基于葉綠體基因組比較栝樓屬植物的演化

江轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，胡淑寶，楊浩東，郭 晶

（安慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 安慶 246133；皖西南生物多樣性研究與生態(tài)保護(hù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 安慶 246133）

栝樓屬（TrichosanthesL.）屬于葫蘆科（Cucurbitaceae），該科約有80余種，主要分布于馬來(lái)西亞、澳大利亞、中國(guó)、朝鮮和日本等國(guó)家[1]。我國(guó)有41 個(gè)種和8 個(gè)變種，分布于全國(guó)各地，以華南和西南地區(qū)最多[1]。一些栝樓屬植物的各個(gè)組織均含有豐富的氨基酸、核苷及碳水化合物[2]，其果實(shí)不僅可以用作蔬菜食用，還可以作為觀賞植物。栝樓屬植物的某些提取物（主要為槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、亞油酸乙酯和前列腺素）對(duì)治療冠心病、糖尿病和結(jié)腸癌等有一定療效[3-6]。總的來(lái)說(shuō)，栝樓屬植物具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，在園藝中有著廣泛應(yīng)用。過(guò)去的研究主要集中在形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、解剖學(xué)和細(xì)胞學(xué)上，然而這些研究并沒(méi)有明確栝樓屬的種內(nèi)關(guān)系。

葉綠體是綠色植物的重要細(xì)胞器，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和光合作用過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。開花植物的葉綠體基因組大多是環(huán)狀DNA分子，長(zhǎng)度約為（115～165）kb，呈現(xiàn)單親遺傳[7]。在大多數(shù)被子植物中，葉綠體基因組分為四個(gè)部分：小單拷貝（Small single copy，SSC）區(qū)域、大單拷貝（Large single copy，LSC）區(qū)域和兩個(gè)長(zhǎng)度相同的反向重復(fù)區(qū)域（Inverted repeat region，IRs）[8-9]。此外，葉綠體基因組大小的差異主要是由于IRs收縮或擴(kuò)張丟失所致[10-11]。在基因結(jié)構(gòu)和組成方面，葉綠體基因組比核基因組、線粒體基因組更為保守，但在某些被子植物中也能觀察到葉綠體基因組的基因丟失、增加或轉(zhuǎn)移[12-16]。研究證明，葉綠體基因組保持高度保守和非重組性質(zhì)并伴隨著部分結(jié)構(gòu)變異[7]，是推斷不同物種系統(tǒng)發(fā)育位置的寶貴遺傳資源[17-18]。由于新一代測(cè)序方法和平臺(tái)的發(fā)展，準(zhǔn)確地解析葉綠體基因組并獲取基因組信息，在探索重要植物物種的分類與進(jìn)化，以及解決非模式植物的有爭(zhēng)議系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題上有重大的應(yīng)用[19-24]。迄今為止，已有6 500多個(gè)葉綠體基因組測(cè)序信息，為更好地理解陸地植物葉綠體基因組進(jìn)化提供了重要信息[25]。然而，在栝樓屬植物進(jìn)化過(guò)程中，葉綠體基因組是否存在共同的結(jié)構(gòu)變異尚不清楚。

目前NCBI中收錄了11種栝樓屬植物的葉綠體基因完整序列，為了加深對(duì)栝樓屬物種間關(guān)系的理解，本文基于系統(tǒng)的比較基因組學(xué)研究方法，對(duì)11 種栝樓屬植物的葉綠體基因組進(jìn)行了編碼基因組成、區(qū)域邊界擴(kuò)張、重復(fù)序列挖掘、密碼子偏好性、共線性分析和基因組范圍內(nèi)的多態(tài)性位點(diǎn)鑒定等研究?；谌~綠體全基因組序列，本文構(gòu)建了包括11 種栝樓屬植物在內(nèi)的葫蘆科植物系統(tǒng)進(jìn)化樹。研究結(jié)果闡明了栝樓屬植物葉綠體基因組序列特征和進(jìn)化特點(diǎn)，可為栝樓屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化提供優(yōu)良的潛在分子標(biāo)記位點(diǎn)，同時(shí)為其種內(nèi)關(guān)系重建提供了更好的指導(dǎo)，有助于探索其在葫蘆科內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育位置。

1 材料與方法

1.1 栝樓屬植物葉綠體基因組序列

從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.govgenome）下載了11種栝樓屬植物和19種葫蘆科植物的葉綠體基因組序列，具體物種信息包括：短序栝樓（NC-046864.1，Trichosanthes baviensis）、芋葉栝樓（NC-046868.1，Trichosanthes homophylla）、顯脈栝樓（NC-046883.1，Trichosanthes nervifolia）、雙邊栝樓（MT-211650，Trichosanthes rosthornii）、截葉栝樓（NC-046875.1，Trichosanthes truncata）、管花栝樓（NC-046867.1，Trichosanthes tubiflora）、薄葉栝樓（NC-046882.1，Trichosanthes wallichiana）、三尖栝樓（NC-046866.1，Trichosanthes tricuspidata）、全緣栝樓（NC-046884.1，Trichosanthes pilosa）、分裂栝樓（NC-046885.1，Trichosanthes lobata）、栝樓（NC-041088.1，Trichosanthes kirilowii）、油渣果（NC-046857.1，Hodgsonia heteroclita）、冬瓜（NC-056352.1，Benincasa Hispida）、黃瓜（NC-007144.1，Cucumis sativus）、甜瓜（NC-057560.1，Cucumis melo）、野黃瓜（NC-023544.1，Cucumis hystrix）、西瓜（NC-032008.1，Citrullus lanatus）、無(wú)柄苦瓜（NC-046872.1，Momordica sessilifolia）、苦瓜（NC-046807.1，Momordica charantia）、羅漢果（NC-04388.1，Siraitia grosvenorii）、翅子羅漢果（NC-046482.1，Siraitia siamensis）、南瓜（NC-036506.1，Cucurbita moschata）、西葫蘆（NC-038229.1，Cucurbita pepo）、筍瓜（NC-036505.1，Cucurbita maxima）、黑子南瓜（NC-058583.1，Cucurbita ficifolia）、紅瓜（NC-031834.1，Coccinia grangis）、葫蘆（NC-036808.1，Lagenaria siceraria）、廣東絲瓜（NC-050067.1，Luffa acutangula）、小雀瓜（NC-046860.1，Cyclan‐thera pedata）、藏瓜（NC-046859.1，Indofevillea khasiana）。

1.2 葉綠體基因重復(fù)序列分析

葉綠體基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)（正向、回文、互補(bǔ)和反向）使用REPuter（https://bibiserv.cebitec.uni-biele‐feld.de/reputer/）進(jìn)行分析[26]，設(shè)置參數(shù)為：（1）漢明距離=3；（2）最小重復(fù)單元為8 bp；（3）最大重復(fù)序列大小為50 bp。同時(shí)，利用MISA（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misalindex.php）對(duì)11種栝樓的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSRs）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，參數(shù)設(shè)置為：?jiǎn)魏塑账嶙钚≈貜?fù)10次，二核苷酸最小重復(fù)6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最小重復(fù)均為5次，每?jī)蓚€(gè)SSRs最小間隔100 bp。

1.3 密碼子偏好性分析

所有葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用CodonW1.44 軟件并結(jié)合EMBOSS explorer（http://bioin‐formatics.nl/emboss-explorer）網(wǎng)站分析。使用Relative Synonymous Codon Usage（RSCU）來(lái)檢驗(yàn)同義密碼子使用的偏差[27]，RSCU值是特定密碼子被觀察到的次數(shù)與在使用統(tǒng)一同義密碼子時(shí)該密碼子被觀察到次數(shù)的比值。在沒(méi)有任何密碼子使用偏好的情況下，RSCU值為1.00；當(dāng)密碼子使用頻率低于預(yù)期時(shí)，RSCU<1.00；而密碼子使用頻率超過(guò)預(yù)期時(shí)，RSCU>1.00。采用密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon adaptation in‐dex，CAI）、密碼子偏置指數(shù)（Codon bias index，CBI）、最佳密碼子頻率（Frequency of optimal，F(xiàn)OP）、有效密碼子數(shù)（Effective number of codon，ENc）和同義第三位密碼子的GC含量（GC3s）等5個(gè)指標(biāo)來(lái)估計(jì)密碼子的偏置程度。

1.4 邊界擴(kuò)張分析

通過(guò)IRscope（https://irscope.shinyapps.io/Chloroplot/）進(jìn)行葉綠體基因組的邊界擴(kuò)張分析，并采用Adobe Illustrator對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.5 分子標(biāo)記鑒定與基因組比較分析

對(duì)11種栝樓屬植物的葉綠體編碼蛋白進(jìn)行進(jìn)化速率分析。DnaSP6用于計(jì)算非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks），如果Ks=0，則無(wú)法計(jì)算該值。利用GraphPad Prism 9繪制Ka/Ks熱圖，并利用Adobe Illustrator軟件對(duì)圖片進(jìn)行人工調(diào)整。而后，利用DnaSP6分別計(jì)算編碼序列和非編碼序列的Pi值，以及整個(gè)葉綠體基因組、LSC、SSC和IR區(qū)域的Pi值[28]。

1.6 共線性及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)在線工具Cicoletto（http://tools.batinfspire.Org/cirroletto）[29]對(duì)11 種栝樓的葉綠體基因組進(jìn)行共線性分析，參數(shù)設(shè)置E-value值為1e-10。為了重建葫蘆科植物在栝樓屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)30個(gè)物種的葉綠體基因組進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。使用ClustalX2.1軟件對(duì)葉綠體全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，并將比對(duì)完成的序列導(dǎo)入到MEGA11軟件中，利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)樹構(gòu)建[30]，最后采用Adobe Illustrator對(duì)生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行修飾。

2 結(jié)果與分析

2.1 栝樓屬植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)

從NCBI的Genome數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了11種栝樓屬植物完整的葉綠體基因組序列，并對(duì)其葉綠體基因組序列和編碼基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。如表1 所示，11 種栝樓屬植物葉綠體基因組大小介于156 413 bp（T.baviensis）至157 556 bp（T.nervifolia）之間，GC 含量均為37%，都包含有LSC、SSC 和兩個(gè)IR 等四個(gè)典型的連接區(qū)域。LSC 區(qū)長(zhǎng)度范圍為85 828 bp（T.tubiflora）至86 517 bp（T.nervifolia），占總長(zhǎng)度的54.8%～55.2%；SSC 區(qū)長(zhǎng)度范圍為18 202 bp（T.truncata）至18 510 bp（T.tricuspidata），占總長(zhǎng)度的11.6%～11.8%；IR區(qū)長(zhǎng)度范圍為51 820 bp（T.baviensis）至52 574 bp（T.lobata），占總長(zhǎng)度的33.1%～33.5%。同時(shí)，11 種栝樓屬植物包含了數(shù)量不等的功能基因，其中T.rosthornii包含134 個(gè)，T.kirilowii包含130個(gè)，其他9種均包含131個(gè)。這些功能基因分為四類：自身復(fù)制相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因、其他功能基因和一些未知功能基因。除了T.rosthornii有89個(gè)基因參與編碼蛋白質(zhì)外，其他10種均有86個(gè)基因參與該過(guò)程。T.kirilowii相較于其他物種少1個(gè)tRNA，僅有36個(gè)，其他物種均為37個(gè)。此外，11種栝樓具有數(shù)量相等的rRNA。對(duì)于這11種栝樓屬植物的葉綠體基因組序列來(lái)說(shuō)，其中92.5%的序列為編碼序列，7.5%的序列為非編碼序列（表1）。

表1 11種栝樓屬植物的葉綠體基因組

2.2 栝樓屬植物葉綠體基因組的重復(fù)序列分析

重復(fù)序列作為一種重要的標(biāo)記，在系統(tǒng)發(fā)育分析中發(fā)揮著重要作用。SSRs也被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星，由長(zhǎng)度為1-6 bp的核苷酸重復(fù)單元組成，廣泛分布于葉綠體基因組中[31-32]。在11種栝樓屬植物葉綠體全基因組中共發(fā)現(xiàn)3 種SSR：?jiǎn)魏塑眨∕ononucleotide）、雙核苷酸（Dinucleotide）和三核苷酸（Trinucleotide）。然而，僅在管花栝樓（T.tubiflora）的葉綠體基因組中檢測(cè)到三核苷酸重復(fù)，但無(wú)雙核苷酸重復(fù)（圖1A/B）。在11種栝樓屬植物中，單核苷酸重復(fù)的次數(shù)最多且總重復(fù)長(zhǎng)度最長(zhǎng)，而雙核苷酸重復(fù)的次數(shù)及長(zhǎng)度遠(yuǎn)低于單核苷酸重復(fù)（圖1A/B）。已有研究表明，單核苷酸重復(fù)在藜屬植物及石蒜科植物中最為豐富[32]。因此，單核苷酸重復(fù)在遺傳變異中的作用可能比其他SSRs更重要。在11種栝樓屬植物葉綠體全基因組上，分布在LSC區(qū)域的SSRs次數(shù)最多且長(zhǎng)度最長(zhǎng)，而分布于IR區(qū)域的SSRs次數(shù)最少且長(zhǎng)度最短，SSC區(qū)域則居于中間（圖1C/D）。對(duì)于長(zhǎng)重復(fù)序列而言，11種栝樓屬植物的葉綠體基因組序列中均分布有正向重復(fù)序列與回文重復(fù)序列，兩者數(shù)量相當(dāng)（圖1E），但是回文重復(fù)的總長(zhǎng)度遠(yuǎn)長(zhǎng)于正向重復(fù)（圖1F）。此外，T.rosthornii、T.kirilowii和T.tubiflora既不存在反向重復(fù)序列也無(wú)互補(bǔ)重復(fù)序列，而T.tricuspidata與T.lobata無(wú)反向重復(fù)序列，T.homophylla則無(wú)互補(bǔ)重復(fù)序列（圖1E/F）。長(zhǎng)重復(fù)序列多分布在LSC與IR區(qū)域，較少分布在SSC區(qū)域（圖1G/H）。

圖1 11種栝樓屬植物葉綠體全基因組序列的短重復(fù)及長(zhǎng)重復(fù)序列。（A）單堿基、雙堿基、三堿基重復(fù)型頻率，（B）重復(fù)型長(zhǎng)度；（C）LSC、SSC、IR區(qū)域短重復(fù)的頻率，（D）長(zhǎng)度；（E）正向、回文、反向、完全重復(fù)型頻率，（F）長(zhǎng)度；（G）LSC、SSC、IR區(qū)域長(zhǎng)重復(fù)的頻率，（H）長(zhǎng)度

2.3 栝樓屬植物葉綠體基因組的密碼子使用偏移模式分析

目前，普遍認(rèn)為密碼子的使用頻率因基因組、基因和基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)而異。密碼子偏好通常被解釋為基因突變傾向和翻譯優(yōu)化的自然選擇間的平衡[33]。最佳密碼子有助于提高翻譯的效率和準(zhǔn)確性。本文計(jì)算了11種栝樓葉綠體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子使用和相對(duì)同義密碼子使用（RSCU）值，與其他被子植物葉綠體基因組相似，11種栝樓葉綠體基因組的第三位密碼子使用偏向于A和U（RSCU>1）。為了進(jìn)一步研究基因組密碼子使用偏倚的模式，利用CodonW軟件分析了葉綠體基因組蛋白質(zhì)編碼基因的密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）、第三位同義密碼子的GC（GC3s）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子指數(shù)頻率（FOP）及有效密碼子數(shù)（ENc）。研究表明，11 種栝樓屬植物的CAI 值分布在0.154～0.162 間，其中T.baviensis具有最高的CAI 值而T.lobataCAI 值最低；GC3s 分布在34.5%～36.5%間；CBI 值分布在-0.09～-0.12 間；FOP 值分布在0.345～0.360 間；而ENc 值分布在55～56 間（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明了11種栝樓屬植物葉綠體編碼基因的整體密碼子偏好性不強(qiáng)。

圖2 11種栝樓屬植物葉綠體基因組的密碼子使用偏倚統(tǒng)計(jì)（CAI、GC3s、GC、CBI、FOP和ENc指數(shù)）

2.4 栝樓屬植物葉綠體基因組的邊界擴(kuò)張與基因重排

通常認(rèn)為，高等植物葉綠體基因組長(zhǎng)度變化主要來(lái)源于IR和SSC/LSC之間的邊界位置變化[34]?；诖耍疚膶?duì)11種栝樓屬植物的葉綠體LSC、SSC和IR邊界的擴(kuò)張與序列重排進(jìn)行了分析（圖3）。除了T.tubiflora，所有栝樓屬植物葉綠體基因組的IRa/LSC連接都位于rps19基因內(nèi)，導(dǎo)致IRa中存在部分rps19基因。在T.baviensis、T.truncata、T.rosthornii、T.kirilowii、T.nervifolia及T.tricuspidata中，IRa/SSC連接都位于ndhF基因內(nèi)，而SSC/IRb連接位于ycf1基因中。與上述六種栝樓不同，T.wallichiana、T.homophylla、T.pilosa、T.lobata與T.tubiflora中IRa/SSC 連接都位于ycf1基因內(nèi)，而SSC/IRb 連接位于ndhF基因中。以上結(jié)果說(shuō)明，某些栝樓的葉綠體基因組SSC與IR區(qū)域在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生過(guò)一定程度的序列重排。

圖3 11種栝樓屬植物的LSC、SSC和IR區(qū)域邊界分析

2.5 栝樓屬植物葉綠體進(jìn)化的正向選擇分析

在遺傳學(xué)中，以Ka 表示密碼子的非同義替換率，Ks 表示同義替換率，同時(shí)Ka/Ks表示兩者的比值，此參數(shù)可用于判斷是否有選擇壓力作用于蛋白質(zhì)的編碼基因[35]。如圖4所示，11種栝樓屬植物的Ka/Ks 值大多小于或接近1，說(shuō)明這些葉綠體基因經(jīng)歷了中性或純化選擇。此外，T.kirilowii與T.nervifolia、T.tricuspidata之間的Ka/Ks 比值均顯著大于1，說(shuō)明這三個(gè)物種的葉綠體編碼位點(diǎn)處于正向選擇狀態(tài)。

圖4 11種栝樓屬植物葉綠體基因組Ka/Ks比值

2.6 栝樓屬植物葉綠體基因組的差異位點(diǎn)分析

葉綠體基因組的差異位點(diǎn)可以用來(lái)識(shí)別近緣物種，并提供系統(tǒng)發(fā)育信息[36]。利用DnaSP 6 程序計(jì)算了11 種栝樓屬基因組的編碼區(qū)和基因間區(qū)的核苷酸多樣性（Pi）值。從圖5可知，SSC區(qū)域的Pi值及多態(tài)性位點(diǎn)顯著高于LSC及IR區(qū)域，說(shuō)明SSC區(qū)域分化程度較高。從葉綠體基因組中確定了9個(gè)相對(duì)高度變異區(qū)域，其可能正在經(jīng)歷更快速的核苷酸替換。這些區(qū)域包括4 個(gè)基因區(qū)和5 個(gè)基因間區(qū)：rps16、ndhD、ndhE、ycf1、psbI-psbK、trnS-trnG、trnT-trnE、trnT-trnL和trnL-trnA（圖5）。這些區(qū)域可作為系統(tǒng)發(fā)育和植物地理學(xué)研究中潛在的分子標(biāo)記。

圖5 11種栝樓屬植物葉綠體基因組的核苷酸多樣性。（A）葉綠體基因組差異位點(diǎn)；（B）葉綠體基因的多態(tài)位點(diǎn)的數(shù)目

2.7 栝樓屬植物葉綠體基因組的共線性分析

以T.baviensis作為參考基因組，分析了11種栝樓葉綠體基因組共線性，結(jié)果表明T.pilosa與T.bavien‐sis葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相似度最高，達(dá)到99.89%，其次是T.truncata，達(dá)到99.14%。與短序栝樓基因組結(jié)構(gòu)相似度最低的是T.homophylla，為98.04%（圖6）。

圖6 11種栝樓屬植物葉綠體基因組的共線性分析

2.8 栝樓屬植物葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析

本文基于葉綠體全基因組序列，利用MEGA11軟件構(gòu)建了葫蘆科30種植物的系統(tǒng)發(fā)育樹。30種葫蘆科植物分屬于13個(gè)屬，三個(gè)亞族。結(jié)果顯示，所有葫蘆科物種聚集形成了一個(gè)高步長(zhǎng)值的單系群，同屬的植物均聚類。除了絲瓜屬外，其他12個(gè)屬聚成一個(gè)大的分支。11種栝樓被分為兩個(gè)亞支，一支與藏瓜屬親緣關(guān)系較為接近，而另一支與油渣果屬親緣關(guān)系較近（圖7）。

圖7 基于葉綠體基因組構(gòu)建的30種葫蘆科植物的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

栝樓是葫蘆科的一個(gè)重要屬，但其葉綠體基因組還沒(méi)有得到很好的研究。本文首次分析了栝樓屬葉綠體全基因組，研究發(fā)現(xiàn)11種栝樓屬植物的葉綠體基因組都具有典型的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)（即1個(gè)LSC，1個(gè)SSC，2個(gè)IR），包含130～134個(gè)特異基因，其中，86～89個(gè)編碼基因、36～37個(gè)tRNAs和8個(gè)rRNAs。基因組長(zhǎng)度為156 413 bp～157 556 bp，GC含量為37%。與大多數(shù)被子植物相似，11種栝樓屬植物的葉綠體基因組在基因組大小、結(jié)構(gòu)和組織上高度保守，可以為進(jìn)一步分析其內(nèi)部核酸變異提供基礎(chǔ)。已有研究認(rèn)為，重復(fù)序列在葉綠體基因組排列和序列分化中起著重要作用，盡管這樣的重排在被子植物質(zhì)體基因組中比較少見(jiàn)[37]。重復(fù)序列分析表明，栝樓屬植物不論是短序列或長(zhǎng)序列重復(fù)均較長(zhǎng)地分布在LSC區(qū)域，這些重復(fù)基序可用于開發(fā)分子標(biāo)記并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。邊界擴(kuò)展、系統(tǒng)進(jìn)化樹及Ka/Ks 比值分析表明，11種栝樓可以明確分為兩個(gè)分支，第一分支為T.baviensis、T.truncata、T.rosthornii、T.kirilowii、T.nervifolia及T.tricuspidata，第二分支為T.wallichiana、T.homophylla、T.pilosa、T.lobata與T.tubiflora。這兩個(gè)分支的出現(xiàn)可能與葉綠體基因組的SSC及IR區(qū)域的序列重排有關(guān)，這些重排對(duì)群體分化產(chǎn)生重要影響。此外T.kirilowii、T.nervifolia及T.tricuspidata三者的分化可能與環(huán)境的正選擇導(dǎo)致的群體分化有關(guān)。而對(duì)栝樓屬的基因組共線性分析表明，某些進(jìn)化上關(guān)系較遠(yuǎn)的物種在基因結(jié)構(gòu)上卻較為接近，如T.baviensis與T.pilosa。核苷酸分析結(jié)果顯示，栝樓屬葉綠體基因組中的SSC區(qū)域核苷酸多樣性最高，其中典型基因有ndhD、ndhE及ycf1，這些位點(diǎn)可用于編碼栝樓屬特異的DNA條碼。ndhD、ndhE均屬于NAD(P)H脫氫酶復(fù)合體成員，該復(fù)合體對(duì)維持非生物脅迫下的植物生長(zhǎng)及對(duì)光環(huán)境的適應(yīng)有非常重要的作用[38]?；谌蚪M，栝樓屬與絲瓜屬、油渣果屬親緣關(guān)系較近，而基于葉綠體全基因組，栝樓屬則與藏瓜屬的親緣關(guān)系較近，這可能是由于葫蘆科物種多發(fā)生基因組的加倍行為引起[39]。

4 結(jié)論

11種栝樓的葉綠體基因組在大小、結(jié)構(gòu)、基因組成及GC含量上均較為保守，同時(shí)在種內(nèi)曾經(jīng)發(fā)生過(guò)SSC與IR區(qū)域內(nèi)的序列重排。密碼子偏倚分析表明栝樓屬葉綠體編碼基因的密碼子偏性不強(qiáng)，而11種栝樓中有三種存在正向選擇，這些選擇可能導(dǎo)致栝樓的群體分化。序列重排及環(huán)境的正選擇將11種栝樓分為兩個(gè)分支，并且T.nervifolia和T.tricuspidata很可能由T.kirilowii演化而來(lái)。栝樓屬葉綠體基因組的SSC區(qū)域存在數(shù)量較多的核酸變異位點(diǎn)，其可作為栝樓屬植物物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的潛在標(biāo)記。