CD161流式細胞術(shù)對活動性肺結(jié)核診斷效能的評價*

張雅曦,張明霞,楊倩婷,孟 娟,余志勇,陳 騎

深圳市第三人民醫(yī)院肝病研究所,廣東深圳 518112

結(jié)核病是危害全球公眾健康的一種常見的慢性傳染性疾病,感染途徑主要是通過呼吸道感染兼性胞內(nèi)致病結(jié)核分枝桿菌(TB)[1]。早期診斷和及時治療活動性肺結(jié)核,可阻止結(jié)核病患者在社區(qū)內(nèi)的進一步傳播。然而,通過病原學診斷疑似結(jié)核病患者可能需要很長時間,花費較高,導致臨床診斷滯后和治療延誤[2]。有研究表明,全球每年近1 040萬例新發(fā)結(jié)核病病例和180萬例死亡病例[3],因此,改進和加快診斷評估手段仍然是結(jié)核病患者的臨床診斷和公共衛(wèi)生重點。

本課題組在前期工作中,利用流式細胞術(shù)對不同類型的細胞表面分子和臨床標本進行分析,發(fā)現(xiàn)活動性肺結(jié)核患者CD161水平明顯低于健康者和潛伏感染者,并且流式細胞術(shù)能簡單區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和健康者[4-5]。在此基礎(chǔ)上,為更有效區(qū)分不同類型的結(jié)核病患者,利用目前流行的深度學習網(wǎng)絡(luò)建立分類模型,探索CD161在活動性肺結(jié)核中的輔助診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年4—12月在本院住院的268例確診為活動性肺結(jié)核患者的臨床資料,其中痰涂片結(jié)果為陽性(涂陽)的患者170例為涂陽組,3次或以上痰涂片結(jié)果未見TB(涂陰)的患者98例為涂陰組,并對其中初治結(jié)核患者(47例)和耐多藥結(jié)核患者(37例)進行跟蹤隨訪。另選取本院的體檢健康者138例為對照組。結(jié)核病患者診斷根據(jù)相關(guān)標準執(zhí)行[6],涂陽患者:痰涂片為陽性,診斷類型為繼發(fā)性;涂陰患者:細菌學陰性,初治無合并其他傳染病、自身免疫性疾病;結(jié)核治愈患者:正規(guī)抗結(jié)核治療時間6個月以上,病原學檢測陰性,多次影像學胸部CT檢查無明顯變化,停止抗結(jié)核治療達到非活動性肺結(jié)核或陳舊肺結(jié)核標準。體檢健康者:均經(jīng)胸部X線或CT檢查,排除肺部結(jié)核及肺外部位結(jié)核,既往無結(jié)核史,無結(jié)核接觸史,未服用過抗結(jié)核藥物。

1.2儀器與試劑 全自動熒光定量PCR儀(型號:ABI-7500)購自美國賽沛公司,酶聯(lián)免疫斑點(Elispot)試驗讀板儀購自美國CTL公司,細胞流式儀CantoⅡ購自美國BD公司。TB-DNA核酸檢測試劑盒(批號:20200801)購自達安基因股份有限公司,GeneXpert檢測試劑盒(批號:1000166969)購自深圳市同春和生物科技有限公司,γ干擾素釋放試驗(IGRAs)試劑盒(批號:20200600905)購自北京同生時代生物科技有限公司,流式CD161試劑盒(批號:20200501)購自深圳市聯(lián)合醫(yī)學科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 采用肝素鋰抗凝管采集受試者新鮮外周血8 mL用于Elispot試驗,采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集受試者新鮮外周血2 mL用于流式CD161檢測,結(jié)核病患者留取有效晨痰3～4份標本用于細菌學檢測。

1.3.2流式細胞術(shù) 流式結(jié)果用軟件FlowJo進行分析,分別圈出單核細胞(CD45+CD64+)、淋巴細胞(CD45+CD64-)、CD161+細胞(CD45+CD64-CD161+),最后得出單核細胞比例(M%)、淋巴細胞比例(L%)和CD161陽性淋巴細胞比例(CD161+%)。

1.3.3深度學習網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及運算 跟據(jù)深度學習網(wǎng)絡(luò)模型的訓練機制,將數(shù)據(jù)集按照4∶1的比例隨機劃分為訓練集和測試集,以擬合出網(wǎng)絡(luò)模型對該數(shù)據(jù)的最佳性能。深度學習網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建采用用TensorFlow的Keras數(shù)據(jù)庫,建立4層序貫式神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。輸入層為3個維度,即M%、L%和CD161+%;隱藏層包括3層全連接層,激活函數(shù)均為修正線性單元(ReLu),其中第2層為隨機失活droupout層[5];最后1層為輸出層,激活函數(shù)為sigmoid,優(yōu)化器為Adam,輸出類別為TB。模型默認以0.45為判斷值,即每個標本預測概率值(OR)≥0.45為結(jié)核病患者,否則為健康者。模型性能評判指標包括受試者工作特征(ROC)曲線、靈敏度、特異度、準確率等。

2 結(jié) 果

2.1不同檢測方法在活動性肺結(jié)核中的診斷效能 結(jié)果顯示,GeneXpert在涂陽組和涂陰組中的檢出率分別為87.65%、28.57%,TB-DNA的檢出率分別為81.18%、20.41%,痰培養(yǎng)的檢出率分別為60.00%、24.48%,Elispot試驗的檢出率分別為85.29%、64.28%。見表1。

表1 不同檢測方法在活動性肺結(jié)核中的診斷效能[n(%)]

2.2基于流式細胞術(shù)的深度學習網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與運算 結(jié)果顯示,各組L%、CD161+%、M%、OR比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。通過大量數(shù)據(jù)在訓練集上構(gòu)建深度學習網(wǎng)絡(luò)模型,發(fā)現(xiàn)模型能很好鑒別涂陽組和對照組,測試集的ROC曲線下面積(AUC)為0.87(95%CI0.84～0.91),準確率為0.82,靈敏度為0.77,特異度為0.84;鑒別涂陰組和對照組的AUC為0.79(95%CI0.73～0.85),準確率為0.71,靈敏度為0.71,特異度為0.84。見表3、圖1。

圖1 深度學習網(wǎng)絡(luò)模型對各組的診斷效能

表2 各組L%、M%、CD161+%、OR比較

表3 深度學習網(wǎng)絡(luò)模型對各組的診斷效能

2.3深度學習網(wǎng)絡(luò)模型在抗結(jié)核治療指標的評估 Elispot試驗在涂陽結(jié)核、涂陰結(jié)核和結(jié)核治愈患者中的檢出率分別為85.29%、64.28%、61.50%,而深度學習網(wǎng)絡(luò)模型的檢出率分別為77.05%、71.42%、16.84%。

為了驗證深度學習網(wǎng)絡(luò)模型在抗結(jié)核治療中的動態(tài)表現(xiàn),隨訪了84例活動性肺結(jié)核患者,其中初治結(jié)核47例,耐藥結(jié)核37例。在治療0、3、6個月時檢測L%、M%和CD161+%,并在測試集上驗證,閾值≥0.45為陽性。結(jié)果顯示,初治結(jié)核患者0、3、6個月時OR均值分別為0.741、0.433、0.304,檢出率分別為82.97%、46.80%、19.10%;耐藥結(jié)核患者OR均值分別為0.683、0.520、0.525,檢出率分別為72.90%、48.64%、51.35%。見表4。

表4 深度學習網(wǎng)絡(luò)模型在抗結(jié)核治療指標的評估

3 討 論

早發(fā)現(xiàn)、早治療是所有傳染性疾病的防控策略,是消除疾病和降低疾病病死率的重要手段。然而目前的醫(yī)學研究水平對于結(jié)核病的早期快速診斷和短程高效治療略有延遲或不足,流行病學調(diào)查結(jié)果顯示,新增感染、耐多藥結(jié)核例數(shù)及結(jié)核病病死率逐年增長有諸多因素,但缺乏快速、早期診斷結(jié)核病感染的方法是關(guān)鍵的原因之一[6]。無法早期有效治療和有效控制傳染源,可導致結(jié)核病快速間接或直接傳播擴散。

研究結(jié)核病早期、快速、特異、靈敏且低費用的檢測方法和手段是實驗室的終極目標。目前臨床為準確診斷結(jié)核病,聯(lián)合多指標、多手段來解決診治難的問題。其中分子生物學GeneXpert檢測技術(shù)具有較高的特異度和靈敏度,TB-DNA等方法可極大提高有痰液結(jié)核病患者的確診率[7-8]。在檢出涂陽患者的各種方法學中,GeneXpert特異度較高,但缺點是臨床有部分無痰液患者無法檢測[9];IGRAs法檢測標本易得,可以區(qū)分健康者和潛伏感染者,但無法鑒別活動性肺結(jié)核和潛伏感染者[10-11];微創(chuàng)支氣管纖維鏡能使臨床醫(yī)生更直觀了解TB引起的肺部病灶,其中肺泡灌洗液的TB培養(yǎng)可提高無痰患者、涂陰患者的檢出率[12-13]。因此,聯(lián)合診斷可提高檢出率,減少漏檢,但高昂費用和檢測平臺的建立并無普及優(yōu)勢。

CD161被認為是Th17細胞的標志物[14-15],Th17細胞分泌的白細胞介素-17A和白細胞介素-17F兩種前炎癥因子在TB清除中起到重要作用[16-17]。CD161表達細胞另一個重要的基團是黏膜相關(guān)恒定的T淋巴細胞(MAIT)[17-19],在宿主病原體防御中發(fā)揮重要作用,尤其是與重癥患者細菌感染炎癥密切相關(guān)[20]。本研究基于CD161流式細胞術(shù)結(jié)果,通過人工智能算法建立判斷方法,其檢測結(jié)果更為客觀。目前的研究認為單指標的診斷有較大的局限性,其靈敏度和特異度還有待提高。因此,研究人員嘗試通過組合不同的標志物建立人工智能分類模型提高檢出率。而作為機器學習的分支,深度學習網(wǎng)絡(luò)模型在復雜問題上更具優(yōu)勢,且不需要太關(guān)注特征工程相關(guān)工作[21]。研發(fā)高效、人工智能化、快速、靈敏、特異、準確、經(jīng)濟實用的檢測方法可為結(jié)核病的防控提供有力的支持。

利用流式細胞術(shù)檢測CD161、淋巴和單核細胞的比例,結(jié)合深度學習網(wǎng)絡(luò)模型,能有效分辨出健康者及結(jié)核病患者,其鑒別健康者和涂陽患者的靈敏度、特異度分別為0.77、0.84,鑒別健康者和涂陰患者的靈敏度、特異度分別為0.71、0.84,在涂陰患者中的準確率(即檢出率)為0.71。而痰培養(yǎng)、GeneXpert、TB-DNA、Elisopt在涂陰患者中的檢出率分別為24.49%、28.57%、20.41%、64.29%,提示該技術(shù)在涂陰結(jié)核中的檢出率明顯高于其他檢測方法的檢出率。這些結(jié)果提示,該檢測方法對于涂陰結(jié)核患者的診斷有輔助效能。

目前關(guān)于結(jié)核病治療效果的判斷,臨床上主要依靠臨床癥狀的改變及影像學的變化判斷,因此非常依賴臨床醫(yī)生的經(jīng)驗。本研究發(fā)現(xiàn)CD161流式細胞術(shù)對于結(jié)核病治療療效有一定的指導意義,其CD161評分(OR均值)在結(jié)核治愈患者(治療6個月)較結(jié)核病患者(治療0個月)降低,提示結(jié)核治愈患者中CD161可隨體內(nèi)TB的清除,而降至正常水平。其中初治患者在抗結(jié)核治療3個月OR均值開始明顯下降,6個月降至正常范圍。然而,耐藥結(jié)核患者OR均值維持在較高水平,與患者病情保持一致。因此,通過監(jiān)測CD161的變化可以提示在結(jié)核病治療中的不同人群是否已達到治愈或非活動性肺結(jié)核標準,減少抗結(jié)核藥物對各組織器官帶來的損傷。

綜上所述,本研究結(jié)果表明以CD161為標識的流式細胞術(shù)結(jié)合深度學習網(wǎng)絡(luò)智能模型可作為輔助診斷技術(shù),在指導臨床抗結(jié)核治療用藥時間及非活動性肺結(jié)核復發(fā)預測中具有參考價值。當然本研究只是小樣本的檢測結(jié)果,下一步需要擴大樣本進行多中心的檢測證實研究的可行性。