直腸移植瘤組織中CD34、D2-40的表達(dá)，說明健脾補(bǔ)腎法能抑制人結(jié)直腸癌移植瘤的增殖。

健脾補(bǔ)腎法通過下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織TLR4、RAGE、NF-κB的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)人結(jié)直腸癌移植瘤組織CD34、D2-40的表達(dá)，說明健脾補(bǔ)腎法能抑制腫瘤新生血管及淋巴管的形成，從而破壞腫瘤的生存環(huán)境，抑制腫瘤的增殖，并且可能通過TLR4/RAGE/NF-κB途徑，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］Bray F，Laversanne M，Weiderpass E，et al.The ever-increasing importance of cancer as a leading cause of premature death worldwide［J］.Cancer.2021 Aug 15；127（16）：3029-3030.

［2］Xia C，Dong X，Li H，et al.Cancer statistics in China and United States，2022：profiles，trends，and determinants［J］.Chin Med J（Engl），2022，135（5）：584-590.

［3］劉曉蕾，馬立東，張朵朵.青蒿琥酯通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制人胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及對(duì)PCNA和ZNF139表達(dá)的影響［J］.中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2022，22（10）：1201-1205.

［4］Xie B，Nie S，Hu G，Xiong L，et al.The Involvement of NF-κB/Klotho Signaling in Colorectal Cancer Cell Survival and Invasion［J］.Pathol Oncol Res，2019，25（4）：1553-1565.

［5］王瑤，韓為東.CAR T細(xì)胞治療在血液惡性腫瘤中的進(jìn)展與挑戰(zhàn)［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2020，36（9）：1037-1043.

［6］Barham W，Chen L，Tikhomirov O，et al.Aberrant activation of NF-κB signaling in mammary epithelium leads to abnormal growth and ductal carcinoma in situ［J］.BMC Cancer，2015（15）：647.

［7］Bowers LW，Rossi EL，McDonell SB，et al.Leptin Signaling Mediates Obesity-Associated CSC Enrichment and EMT in Preclinical TNBC Models［J］.Mol Cancer Res，2018，16（5）：869-879.

［8］Prugmahachaikul A，Sanpavat A.Prognostic Significance of Lymphovascular Invasion Detected by D2-40 in Low-Risk Stage II Colon Cancer.Cureus［J］.2021，13（11）：e19825.

［9］Gu J，Sun R，Wang Q，et al.Standardized Astragalus Mongholicus Bunge-Curcuma Aromatica Salisb.Extract Efficiently Suppresses Colon Cancer Progression Through Gut Microbiota Modification in CT26-Bearing Mice［J］.Front Pharmacol，2021（12）：714322.

［10］Qian K，F(xiàn)u D，Jiang B，et al.Mechanism of Hedyotis Diffusa in the Treatment of Cervical Cancer［J］.Front Pharmacol，2021，15（12）：808144.

［11］Ma X，Wu J，Liu C，et al.Deciphering of Key Pharmacological Pathways of Poria Cocos Intervention in Breast Cancer Based on Integrated Pharmacological Method［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2020（9）：4931531.

［12］程虹，鄒新蓉，李穎霞，等.腎元顆粒對(duì)慢性腎臟病3～5期非透析患者血清成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4、Klotho蛋白的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2020，17（28）：125-128.

［13］吳勉華，李棟.消癌解毒方加入脂多糖及CD284對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的TLRs/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TLR4等mRNA和蛋白表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（12）：3047-3051.

［14］劉瑩，蔣敦科，李素艷，等.2型糖尿病合并結(jié)腸癌老年患者腫瘤組織中晚期糖基化終產(chǎn)物受體及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)及臨床意義［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2019，39（6）：1334-1337.

［15］陳茂劍，蔣瑋，毛岸云，等.辣椒堿對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（7）：82-88.

［16］Chabowski M，Nowak A，Grzegrzolka J，et al.Comparison of Microvessel Density Using Nestin and CD34 in Colorectal Cancer［J］.Anticancer Res，2018，38（7）：3889-3895.

［17］Yu Y，Blokhuis BR，Garssen J，et al.A Transcriptomic Insight into the Impact of Colon Cancer Cells on Mast Cells［J］.Int J Mol Sci，2019，20（7）：1689.

［18］Pentheroudakis G，Mavroeidis L，Papadopoulou K，et al.Angiogenic and Antiangiogenic VEGFA Splice Variants in Colorectal Cancer：Prospective Retrospective Cohort Study in Patients Treated With Irinotecan-Based Chemotherapy and Bevacizumab［J］.Clin Colorectal Cancer，2019，18（4）：e370-e384.

（收稿日期：2022-05-18）