ctDNA的研究現(xiàn)狀及在肺癌診療中的研究進展

夏瑤 司毛燕 朱慎鈺 饒鼎宇 謝春發(fā) 李樹林 唐志賢

【摘要】 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在大多數(shù)國家均居首位。肺癌的早期診斷、早期治療是提高治愈率的關(guān)鍵。新興的液體活檢技術(shù)中，血液中循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）的檢測在肺癌的研究與應(yīng)用已進行了廣泛研究。近年來ctDNA液體活檢技術(shù)的高速發(fā)展給肺癌的診斷及治療帶來了新的突破，有望成為肺癌診斷、指導(dǎo)治療及監(jiān)測復(fù)發(fā)等多方面的新途徑。本文對目前ctDNA的研究進行了總結(jié)，并討論ctDNA檢測在肺癌篩查、治療及復(fù)發(fā)等方面的應(yīng)用前景。

【關(guān)鍵詞】 ctDNA 肺癌 液體活檢 生物標(biāo)志物

[Abstract] Lung cancer is one of the most common malignant tumors， and its morbidity and mortality rank first in most countries. Early diagnosis and early treatment of lung cancer are the keys to improving the cure rate. Among the emerging liquid biopsy techniques， the detection and application of circulating tumor DNA （ctDNA） in blood has been extensively studied in the research and application of lung cancer. In recent years， the rapid development of ctDNA liquid biopsy technology has brought new breakthroughs in the diagnosis and treatment of lung cancer， and is expected to become a new way of lung cancer diagnosis， treatment guidance， and monitoring of recurrence. This article summarizes the current research on ctDNA， and discusses the application prospect of ctDNA detection in lung cancer screening， treatment and recurrence.

[Key words] ctDNA Lung cancer Liquid biopsy Biomarkers

First-author's address： Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.14.043

肺癌是最常見的惡性腫瘤，同時也是癌癥死亡的主要原因，2018年預(yù)計新增肺癌病例210萬例，死亡180萬例，占癌癥死亡人數(shù)的近1/5[1]。肺癌大致分為非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung lancer，SCLC）兩大類，其中非小細(xì)胞肺癌占80%～85%[2]。我國肺癌的發(fā)病率也呈整體上升趨勢，是近30年來發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤。由于肺癌在早期沒有明顯的臨床癥狀，大多數(shù)患者就診時已是中晚期，僅有少數(shù)患者有機會接受手術(shù)治療。雖然肺癌的5年生存率極低，僅有9%～20%，但早期肺癌5年生存率可高達70%左右[3-4]。因此，肺癌的早診早治尤為重要。當(dāng)前胸部CT、穿刺活檢等診斷方法對患者的健康會有影響且自身具有一定的局限性。應(yīng)用在肺癌臨床檢測的傳統(tǒng)分子生物學(xué)標(biāo)志物有數(shù)十種，其中CEA、CA19-9、NSE、CYFRA21-1和CA125通常用于臨床上肺癌的輔助診斷及療效的評估。但是其敏感度和特異度均比較低[5]。

液體活檢是一種利用DNA檢測技術(shù)獲取血液中腫瘤有關(guān)線索的無創(chuàng)檢測技術(shù)。由于循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是從血漿中提取的，因此這種所謂的液體活檢是一種非侵入性的體外診斷技術(shù)，為難以接近的實體瘤精準(zhǔn)監(jiān)測提供了可能性。如今ctDNA已成為一類新的腫瘤標(biāo)志物，大量研究充分證明ctDNA在肺癌的應(yīng)用上是一個極具前景的生物標(biāo)記物。

1 ctDNA的本質(zhì)及檢測方法

1.1 ctDNA的本質(zhì) ctDNA是短的DNA片段，主要存在于血液中，可提供來自多個腫瘤區(qū)域腫瘤細(xì)胞脫落的生物標(biāo)記物[6]。故ctDNA可定義為腫瘤細(xì)胞脫落進入體循環(huán)的短DNA序列。與其他血液標(biāo)記物相比，ctDNA水平反映了活動性腫瘤細(xì)胞死亡的速度，是一種更好的生物標(biāo)記物，可以“實時”反映治療后的腫瘤負(fù)擔(dān)，有更好的即時監(jiān)測能力[7]。ctDNA檢測為明確患者的基因組及相關(guān)信息提供了新途徑。血漿中的ctDNA作為一種高度特異性的非侵入性生物標(biāo)志物，它也正在成為癌癥早期篩查[8]、預(yù)測治療反應(yīng)及評估復(fù)發(fā)的標(biāo)志物[9-10]。

1.2 ctDNA的檢測方法 當(dāng)前對ctDNA進行定量或定性的檢測手段很多。數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）于1999年推出，涉及稀釋DNA，可以擴增單個模板分子并單獨測序，從而檢測稀有突變體[11]。該技術(shù)后來被修改，稱為BEAMing法，它利用磁珠結(jié)合單個DNA分子，這些DNA分子已在PCR成分的微乳液中被擴增[12]。新一代測序和大規(guī)模并行測序進一步改進了ctDNA樣本中的突變檢測[13]。還有一種稱為CAPP-Seq（通過深度測序的癌癥個性化分析）的技術(shù)已運用來進行ctDNA檢測[14]。此外，全外顯子組測序（韋斯）已經(jīng)應(yīng)用于ctDNA檢測[15]?？上驳氖且延辛_氏血液ctDNA突變高通量測序試劑盒獲批用于ⅢB～Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌輔助診斷?？偟膩碚f，目前ctDNA的檢測方法有流式細(xì)胞術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、二代測序（next-generation sequencing，NGS）等[16-17]。如今，隨著基于納米技術(shù)的生物傳感器等新技術(shù)不斷出現(xiàn)和應(yīng)用，為肺癌ctDNA檢測帶來了新啟發(fā)和方向[18]。

2 ctDNA檢測的影響因素

ctDNA檢測受多種因素的影響，Abbosh等[19]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA檢測與組織學(xué)亞型相關(guān)：97%肺鱗狀細(xì)胞癌、19%肺腺癌及71%其他非小細(xì)胞癌亞型患者ctDN檢測為陽性。在94%的Ⅰ期肺鱗狀細(xì)胞癌中檢測到ctDNA，但在Ⅰ期肺腺癌中僅檢測到13%。該研究還表明早期非小細(xì)胞肺癌用ctDNA 檢測進行篩查，其敏感度會受到腫瘤大小的限制，即腫瘤大小會影響ctDNA檢測結(jié)果。

此外肺癌的不同分期，是否發(fā)生轉(zhuǎn)移或壞死均直接影響血液中ctDNA的濃度。ctDNA的檢測能力還因癌癥類型及分期而異，其中小細(xì)胞癌（91.1%）、前列腺癌（87.9%）、子宮頸癌（77.6%）和肝癌（77.1%）。與其他癌癥類型相比，肺癌顯示出更高的敏感度。甲狀腺癌（41.8%）和腎癌（56.4%）的ctDNA檢測率更低。在分期上，Ⅰ～Ⅲ期癌癥中檢測ctDNA的敏感度>60%，在Ⅳ期疾病中，除腎癌和黑色素瘤外，大多數(shù)癌癥類型的樣本中檢測到的ctDNA均超過70%[20]。綜上，ctDNA檢測受癌癥類型、組織學(xué)亞型、分期、解剖位置和代謝活性及是否發(fā)生壞死和轉(zhuǎn)移等多因素影響[21]。除腫瘤本身以外的其他因素也會產(chǎn)生影響，如，檢測方法、檢測面板、檢測敏感度、患者性別及年齡等因素也會影響到ctDNA檢測結(jié)果。此外，可檢測的ctDNA水平不僅受腫瘤負(fù)荷的影響，還受腫瘤基因型的影響[22-23]。這些影響因素的發(fā)現(xiàn)對ctDNA檢測應(yīng)用于肺癌具有重要意義。

3 ctDNA檢測在肺癌診療中的應(yīng)用

3.1 ctDNA檢測與腫瘤篩查 由于腫瘤細(xì)胞將自己的DNA釋放到血漿中，因此ctDNA中突變或其他基因組改變的證據(jù)存在于血液中。所以通過“ctDNA液體活檢”可以提供一種標(biāo)志檢測腫瘤的存在。正是這種“證據(jù)”的存在才能通過ctDNA檢測對肺癌進行篩查和早期發(fā)現(xiàn)。與目前最流行的輔助診斷方法相比，現(xiàn)有蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的應(yīng)用（例如癌抗原125、甲胎蛋白、癌胚抗原和癌抗原19-9等）通常僅限于一種或幾種癌癥類型，且特異度及敏感度較差[5，24]。

雖然ctDNA檢測對局部或區(qū)域疾病的敏感度為57.9%[25]。盡管這不是特別理想，但已遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常見蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的敏感度。ctDNA在健康對照個體中的特異度大于95%[20]，也進一步證實使用ctDNA檢測進行肺癌篩查和早期檢測的可行性。Bettegowda等[26]通過比較54例胃癌患者和59例年齡相匹配的健康者血漿中ctDNA的信息發(fā)現(xiàn)患者組血漿ctDNA平均水平比對照組高2.4倍，同樣表明ctDNA水平可用于癌癥篩查。雖然在早期肺癌中ctDNA的檢測有一定的局限性，但ctDNA分析技術(shù)的快速發(fā)展暗示了該領(lǐng)域很快能發(fā)展出用更低的閾值以更高的準(zhǔn)確性檢測ctDNA的能力。

3.2 ctDNA檢測與腫瘤治療 肺癌和大多數(shù)實體癌一樣，評估治療反應(yīng)主要依賴于放射學(xué)，因此會受到宏觀疾病成像分辨率的限制，尤其是對早期實體癌。且放射學(xué)不具有識別分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD）和隱匿轉(zhuǎn)移的能力。而這正是ctDNA檢測的優(yōu)勢，包括檢測隱匿性癌癥和追蹤腫瘤特異性突變的潛在能力[27]。

Tie等[28]在一項研究中探索了ctDNA水平的早期變化作為評估治療效果的標(biāo)志物。在此項研究中52例患者中的48例患者無細(xì)胞血漿DNA中檢測到（一致性為92.3%）ctDNA。在大部分未接受過治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中可檢測到ctDNA，一線化療期間ctDNA的早期變化可預(yù)測后期放射學(xué)反應(yīng)。提示了ctDNA可能是一種早期標(biāo)志物，可用于癌癥的治療反應(yīng)。在另外一項關(guān)于結(jié)腸癌的研究中，已證明在Ⅲ期結(jié)腸癌患者中ctDNA是術(shù)后有用的預(yù)后標(biāo)志物，可以指導(dǎo)初始輔助治療?；熀蟮腸tDNA狀態(tài)與手術(shù)后的疾病狀態(tài)有極強的相關(guān)性，能為額外的治療提供信息[29]。因此，對于那些可以檢測ctDNA水平，但在輔助化療后沒有放射學(xué)證據(jù)證明的癌癥患者，可通過行ctDNA檢測提早發(fā)現(xiàn)并治療可以根除的殘留病灶，增加治愈的機會。

在一項關(guān)于乳腺癌的研究中，分析了來自49例患者的208份血液樣本，在完成輔助化療后行長達4年的縱向監(jiān)測[30]。值得注意的是，對于復(fù)發(fā)的患者，在臨床復(fù)發(fā)前2年便能檢測到分子復(fù)發(fā)，敏感度為89%，特異度為100%。明確了個性化ctDNA檢測具有比目前的臨床檢測方法（如CA15-3）更加有效的監(jiān)測能力，能為額外的治療干預(yù)提供一個關(guān)鍵的機會窗口。另一研究表明，在ctDNA分析的指導(dǎo)下，疾病控制率高達85.7%[31]。一項基于單獨定制的面板（ICP）的ctDNA測序的研究中發(fā)現(xiàn)，ctDNA的早期改變可預(yù)測非小細(xì)胞肺癌治療期間的腫瘤負(fù)荷變化，特別是對于腫瘤負(fù)荷下降50%的患者，在放射學(xué)證實的疾病控制之前便能檢測到ctDNA反應(yīng)。此外，ctDNA載量下降幅度與腫瘤縮小呈正相關(guān)這種方法在臨床應(yīng)用時再結(jié)合個性化的管理策略，將提高免疫治療對局部晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床益處[26，32]。

3.3 ctDNA檢測與腫瘤預(yù)后及復(fù)發(fā) ctDNA檢測是一種無創(chuàng)、特異度強、敏感度高的腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)測方法。在一項回顧性研究中，Reinert等[33]在36個月的隨訪期間收集11例結(jié)直腸癌患者的151個系列血漿樣品，已接受了針對其Ⅰ～Ⅳ期疾病的預(yù)期手術(shù)治療。其中6例患者經(jīng)歷了疾病復(fù)發(fā)，5例沒有，期間隨訪檢測和定量ctDNA水平的變化，在非復(fù)發(fā)患者的術(shù)后血漿樣本中未檢測到ctDNA，而在復(fù)發(fā)患者的術(shù)后血漿樣本中均檢測到ctDNA，產(chǎn)生100%的敏感度和100%的特異度。這項研究顯示了ctDNA分析對腫瘤復(fù)發(fā)的高敏感度和強特異度。此研究還發(fā)現(xiàn)，行ctDNA檢測平均比影像學(xué)等常規(guī)隨訪早7、8個月檢測到復(fù)發(fā)。在肺癌中比影像平均提前時間4個月[19]。

在一項關(guān)于乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)前循環(huán)腫瘤DNA的個性化檢測中，18例復(fù)發(fā)患者中16例在臨床或影像學(xué)復(fù)發(fā)前檢測到血漿ctDNA（敏感度89%），預(yù)測轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)的提前期可達2年。在156份血漿樣本中，31例非復(fù)發(fā)患者在任何時間點均未出現(xiàn)ctDNA陽性（特異度為100%）[34]。另一項關(guān)于早期乳腺癌分子復(fù)發(fā)檢測的評估研究中，23例患者中有22例（96%）通過ctDNA檢測到遠(yuǎn)處顱外轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，再次表明ctDNA檢測的高度敏感度[35]。隨著對乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等研究的不斷深入和成果的不斷累積，腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)與ctDNA之間的相關(guān)性證據(jù)也愈加完善[36]。在未來，它極有可能成為個性化和優(yōu)化肺癌患者術(shù)后臨床管理的有效檢測工具。

3.4 ctDNA檢測在SCLC中的應(yīng)用 SCLC占肺癌的15%～20%，其生物學(xué)行為惡劣，易轉(zhuǎn)移，易耐藥，易復(fù)發(fā)及預(yù)后差。早診、早治和早期預(yù)后評估對小細(xì)胞肺癌患者的治療和延長其生存期至關(guān)重要。小細(xì)胞肺癌患者很少在復(fù)發(fā)時進行活檢，獲得的組織不足以進行分子檢測。但由于小細(xì)胞肺癌具有早期血行播散的特點，使得ctDNA測序在小細(xì)胞肺癌中成為一種有前途的基因組分析方法[37]。

Devarakonda等[38]檢測了近600例小細(xì)胞肺癌患者的ctDNA譜，通過ctDNA測試，去識別DNA修復(fù)，MAPK和PI3K途徑及MYC和ARID1A等基因的潛在靶向改變。研究結(jié)果表明，在一個擴展的基因面板上進行ctDNA檢測有可能提高對小細(xì)胞肺癌治療耐藥機制的認(rèn)識，并有助于開發(fā)新的治療策略并指導(dǎo)臨床治療。

ctDNA檢測與傳統(tǒng)通過手術(shù)切除早期小細(xì)胞肺癌樣本、異種移植物或細(xì)胞系進行測序的研究不同，對小細(xì)胞肺癌患者的ctDNA行進一步研究可有助于加速發(fā)現(xiàn)和開發(fā)對抗這種無情疾病的新藥[38-39]。在另一項研究中，采集22例小細(xì)胞肺癌患者血漿樣本中的430個癌癥基因進行了靶向深度測序，分析數(shù)據(jù)表明ctDNA測序有助于描述小細(xì)胞肺癌的基因組格局、亞克隆結(jié)構(gòu)和基因組進化[40]。此外小細(xì)胞肺癌ctDNA檢測與其他癌癥類型相比顯示出極高的敏感度（91.1%）[20]，為小細(xì)胞肺癌的早期篩查、診斷提供新手段。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率在全國范圍內(nèi)位居第一[41]。血漿中的ctDNA是一種高度特異性的非侵入性生物標(biāo)志物，其檢測擁有快捷、方便、微創(chuàng)及能夠?qū)δ[瘤進展實時跟蹤等特點。在檢測方法不斷完善的今天，已開展的大量研究充分證明ctDNA是一個極具前景的生物學(xué)指標(biāo)物。

但也要意識到當(dāng)前ctDNA檢測在肺癌這一癌種的應(yīng)用中還處于前期研究證據(jù)的不斷累積過程中，對ctDNA的研究方法相差甚遠(yuǎn)，研究成果及結(jié)論之間互通困難，整體還處于探索階段。還存在診斷特異性不高、價格昂貴、檢測時間長等方面的不足。但隨著我們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制的認(rèn)識越來越深入，檢測技術(shù)的敏感度和特異度的不斷提高，外周血ctDNA檢測有望成為未來研究和臨床應(yīng)用的重要方向。因此，有理由相信ctDNA作為一種非侵入性腫瘤生物標(biāo)志物，在肺癌早期篩查、治療及復(fù)發(fā)等方面具有良好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2022-10-18） （本文編輯：田婧）