處理牙本質(zhì)基質(zhì)浸提液對牙髓干細胞成牙分化的影響

李 銳,付昊杰,孫晶晶,鄭 廉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科 鄭州 450052

牙體缺損或牙齒缺失是常見口腔疾病,嚴重影響患者的健康及生活質(zhì)量。臨床治療中減少牙體缺損的最佳方法是盡可能保存活髓[1],因此,構(gòu)建一種利于保存活髓的蓋髓材料至關(guān)重要。目前,天然生物材料、人工合成生物材料以及各種復(fù)合材料等已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蓋髓材料和牙髓再生中,但均有不足[2-3]。作者所在課題組前期研究[3]表明處理牙本質(zhì)基質(zhì)(treated dentin matrix,TDM)浸提液中含有多種牙源性生物活性蛋白和生長因子,如牙本質(zhì)唾液磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷酸蛋白1(dentin matrix acidic phosphoprotein 1,DMP-1)等;TDM作為人牙齒中提取的材料,具有良好的生物相容性,同時具有疏松多孔的結(jié)構(gòu),碾磨成糊劑用于蓋髓,可以提供良好的成牙誘導(dǎo)環(huán)境[4]。然而,TDM浸提液誘導(dǎo)牙源性干細胞成牙分化的機制尚不清楚。

Wnt/β-catenin信號通路在牙齒發(fā)育過程中至關(guān)重要,糖原合成酶激酶3β(glucogen synthase kinase 3β,GSK3β)是該通路中一個非常重要的負性轉(zhuǎn)化因子,已被證明可以持續(xù)阻止β-catenin入核,使β-catenin被降解,進而影響牙齒發(fā)生及釉質(zhì)形成[5-6]。本研究觀察了TDM浸提液作用后牙源性干細胞成牙誘導(dǎo)過程中Wnt/β-catenin信號通路的改變,以期為臨床治療牙體缺損或牙齒缺失提供依據(jù),并為組織工程再生領(lǐng)域提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 TDM浸提液的制備于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集離體牙,納入標準為無齲壞、無根管治療的阻生齒或因正畸需要拔除的牙齒。去除離體牙的牙冠、牙髓、髓腔內(nèi)前期牙本質(zhì)及根尖3 mm,純水超聲清洗后,依次置于不同濃度EDTA溶液中梯度脫礦(17 mol/L 10 min;10 mol/L 5 min;5 mol/L 10 min),制備TDM。掃描電鏡下觀察TDM結(jié)構(gòu)。根據(jù)文獻[7]及國際質(zhì)量標準(ISO10093),使用低溫研磨機將TDM研磨為粉末狀,每100 mL DMEM培養(yǎng)基加入20 g TDM粉末,37 ℃培養(yǎng)箱中放置3 d,過篩(0.22 μm)收集TDM浸提液,保存于-80 ℃冰箱。

1.2 牙髓干細胞(dental pulp stem cell,DPSC)的培養(yǎng)及鑒定取18～25歲患者因阻生拔除的健康完整牙齒(通過該院倫理委員會批準,2022-KY-0016-002),參照Gronthos等[8]的方法,無菌條件下劈開牙齒,取出牙髓組織,去除根尖1/3,剪碎,3 g/L Ⅰ型膠原酶(Gibco公司)37 ℃消化30 min,接種于培養(yǎng)瓶中,37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。

細胞來源驗證:采用免疫熒光染色。取第3代細胞接種于24孔板,4 ℃、40 g/L多聚甲醛固定,50 g/L牛血清白蛋白室溫封閉后加入一抗[間充質(zhì)干細胞標記蛋白波形蛋白(Vimentin)、Stro-1與上皮來源干細胞標記蛋白重組角蛋白14(cytokeratin 14,CK14)抗體均購自Abcam公司,按1∶1 000稀釋]過夜,加二抗及DAPI,熒光封片劑封片后,熒光顯微鏡下觀察。

多向分化潛能驗證:取第3代細胞接種于6孔板,常規(guī)培養(yǎng)至約80%融合后,分別用成神經(jīng)誘導(dǎo)液、成脂誘導(dǎo)液或成骨誘導(dǎo)液(購自賽業(yè)生物科技有限公司)進行誘導(dǎo)。處理24 h后行β-Ⅲ tubulin免疫熒光染色,處理14 d后行油紅O染色,處理21 d后行茜素紅染色,倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 TDM誘導(dǎo)后DPSC中成牙相關(guān)蛋白DSPP、DMP-1、Runx家族轉(zhuǎn)錄因子2(Runx family transcription factor 2,Runx2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表達的檢測將第3代DPSC以1×105個/孔接種到6孔板。分為2組,分別用正常培養(yǎng)基(正常對照組)和TDM浸提液(TDM組)培養(yǎng),7 d后收集細胞。采用Western blot法檢測DSPP、DMP-1、Runx2、ALP的表達,其中DSPP、DMP-1抗體購自Santa Cruz公司,Runx2、ALP抗體購自Abcam公司。使用蛋白裂解液提取細胞蛋白,凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。使用50 g/L的牛血清白蛋白封閉,加一抗(均按1∶1 000稀釋),隨后加二抗孵育,曝光。以目的蛋白條帶與內(nèi)參(GAPDH)條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

收集處理7 d的2組DPSC,用免疫熒光染色觀察細胞中ALP及DSPP的表達。用40 g/L多聚甲醛固定DPSC,PBS沖洗后加TritonX-100對細胞膜進行通透;加BSA封閉后,加入一抗(DSPP、ALP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,均按1∶500稀釋)、熒光二抗(美國Cell Signaling Technology公司)孵育,隨后于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 TDM誘導(dǎo)后DPSC 中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的測定將第3代DPSC以1×105個/孔接種到6孔板,同上分組處理24 h。采用Western blot法檢測DPSC中總GSK3β、磷酸化GSK3β(Ser9)的表達(均按1∶1 000稀釋);采用免疫熒光染色法檢測活化β-catenin(1∶100稀釋)的定位和表達;采用細胞核蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)提取2組細胞核蛋白,Western blot法檢測活化β-catenin的表達(以GAPDH為內(nèi)參)。所用抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。GSK3β磷酸化水平為磷酸化GSK3β(Ser9)與總GSK3β表達量的比值。實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗比較正常對照組和TDM組DPSC中成牙相關(guān)蛋白、GSK3β磷酸化水平及活化β-catenin蛋白的表達水平;檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TDM的制備與DPSC的鑒定離體牙去除牙冠、牙髓、髓腔內(nèi)前期牙本質(zhì)以及3 mm根尖并梯度脫礦處理后,所得材料厚度小于1 mm,表面呈多孔狀,牙本質(zhì)小管完全開放(圖1)。

圖1 TDM材料的形態(tài)特征

DPSC的鑒定:免疫熒光染色結(jié)果顯示DPSC中間充質(zhì)干細胞標記蛋白Stro-1、Vimentin呈陽性,上皮來源干細胞標記蛋白CK14呈陰性,均可見藍色圓形或卵圓形細胞核(圖2A、B、C),說明細胞為間充質(zhì)來源,而非上皮來源。DPSC經(jīng)成神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,β-Ⅲ tubulin免疫熒光染色呈陽性(圖2D),經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,茜素紅染色可見紅色礦化的結(jié)節(jié)(圖2E),經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后,油紅O染色可見紅色的脂滴(圖2F);提示DPSC具有多向分化潛能。

A、B、C:分別為Stro-1、Vimentin及CK14蛋白的表達;D、E、F:分別為β-Ⅲ tubulin免疫熒光染色、茜素紅染色、油紅O染色結(jié)果

2.2 TDM誘導(dǎo)后DPSC中成牙相關(guān)蛋白表達的比較見圖3、4,表1。與正常對照組比較,TDM組DSPP、DMP-1、Runx2、ALP蛋白的表達均升高。免疫熒光染色結(jié)果顯示TDM組ALP及DSPP熒光強度較強,與Western blot結(jié)果一致。

圖3 2組DPSC中成牙相關(guān)蛋白ALP和DSPP的表達(免疫熒光染色,×400)

圖4 2組DPSC中成牙相關(guān)蛋白及GSK3β、活化的β-catenin蛋白的表達

表1 2組DPSC中成牙相關(guān)蛋白的表達

2.3 TDM誘導(dǎo)后DPSC中GSK3β磷酸化水平及核內(nèi)活化的β-catenin蛋白表達的比較見圖4、圖5和表2。與正常對照組比較,TDM組核內(nèi)活化的β-catenin蛋白表達量及GSK3β磷酸化水平均較高。免疫熒光染色結(jié)果顯示TDM組活化的β-catenin在細胞核呈陽性表達,且熒光強度較強(圖6),與Western blot結(jié)果一致。

圖5 2組DPSC中活化的β-catenin蛋白的表達(Western blot結(jié)果)

表2 2組GSK3β磷酸化水平及核內(nèi)活化的β-catenin蛋白表達的比較

3 討論

牙髓失活是導(dǎo)致牙齒缺失的主要原因之一。從理論上來說,保護牙齒最好的辦法就是保護牙髓;TDM浸提液因其特定的生物學(xué)特性有望成為一種新型的蓋髓材料用于牙髓保護[9]。本研究結(jié)果顯示TDM浸提液能明顯促進DPSC成牙相關(guān)蛋白DSPP、DMP-1、Runx2、ALP的表達,提示TDM浸提液具有較好的誘導(dǎo)牙源性干細胞分化的潛力。此外,研究[10-12]發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路對于調(diào)節(jié)DPSC的增殖分化至關(guān)重要。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路激活,即Wnt與膜表面受體蛋白——人卷曲同源物蛋白(FZD)結(jié)合后,激活胞內(nèi)蓬亂蛋白Dsh同源物蛋白(DVL)。DVL通過抑制GSK3β等蛋白形成的β-catenin降解復(fù)合物的降解活性,穩(wěn)定細胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-catenin蛋白,促進β-catenin積累進而入核;入核后,它可以與淋巴增強因子和T細胞因子(LEF/TCF)結(jié)合發(fā)揮作用[13-15]。本研究結(jié)果顯示,TDM浸提液可顯著增加GSK3β Ser9位點的磷酸化水平,抑制GSK3β的活性,進而使活化的 β-catenin表達增多,說明TDM浸提液能夠激活經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑,進而影響牙齒發(fā)生和釉質(zhì)形成。

綜上所述,TDM浸提液可能通過介導(dǎo)GSK3β的磷酸化進而影響Wnt/β-catenin通路,從而促進DPSC的成牙分化,有望成為治療牙齒缺損的新型藥物。本研究存在有一定局限性,我們只研究了TDM浸提液對牙源性干細胞的作用,對非牙源性細胞的效果尚未證實,同時應(yīng)在動物模型上進一步驗證。