杏鮑菇液體發(fā)酵沛縣黃皮牛蒡?qū)Χ嗵呛坑绊懙难芯?/h1>
2023-06-21 06:06:38董玉瑋朱曹凱顧鑫玥馮星星胡傳銀秦琰琪
農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年9期
董玉瑋，朱曹凱，顧鑫玥，李 超，馮星星，胡傳銀，秦琰琪
（1. 徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018；2. 徐州天馬敬安食品有限公司，江蘇徐州 221747；3. 沛縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 徐州 221600）
牛蒡是菊科兩年生植物，也被人們稱為蒡翁菜，主要種植于北歐和中國(guó)浙江、河北以北、江蘇江北及東北等地區(qū)[1]。牛蒡中含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、纖維素、糖類，以及各種氨基酸和維生素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。同時(shí)，牛蒡根還具有較好的藥用功能，能降血脂、降血壓、清理腸道、增強(qiáng)人體調(diào)節(jié)免疫能力[3-4]。
杏鮑菇（Pleurotus abalone） 又名刺芹側(cè)耳，屬無隔擔(dān)子菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬。杏鮑菇因其口感和鮑魚類似，且有著杏仁的香味而得名[5]。杏鮑菇多分布于歐洲、非洲的北部和亞洲的部分地區(qū)。杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)組分豐富，含有人體所需的微量元素，其營(yíng)養(yǎng)成分主要有糖類、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素等，能有效調(diào)節(jié)機(jī)體代謝水平，改善機(jī)體性能[6]。其中，杏鮑菇多糖作為杏鮑菇的主要提取物之一，可以有效提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均衡吸收，對(duì)病菌、腫瘤等有較強(qiáng)地抑制作用[7-8]。
液體發(fā)酵技術(shù)作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組分之一，是利用微生物生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)所需條件簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，使微生物在合適的條件下大量生產(chǎn)、繁殖、代謝，生產(chǎn)出人們所需求的菌株或代謝中產(chǎn)物的過程[9]。其中，食用菌液體發(fā)酵與固體發(fā)酵相比，產(chǎn)量較高、成本更低、發(fā)酵周期短，具有更高的經(jīng)濟(jì)效益[10]。
牛蒡根中含有大量纖維素，同時(shí)含有蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素，少量的綠原酸、多糖。微生物，尤其是一些藥食真菌，比如營(yíng)養(yǎng)、保健價(jià)值較高的杏鮑菇、靈芝、毛木耳、茶樹菇等，具有分解、利用纖維素的能力，牛蒡中含有的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等也可作為菌種生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)成分，有助于充分利用牛蒡、食用菌等資源。該研究采用牛蒡根作為培養(yǎng)基，以杏鮑菇液體發(fā)酵牛蒡根，提取并檢測(cè)發(fā)酵液中的多糖，探討影響多糖含量的因素，為牛蒡、藥食真菌精深加工提供了技術(shù)支撐，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料、試劑和儀器
1.1.1 試驗(yàn)材料和試劑
沛縣黃皮牛蒡，徐州天馬敬安食品有限公司提供；杏鮑菇菌種，實(shí)驗(yàn)室保存的高活性杏鮑菇菌種。
葡萄糖、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂、濃硫酸、95%乙醇等試劑，南京晚晴化玻儀器有限公司提供。
1.1.2 試驗(yàn)儀器
HBT-DV24-566B 型蒸汽滅菌鍋，華東強(qiáng)劍工業(yè)裝備公司產(chǎn)品；FGY-856YU 型冰箱徐州美的電器產(chǎn)品；DC14962 型電子天平，南通南方六島貿(mào)易有限責(zé)任公司產(chǎn)品；LL.R98.402-H-II 型恒溫培養(yǎng)箱，上海富強(qiáng)儀器制造公司產(chǎn)品；GH-XC-5P 型潔凈紫外工作臺(tái)，無錫純潔設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；F48692型可見分光光度計(jì)，江蘇山岳科技有限公司產(chǎn)品。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 培養(yǎng)基配方
PDA 培養(yǎng)基：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.3%KH2PO4，0.3%酵母膏，0.15%MgSO4，2%瓊脂。
牛蒡液體培養(yǎng)基：1%～5%去皮牛蒡塊，大小0.1～0.2 cm3，1%酵母膏，按比例加水配制，高壓滅菌后備用。
1.2.2 菌種的活化與液體培養(yǎng)
使用PDA 培養(yǎng)基活化杏鮑菇菌種，于27 ℃下恒溫培養(yǎng)6 d。
液體培養(yǎng)：將活化后的杏鮑菇菌株接種到配置好的牛蒡液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
1.2.3 單因素試驗(yàn)
為研究牛蒡液體培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵杏鮑菇菌株的影響，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)單因素，分別為牛蒡含量、溫度、裝液量，主要考查各因素對(duì)杏鮑菇多糖的產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)做3 次，取平均值。
（1） 牛蒡含量。分別向裝有100 mL 牛蒡液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入1%，2%，3%，4%，5%的牛蒡，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，在28 ℃搖床中以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
（2） 溫度。5 個(gè)裝有100 mL 牛蒡液體培養(yǎng)基的三角瓶中，均含有質(zhì)量體積比3%的牛蒡，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，分別放入溫度為24，26，28，30，32 ℃的搖床中，以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
（3） 裝液量。向5 個(gè)三角瓶中分別加入60，80，100，120，140 mL 的質(zhì)量體積比3%的牛蒡液體培養(yǎng)基，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，在溫度為28 ℃的搖床中，以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)后，取最優(yōu)結(jié)果及附近的一共3 組數(shù)據(jù)，使用Design Expert 8.05b 軟件，設(shè)計(jì)方案，并按照軟件給出的方案進(jìn)行試驗(yàn)，得出結(jié)果。
試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)
1.2.5 多糖的提取及測(cè)定[11-12]
（1） 粗多糖的提取方法。將發(fā)酵完成的培養(yǎng)基離心取上清，置于50 ℃的烘箱中濃縮至原體積的1/5，向其中加入5 倍體積的95%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中過夜，次日離心取沉淀，烘干后所得即為杏鮑菇粗多糖。
（2） 粗多糖的純化。將杏鮑菇多糖的粗提物用10 mL 純水溶解，并向其中加入多糖溶液體積1/4～1/3 的Sevag 試劑（氯仿- 正丁醇4∶1 的混合液），將其倒入分液漏斗中，上下振蕩15～20 min 后，靜置分層，倒出下層廢液，將上清液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，取上清液，重復(fù)上述操作，直至沒有蛋白質(zhì)析出，將上清液收集備用。
取一段截流分子量為6 000～8 000 的半透膜袋，置于沸水鍋中煮5 min，用純水將半透膜沖開，封住半透膜一側(cè)，將收集的上清液倒入其中，將另一端也封好，將處理好的透析袋懸掛于裝有蒸餾水的燒杯中，打開磁力攪拌器，每2 h 換一次水，透析1～2 d，最終得到的樣品即為杏鮑菇的精多糖溶液，烘干可得多糖樣品。
（3） 多糖含量的測(cè)定。苯酚硫酸法測(cè)多糖：向多糖樣品中加入100 mL 純水溶解，取2 mL 加于試管中，另取一空試管加入2 mL 蒸餾水，向其中加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，搖勻后靜置5 min，置于100 ℃的水浴鍋中水浴15 min，冷卻至室溫，并于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)量樣品吸光度，并根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖含量。
1.2.6 高效液相色譜法檢測(cè)多糖中單糖組分
稱取適量的凍干多糖樣品，加入濃度為2 mol/L的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，置于120 ℃下水解120 min，用氮吹儀吹干。
向試管中加入5 μL 單糖標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。加入濃度為2 mol/L 的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，與樣品同時(shí)在120 ℃條件下水解120 min，再用空氣泵吹干。向處理后的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的1- 苯基-3- 甲基-5- 吡唑啉酮（PMP） 試劑和0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液各0.5 mL，混勻，置于70 ℃中水浴30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 溶液0.5 mL，混勻。加入氯仿0.5 mL，充分振蕩萃取，置于5 000 r/min 的離心機(jī)中離心5 min去除氯仿層，共萃取3 次。水層（不低于0.4 mL）用0.22 μm 濾膜過濾后，待上機(jī)。
儀器條件：色譜柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L pH 值6.8 磷酸鹽緩沖液（PB），乙腈為82∶18（V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，波長(zhǎng)為245 nm。
1.3 數(shù)據(jù)分析
所有的數(shù)據(jù)都用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S） 來表示，Origin 9.0 軟件繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 不同牛蒡含量對(duì)杏鮑菇多糖質(zhì)量濃度的影響
牛蒡含量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響見圖1。
圖1 牛蒡含量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響
由圖1 可知，當(dāng)牛蒡含量為1%～5%時(shí)，發(fā)酵液多糖含量會(huì)隨著牛蒡含量的變化而變化，多糖質(zhì)量濃度先逐漸升高，在牛蒡含量為3%時(shí)，達(dá)到最大值，為2.38 mg/mL，隨著牛蒡含量的再度升高，多糖質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
2.1.2 裝液量的確定
裝液量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響見圖2。由圖2 可知，當(dāng)裝液量體積為60～140 mL 時(shí)，發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度會(huì)隨著裝液量的變化而變化，多糖含量先逐漸升高，在裝液量為100 mL 時(shí)，達(dá)到最大值，為2.41 mg/mL ，隨著裝液量的再度升高，多糖質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
圖2 裝液量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響
2.1.3 溫度的確定
溫度對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響見圖3。
圖3 溫度對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響
由圖3 可知，當(dāng)溫度為24～32 ℃時(shí)，發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度隨溫度的變化而變化，多糖質(zhì)量濃度先逐漸升高，在溫度為28 ℃時(shí)，達(dá)到最大值，為2.39 mg/mL，隨著溫度的再度升高，多糖質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
2.2 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及通過具體試驗(yàn)得到的多糖含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值。
設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。
表2 設(shè)計(jì)方案和結(jié)果
2.3 回歸方程的建立和方差分析
對(duì)上表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，可得三因素裝液量（X1）、溫度（X2）、牛蒡含量（X3） 的回歸方程：
試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表3，杏鮑菇多糖質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)模型的可靠性分析見表4。
表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析
表4 杏鮑菇多糖質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)模型的可靠性分析
由表3、表4 可知，該模型的p 值＜0.01，所以該模型具有極顯著影響；此外，該模型的失擬向p值＞0.05，不具備顯著影響。X1和X3的p 值＜0.01，反映出X3和X1對(duì)多糖質(zhì)量濃度的變化有著極顯著影響，而X2的p 值＜0.05，說明溫度水平變化對(duì)多糖質(zhì)量濃度有著顯著影響；最后，X2X3的p 值＞0.05，表明溫度和牛蒡含量交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響不顯著，X1X3的p 值＜0.01，表明裝液量和牛蒡含量的交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響極顯著，而X1X2的p 值＞0.05，說明裝液量和溫度進(jìn)行交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度無顯著影響。模型決定系數(shù)R2為0.999 1，經(jīng)校正后的決定系數(shù)R2Adj為0.998 0，由此可得知該模型的擬合程度較好，具有可靠性。
2.4 因素間的交互作用分析
使裝液量、溫度、牛蒡含量3 個(gè)影響因素中的一個(gè)保持不變，在此基礎(chǔ)上分析其他2 個(gè)因素的交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響，得到的等高線及響應(yīng)面圖。
裝液量、溫度和牛蒡含量?jī)蓛芍g交互作用對(duì)多糖含量影響的等高線圖和三維圖見圖4。
圖4 裝液量、溫度和牛蒡含量?jī)蓛芍g交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響的等高線圖和三維圖
由圖4 可知，等高線與圓形越接近，說明對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響越小，由此可以得知，這3 個(gè)因素兩兩之間交互作用中，裝液量和牛蒡含量的交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響最大。
除此以外，3 個(gè)曲線都呈拋物線形，單個(gè)因素影響程度的大小可以通過響應(yīng)面圖中曲線的變化幅度來判斷，曲線越陡，說明這個(gè)因素影響程度越大，由此可以得知3 個(gè)因素的影響程度大小依次為裝液量＞牛蒡含量＞溫度，因此試驗(yàn)的優(yōu)化方法具有可行性。
2.5 優(yōu)化后的最佳條件及結(jié)果
通過對(duì)上面數(shù)據(jù)的分析，可以對(duì)牛蒡杏鮑菇液體發(fā)酵工藝條件進(jìn)行改良，得到最佳提取工藝為牛蒡含量占總裝液量3%，裝液量為100 mL，溫度為28 ℃時(shí)，得到的多糖質(zhì)量濃度最大為2.39 mg/mL。
2.6 多糖中單糖組分的檢測(cè)
杏鮑菇多糖單糖組分含量結(jié)果見表5。
表5 杏鮑菇多糖單糖組分含量結(jié)果/mg·kg-1
結(jié)果表明，發(fā)酵液多糖單糖組分包含甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。譚霄等人[13]采用高效液相色譜- 蒸發(fā)光散射法分析測(cè)定杏鮑菇多糖的單糖組成，發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多糖中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，與此次測(cè)定相比多了核糖、鼠李糖和巖藻糖。發(fā)酵液多糖單糖組分含量中，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖含量較高，其中葡萄糖的含量最高。薛令坤等人[14]研究杏鮑菇多糖發(fā)現(xiàn)，葡萄糖含量較甘露糖、半乳糖含量高，與該研究結(jié)果基本一致。
3 結(jié)論
（1） 通過單因素試驗(yàn)，可以得出當(dāng)培養(yǎng)基中牛蒡含量達(dá)3%時(shí)，多糖質(zhì)量濃度最高為2.38 mg/mL，裝液量為100 mL 時(shí)，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為2.41 mg/mL，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為2.39 mg/mL。
（2） 采用響應(yīng)面方法優(yōu)化后，得出最佳方案為牛蒡含量3%，裝液量為100 mL，溫度為28 ℃時(shí)，預(yù)測(cè)得到的最大多糖質(zhì)量濃度為2.39 mg/mL。
（3） 通過對(duì)發(fā)酵液的粗多糖進(jìn)行純化后，用高效液相色譜法測(cè)定其單糖組分，得到發(fā)酵液多糖中主要有葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等多種單糖，其中葡萄糖含量最高。
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葡萄糖、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、瓊脂、濃硫酸、95%乙醇等試劑，南京晚晴化玻儀器有限公司提供。
1.1.2 試驗(yàn)儀器
HBT-DV24-566B 型蒸汽滅菌鍋，華東強(qiáng)劍工業(yè)裝備公司產(chǎn)品；FGY-856YU 型冰箱徐州美的電器產(chǎn)品；DC14962 型電子天平，南通南方六島貿(mào)易有限責(zé)任公司產(chǎn)品；LL.R98.402-H-II 型恒溫培養(yǎng)箱，上海富強(qiáng)儀器制造公司產(chǎn)品；GH-XC-5P 型潔凈紫外工作臺(tái)，無錫純潔設(shè)備有限責(zé)任公司產(chǎn)品；F48692型可見分光光度計(jì)，江蘇山岳科技有限公司產(chǎn)品。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 培養(yǎng)基配方
PDA 培養(yǎng)基：20%馬鈴薯，2%葡萄糖，0.3%KH2PO4，0.3%酵母膏，0.15%MgSO4，2%瓊脂。
牛蒡液體培養(yǎng)基：1%～5%去皮牛蒡塊，大小0.1～0.2 cm3，1%酵母膏，按比例加水配制，高壓滅菌后備用。
1.2.2 菌種的活化與液體培養(yǎng)
使用PDA 培養(yǎng)基活化杏鮑菇菌種，于27 ℃下恒溫培養(yǎng)6 d。
液體培養(yǎng)：將活化后的杏鮑菇菌株接種到配置好的牛蒡液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃條件下，以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
1.2.3 單因素試驗(yàn)
為研究牛蒡液體培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵杏鮑菇菌株的影響，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)3 個(gè)單因素，分別為牛蒡含量、溫度、裝液量，主要考查各因素對(duì)杏鮑菇多糖的產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)做3 次，取平均值。
（1） 牛蒡含量。分別向裝有100 mL 牛蒡液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入1%，2%，3%，4%，5%的牛蒡，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，在28 ℃搖床中以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
（2） 溫度。5 個(gè)裝有100 mL 牛蒡液體培養(yǎng)基的三角瓶中，均含有質(zhì)量體積比3%的牛蒡，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，分別放入溫度為24，26，28，30，32 ℃的搖床中，以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
（3） 裝液量。向5 個(gè)三角瓶中分別加入60，80，100，120，140 mL 的質(zhì)量體積比3%的牛蒡液體培養(yǎng)基，高壓滅菌20 min 后，無菌接種，在溫度為28 ℃的搖床中，以轉(zhuǎn)速120 r/min 培養(yǎng)5～7 d。
1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)
在單因素試驗(yàn)后，取最優(yōu)結(jié)果及附近的一共3 組數(shù)據(jù)，使用Design Expert 8.05b 軟件，設(shè)計(jì)方案，并按照軟件給出的方案進(jìn)行試驗(yàn)，得出結(jié)果。
試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表1。
表1 試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)
1.2.5 多糖的提取及測(cè)定[11-12]
（1） 粗多糖的提取方法。將發(fā)酵完成的培養(yǎng)基離心取上清，置于50 ℃的烘箱中濃縮至原體積的1/5，向其中加入5 倍體積的95%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中過夜，次日離心取沉淀，烘干后所得即為杏鮑菇粗多糖。
（2） 粗多糖的純化。將杏鮑菇多糖的粗提物用10 mL 純水溶解，并向其中加入多糖溶液體積1/4～1/3 的Sevag 試劑（氯仿- 正丁醇4∶1 的混合液），將其倒入分液漏斗中，上下振蕩15～20 min 后，靜置分層，倒出下層廢液，將上清液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min，取上清液，重復(fù)上述操作，直至沒有蛋白質(zhì)析出，將上清液收集備用。
取一段截流分子量為6 000～8 000 的半透膜袋，置于沸水鍋中煮5 min，用純水將半透膜沖開，封住半透膜一側(cè)，將收集的上清液倒入其中，將另一端也封好，將處理好的透析袋懸掛于裝有蒸餾水的燒杯中，打開磁力攪拌器，每2 h 換一次水，透析1～2 d，最終得到的樣品即為杏鮑菇的精多糖溶液，烘干可得多糖樣品。
（3） 多糖含量的測(cè)定。苯酚硫酸法測(cè)多糖：向多糖樣品中加入100 mL 純水溶解，取2 mL 加于試管中，另取一空試管加入2 mL 蒸餾水，向其中加入1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液和5 mL 濃硫酸，搖勻后靜置5 min，置于100 ℃的水浴鍋中水浴15 min，冷卻至室溫，并于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)量樣品吸光度，并根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖含量。
1.2.6 高效液相色譜法檢測(cè)多糖中單糖組分
稱取適量的凍干多糖樣品，加入濃度為2 mol/L的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，置于120 ℃下水解120 min，用氮吹儀吹干。
向試管中加入5 μL 單糖標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。加入濃度為2 mol/L 的三氯乙酸（TFA） 溶液0.5 mL，與樣品同時(shí)在120 ℃條件下水解120 min，再用空氣泵吹干。向處理后的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的1- 苯基-3- 甲基-5- 吡唑啉酮（PMP） 試劑和0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液各0.5 mL，混勻，置于70 ℃中水浴30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 溶液0.5 mL，混勻。加入氯仿0.5 mL，充分振蕩萃取，置于5 000 r/min 的離心機(jī)中離心5 min去除氯仿層，共萃取3 次。水層（不低于0.4 mL）用0.22 μm 濾膜過濾后，待上機(jī)。
儀器條件：色譜柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.1 mol/L pH 值6.8 磷酸鹽緩沖液（PB），乙腈為82∶18（V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，波長(zhǎng)為245 nm。
1.3 數(shù)據(jù)分析
所有的數(shù)據(jù)都用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S） 來表示，Origin 9.0 軟件繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 單因素試驗(yàn)
2.1.1 不同牛蒡含量對(duì)杏鮑菇多糖質(zhì)量濃度的影響
牛蒡含量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響見圖1。
圖1 牛蒡含量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響
由圖1 可知，當(dāng)牛蒡含量為1%～5%時(shí)，發(fā)酵液多糖含量會(huì)隨著牛蒡含量的變化而變化，多糖質(zhì)量濃度先逐漸升高，在牛蒡含量為3%時(shí)，達(dá)到最大值，為2.38 mg/mL，隨著牛蒡含量的再度升高，多糖質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
2.1.2 裝液量的確定
裝液量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響見圖2。由圖2 可知，當(dāng)裝液量體積為60～140 mL 時(shí)，發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度會(huì)隨著裝液量的變化而變化，多糖含量先逐漸升高，在裝液量為100 mL 時(shí)，達(dá)到最大值，為2.41 mg/mL ，隨著裝液量的再度升高，多糖質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
圖2 裝液量對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響
2.1.3 溫度的確定
溫度對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響見圖3。
圖3 溫度對(duì)發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度的影響
由圖3 可知，當(dāng)溫度為24～32 ℃時(shí)，發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度隨溫度的變化而變化，多糖質(zhì)量濃度先逐漸升高，在溫度為28 ℃時(shí)，達(dá)到最大值，為2.39 mg/mL，隨著溫度的再度升高，多糖質(zhì)量濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。
2.2 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及通過具體試驗(yàn)得到的多糖含量的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值。
設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表2。
表2 設(shè)計(jì)方案和結(jié)果
2.3 回歸方程的建立和方差分析
對(duì)上表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，可得三因素裝液量（X1）、溫度（X2）、牛蒡含量（X3） 的回歸方程：
試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表3，杏鮑菇多糖質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)模型的可靠性分析見表4。
表3 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析
表4 杏鮑菇多糖質(zhì)量濃度預(yù)測(cè)模型的可靠性分析
由表3、表4 可知，該模型的p 值＜0.01，所以該模型具有極顯著影響；此外，該模型的失擬向p值＞0.05，不具備顯著影響。X1和X3的p 值＜0.01，反映出X3和X1對(duì)多糖質(zhì)量濃度的變化有著極顯著影響，而X2的p 值＜0.05，說明溫度水平變化對(duì)多糖質(zhì)量濃度有著顯著影響；最后，X2X3的p 值＞0.05，表明溫度和牛蒡含量交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響不顯著，X1X3的p 值＜0.01，表明裝液量和牛蒡含量的交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響極顯著，而X1X2的p 值＞0.05，說明裝液量和溫度進(jìn)行交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度無顯著影響。模型決定系數(shù)R2為0.999 1，經(jīng)校正后的決定系數(shù)R2Adj為0.998 0，由此可得知該模型的擬合程度較好，具有可靠性。
2.4 因素間的交互作用分析
使裝液量、溫度、牛蒡含量3 個(gè)影響因素中的一個(gè)保持不變，在此基礎(chǔ)上分析其他2 個(gè)因素的交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響，得到的等高線及響應(yīng)面圖。
裝液量、溫度和牛蒡含量?jī)蓛芍g交互作用對(duì)多糖含量影響的等高線圖和三維圖見圖4。
圖4 裝液量、溫度和牛蒡含量?jī)蓛芍g交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響的等高線圖和三維圖
由圖4 可知，等高線與圓形越接近，說明對(duì)多糖質(zhì)量濃度的影響越小，由此可以得知，這3 個(gè)因素兩兩之間交互作用中，裝液量和牛蒡含量的交互作用對(duì)多糖質(zhì)量濃度影響最大。
除此以外，3 個(gè)曲線都呈拋物線形，單個(gè)因素影響程度的大小可以通過響應(yīng)面圖中曲線的變化幅度來判斷，曲線越陡，說明這個(gè)因素影響程度越大，由此可以得知3 個(gè)因素的影響程度大小依次為裝液量＞牛蒡含量＞溫度，因此試驗(yàn)的優(yōu)化方法具有可行性。
2.5 優(yōu)化后的最佳條件及結(jié)果
通過對(duì)上面數(shù)據(jù)的分析，可以對(duì)牛蒡杏鮑菇液體發(fā)酵工藝條件進(jìn)行改良，得到最佳提取工藝為牛蒡含量占總裝液量3%，裝液量為100 mL，溫度為28 ℃時(shí)，得到的多糖質(zhì)量濃度最大為2.39 mg/mL。
2.6 多糖中單糖組分的檢測(cè)
杏鮑菇多糖單糖組分含量結(jié)果見表5。
表5 杏鮑菇多糖單糖組分含量結(jié)果/mg·kg-1
結(jié)果表明，發(fā)酵液多糖單糖組分包含甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。譚霄等人[13]采用高效液相色譜- 蒸發(fā)光散射法分析測(cè)定杏鮑菇多糖的單糖組成，發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多糖中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，與此次測(cè)定相比多了核糖、鼠李糖和巖藻糖。發(fā)酵液多糖單糖組分含量中，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖含量較高，其中葡萄糖的含量最高。薛令坤等人[14]研究杏鮑菇多糖發(fā)現(xiàn)，葡萄糖含量較甘露糖、半乳糖含量高，與該研究結(jié)果基本一致。
3 結(jié)論
（1） 通過單因素試驗(yàn)，可以得出當(dāng)培養(yǎng)基中牛蒡含量達(dá)3%時(shí)，多糖質(zhì)量濃度最高為2.38 mg/mL，裝液量為100 mL 時(shí)，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為2.41 mg/mL，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，多糖質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為2.39 mg/mL。
（2） 采用響應(yīng)面方法優(yōu)化后，得出最佳方案為牛蒡含量3%，裝液量為100 mL，溫度為28 ℃時(shí)，預(yù)測(cè)得到的最大多糖質(zhì)量濃度為2.39 mg/mL。
（3） 通過對(duì)發(fā)酵液的粗多糖進(jìn)行純化后，用高效液相色譜法測(cè)定其單糖組分，得到發(fā)酵液多糖中主要有葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸等多種單糖，其中葡萄糖含量最高。
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