TGF-β通過調(diào)控線粒體功能影響肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移

鄭宗耀,陳智鵬,曾觀娣

(暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 腫瘤分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510632)

肺癌仍是我國乃至世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥［1-2］。肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌,其中非小細(xì)胞肺癌占80%～85%。目前已知肺癌發(fā)生主要與致癌基因(如EGFR及KRAS突變、ALK重排)的改變有關(guān)［3］。因此,驅(qū)動(dòng)基因的鑒定與藥物開發(fā)是肺癌研究領(lǐng)域的重點(diǎn)［3］。盡管靶向療法在一些患者身上已取得了良好效果,但是仍有相當(dāng)一部分患者對(duì)靶向藥物響應(yīng)不佳或者產(chǎn)生耐藥。因此,肺癌的發(fā)病及耐藥產(chǎn)生的確切機(jī)理仍需闡明。

肺癌異質(zhì)性是當(dāng)前治療未響應(yīng)及耐藥產(chǎn)生的潛在原因［4-5］。癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs),除了有活躍的端粒酶活性,可能導(dǎo)致基因不穩(wěn)定,發(fā)生癌變;還有無限制且高效的增殖能力,其所在的組織、器官等部位自我更新率越快,腫瘤的發(fā)生率也越高;并且與腫瘤起始、惡性發(fā)展、耐藥有關(guān)［6-7］,是引起實(shí)體瘤異質(zhì)性的重要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可促進(jìn)癌細(xì)胞干性和腫瘤起始能力,因此被認(rèn)為是CSCs的來源之一［8-9］。另外,EMT賦予癌細(xì)胞遷移、侵襲、抗凋亡和耐藥的能力,增加了治療難度［8］。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是EMT主要調(diào)控因子,主要通過經(jīng)典Smad依賴通路和非經(jīng)典Smad通路,激活EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和miRNAs,改變表觀遺傳特征,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞EMT,獲得干性和耐藥能力［10-14］。另外,TGF-β信號(hào)受到Smad7蛋白、mRNA可變剪切和翻譯后修飾等調(diào)控［11］。而且TGF-β在腫瘤中與相關(guān)的免疫微環(huán)境息息相關(guān),影響分化淋巴前體的命運(yùn)和腫瘤內(nèi)多個(gè)白細(xì)胞亞群的活性［15］。由此可見,TGF-β的分化信號(hào)涉及多個(gè)通路的相互協(xié)調(diào)作用。因此,在此過程中仍存在未知的調(diào)控機(jī)制。

線粒體是細(xì)胞物質(zhì)能量代謝和信號(hào)中心,參與調(diào)控包括代謝、增殖、分化等多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程［16］。另外,線粒體形態(tài)和質(zhì)量控制與其不同功能和活性的發(fā)揮有密切聯(lián)系［17］。在癌癥中,生長因子和線粒體基因突變等因素可引起線粒體代謝功能的重編程,而線粒體所反饋的信號(hào)可調(diào)控相應(yīng)的信號(hào)通路,影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄和翻譯,促進(jìn)癌細(xì)胞惡性發(fā)展,并且線粒體控制生物體能量代謝,其功能受損容易導(dǎo)致高乳酸環(huán)境產(chǎn)生,促進(jìn)癌癥進(jìn)展［16,18］。目前線粒體與癌細(xì)胞EMT的關(guān)系尚不清楚,本研究基于TGF-β誘導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞EMT模型,探索線粒體在細(xì)胞接受分化信號(hào)時(shí)的變化和線粒體對(duì)細(xì)胞發(fā)生EMT的影響,并闡明其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

A549細(xì)胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC。HEK293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G、pLKO-tet-puro購自Addgene。pLVX-TetOne-Puro質(zhì)粒來源于Clontech。pGL3、Renilla熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒和pRL-TK海參熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒來源于實(shí)驗(yàn)室自保存。購買的其他試劑包括:兔抗人Smad2和E-cadherin單克隆抗體(CST);鼠抗人vimentin(Santa)和β-actin(Sigma)單克隆抗體;鼠和兔HRP二抗(sigma);Dual-Luciferase? Reporter Assay System(Promega);Trizol(Invitrogen);TGF-β抑制劑SB431542(MCE);PI3K 抑制劑LY294002(MCE);AKT抑制劑MK-2206(MCE);RT試劑盒(愛柏夢);SYBR green核酸染料(Monad);Lipofectamine 3 000(Invitrogene);胎牛血清(Gibco);RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液(Gibco);PBS磷酸鹽緩沖液(Servicebio);蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Biotech Roche);RIPA蛋白裂解液(碧云天);線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(碧云天);四環(huán)素(DOX,Solarbio);BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific);Western blot PVDF膜(Millipore);青鏈霉素抗生素(Gibco);胰酶(Gibco);嘌呤霉素(Sigma);ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore)。

主要儀器:凝膠成像儀(FUSION FX);熒光定量PCR儀(Bio-Rad);流式細(xì)胞分析儀(BD)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系均用新配制的RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素抗生素)重懸細(xì)胞,經(jīng)吹打混勻后接種于培養(yǎng)皿,置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)液,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。待貼壁細(xì)胞完全生長匯合后,用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化傳代,待細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù)量后,收獲細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。HEK293細(xì)胞用新配制的DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素抗生素)培養(yǎng)。

1.2.2 載體構(gòu)建

PGC-1α啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒和DOX誘導(dǎo)表達(dá)的Smad2或PGC-1α敲低質(zhì)粒按照基因表達(dá)載體標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建方法構(gòu)建。其中所用到的shRNA序列信息來源于Sigma Mission shRNA文庫shPPARGC1A (TRCN0000364085和TRCN0000364084),shSMAD2(TRCN0000040035和TRCN0000040036),構(gòu)建pLVX-tet-PPARGC1A-3XFLAG。所用引物序列為前引物:5’-TCCTACCCTCGTAAAGAATTCATGGA-TGAGACCTCCCCAAGG-3’;后引物:5’-GTCTTTG-TAGTCAGGCGCGCCCCTGCGCAAGCTTCTCTGAG-3’。

PGC-1α報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建,根據(jù)軟件預(yù)測,人PGC-1α轉(zhuǎn)錄本1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前2 000 bp有2個(gè)潛在的SEB結(jié)合位點(diǎn),因此通過PCR擴(kuò)增其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前2 000 bp序列并構(gòu)建到pGL3載體。所用引物序列為前引物:5’-TTTCTCTATCGATAGGTACCATGTGTTAGGGCAA-ATAACCATGT-3’;后引物:5’-AGTACCGGAAT-GCCAAGCTTCTGAATGACGCCAGTCAAGC-3’。

1.2.3 慢病毒感染

將兩種包裝質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)和pLKO-tet-puro對(duì)照或相同用于表達(dá)PGC-1α或shSmad2、shPGC-1α分別一起轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。24 h后,細(xì)胞再換新培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集上述含有慢病毒的培養(yǎng)液上清,0.45 μm濾膜過濾,病毒上清和A549細(xì)胞懸混液以體積比1∶1混合感染,期間添加polybrene(8 μg/mL)增加慢病毒感染效率。感染后的細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素(0.5 μg/mL)篩選7 d,隨后驗(yàn)證構(gòu)建好的細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株中目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 JC-1染色檢測細(xì)胞膜電位

收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞計(jì)數(shù)后,取(1～6)×105個(gè)細(xì)胞,重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中,加入0.5 mL JC-1染色工作液,顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結(jié)束后,1 200 r/min 4 ℃離心3～4 min,沉淀細(xì)胞。棄上清,用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次:加入1 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞,1 200 r/min 4 ℃離心3～4 min,沉淀細(xì)胞,棄上清。再加入1 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞,1 200 r/min 4 ℃離心3～4 min,沉淀細(xì)胞,棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液(1×)重懸后,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.5 DCFH-DA染色檢測細(xì)胞ROS水平

按照VDCFH-DA∶V無血清培養(yǎng)液=1∶1 000的比例稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmoL/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細(xì)胞密度為(1～20)×107/mL,37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA,隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.2.6 RT-PCR檢測mRNA表達(dá)情況

使用Trizol試劑提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,于-80 ℃保存。后續(xù)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR分析以測量指定基因的mRNA水平,qPCR的反應(yīng)條件為①激活:50 ℃,持續(xù)2 min;②預(yù)浸泡:95 ℃ 10 min;③變性:95 ℃ 15 s;退火:60 ℃ 1 min;④熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)所示的是標(biāo)準(zhǔn)化為β-Actin的相對(duì)mRNA表達(dá)水平?；蛱禺愋砸镄蛄幸姳?。采用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況

全細(xì)胞裂解物通過使用RIPA裂解緩沖液裂解,其中各加入100×蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Roche),蛋白質(zhì)量濃度通過BCA試劑盒測定。易溶蛋白(30～40 μg)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,快速封閉液室溫封閉1 h,經(jīng)TBST(含0.1%吐溫-20,下同)洗滌1次后分別4 ℃孵育一抗過夜,第2天TBST洗滌5次,5 min/次,再室溫孵育二抗(V二抗∶V抗稀釋液=1∶5 000)1 h,最后用ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑顯影,凝膠成像儀曝光成像并分析灰度值。

1.2.8 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

將HEK293細(xì)胞提前鋪于6孔板,待細(xì)胞完全貼好后轉(zhuǎn)染基于pGL3構(gòu)建的PGC1啟動(dòng)子表達(dá)質(zhì)粒2 μg,同時(shí)也轉(zhuǎn)染50 ng pRL-TK載體作為轉(zhuǎn)染效率控制。24 h后將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組接種于12孔板,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行DMSO和TGF-β處理,最后用雙熒光發(fā)光試劑盒和酶標(biāo)儀檢測。

1.2.9 劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種6孔板培養(yǎng)至單層匯合狀態(tài),用200 μL吸頭尖每孔劃平齊的橫線,PBS洗去未貼壁細(xì)胞,加入含0.5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,對(duì)照組不給予DOX誘導(dǎo),實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行1 μg/mL DOX誘導(dǎo),于培養(yǎng)0 h和48 h鏡下觀察并拍照,ImageJ 8.0軟件分析劃痕愈合程度。

1.2.10 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室置于24孔板,細(xì)胞消化后用含0.5% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸,取2×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室的上室,體積為200 μL。在Transwell小室的下室中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL,對(duì)照組不給予DOX誘導(dǎo),實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行1 μg/mL DOX誘導(dǎo),置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結(jié)束后取出小室并用4%中性甲醛固定15 min,0.1%結(jié)晶紫液染色5 min,用棉簽小心擦除小室上室面細(xì)胞,PBS洗滌后在顯微鏡鏡下觀察并拍照。以穿膜的細(xì)胞數(shù)差異代表細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變。每張膜選2個(gè)典型視野,每組重復(fù)3孔。

1.2.11 CCK-8實(shí)驗(yàn)

取提前準(zhǔn)備好的生長狀況良好的細(xì)胞,將其用胰酶消化,培養(yǎng)基重懸,制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)之后,將其平均分配到96孔白色透明板中。將細(xì)胞分為對(duì)照組及DOX組,DOX組中加入1 μg/mL DOX。每孔1 000個(gè)細(xì)胞、100 μL的培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),每孔加入10 μL CCK-8試劑后孵育1 h,酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度D(450 nm),此后每24 h按此法檢測1次,每組設(shè)3復(fù)孔,取均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置天數(shù)為6 d。

1.2.12 Sphere實(shí)驗(yàn)

取提前準(zhǔn)備好的生長狀況良好的細(xì)胞,將其用胰酶消化,培養(yǎng)基重懸,制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)之后,將細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行分組,并且按照300個(gè)/孔接種到低貼附性的6孔板中,6孔板中需要提前加入配置好的sphere培養(yǎng)(DMEM/F12 培養(yǎng)基,20 μL/mL B27,20 ng/mL FGF和20 ng/mL EGF),放置在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周,期間每5 d添加相應(yīng)的sphere培養(yǎng)基和DOX(1 μg/mL),每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待到球體長成后,輕輕搖勻培養(yǎng)皿將球體聚攏到中央,然后將其置于顯微鏡下拍照記錄,其中取球體直徑到達(dá)200 nm以上的細(xì)胞為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用GraphPad prism6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)代表3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并且是通過非配對(duì)t檢驗(yàn)分析或者One-way ANOVA分析,誤差條表示SEM。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β在誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT過程中對(duì)線粒體表型的影響

基于所報(bào)道過的TGF-β誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT的模型［19］,開展實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)TGF-β處理對(duì)A549細(xì)胞線粒體表型的影響。結(jié)果顯示,TGF-β可顯著促進(jìn)線粒體膜電位增加(P<0.05,圖1A)。另外,細(xì)胞ROS水平也顯著增加(P<0.01,圖1B),過量ROS反過來會(huì)對(duì)線粒體造成損傷。進(jìn)一步通過RT-PCR檢測線粒體基因的表達(dá),同樣發(fā)現(xiàn)TGF-β顯著抑制這些基因的表達(dá)(P<0.01,圖1C)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明TGF-β處理引起A549細(xì)胞線粒體表型改變,對(duì)線粒體的功能具有抑制作用。

A:TGF-β刺激與否線粒體膜電位的比較;B:TGF-β刺激與否線粒體ROS水平的比較;C:TGF-β刺激與否線粒體基因表達(dá)的比較。1) P<0.05

2.2 TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路對(duì)線粒體表型的影響

為了確定TGF-β是通過Smad通路引起線粒體表型改變的,分別通過TGF-β受體抑制劑和Smad2敲低的方法對(duì)此現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB431542可顯著抑制TGF-β引起的細(xì)胞ROS水平增加(P<0.01,圖2A)。本研究構(gòu)建了Smad2可誘導(dǎo)敲低的A549細(xì)胞株,在DOX誘導(dǎo)下可顯著敲低A549細(xì)胞中的Smad2表達(dá)(P<0.001,圖2B)。利用此細(xì)胞株,發(fā)現(xiàn)Smad2敲低后,可抑制TGF-β引起的細(xì)胞ROS水平增加(P<0.05,圖2C)。進(jìn)一步檢測細(xì)胞線粒體基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Smad2敲低可恢復(fù)TGF-β引起的線粒體基因表達(dá)下調(diào)(P<0.01,圖2D)。綜上所述,TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路引起A549細(xì)胞線粒體表型改變。

A:各組線粒體ROS水平比較;B:蛋白質(zhì)印跡評(píng)估構(gòu)建的 A549-tet-shSmad2 細(xì)胞中的 Smad2 敲低效率;C:各組線粒體基因表達(dá)比較。1)P<0.05。SB:TGFBR抑制劑 SB431542

2.3 TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路對(duì)PGC-1α轉(zhuǎn)錄的影響

PGC-1α是調(diào)控線粒體功能及線粒體基因表達(dá)的一個(gè)重要基因,通過對(duì)mRNA水平的檢測,發(fā)現(xiàn)TGF-β可顯著抑制PGC-1α的表達(dá)(P<0.01,圖3A)。利用本研究所構(gòu)建的PGC-1α報(bào)告基因,發(fā)現(xiàn)TGF-β可顯著抑制其轉(zhuǎn)錄活性(P<0.01,圖3B)。進(jìn)一步通過多個(gè)抑制劑的分析,發(fā)現(xiàn)PGC-1α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受經(jīng)典Smad通路調(diào)控(圖3C)。上述結(jié)果說明TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路抑制PGC-1α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而發(fā)揮作用。

2.4 PGC-1α恢復(fù)TGF-β引起的線粒體基因表達(dá)下調(diào)

為驗(yàn)證TGF-β是否可通過PGC-1α影響線粒體基因的表達(dá),構(gòu)建了PCG-1α可誘導(dǎo)表達(dá)的A549細(xì)胞株,結(jié)果顯示DOX可顯著促進(jìn)PGC-1α表達(dá)增加(P<0.001,圖4A)。在此細(xì)胞株中,當(dāng)誘導(dǎo)PCG-1α表達(dá)時(shí),可恢復(fù)TGF-β引起的線粒體基因表達(dá)下調(diào)(圖4B)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TGF-β造成的細(xì)胞線粒體功能改變是通過影響下游效應(yīng)分子PGC-1α的表達(dá)所致。

A:TGF-β處理與否的A549 PGC-1α mRNA水平比較;B:通過PGC-1α啟動(dòng)子報(bào)告基因測定評(píng)估PGC-1α在TGF-β處理中的轉(zhuǎn)錄活性;C:各組PGC-1α mRNA的表達(dá)比較。1) P<0.05.SB:TGFBR抑制劑SB431542,LY:PI3K 抑制劑 LY294002,MK:AKT 抑制劑MK-2206

A:通過RT-PCR評(píng)估構(gòu)建的A549-tet- PGC-1α細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá);B:A549-tet-PGC-1α細(xì)胞中相應(yīng)處理后各組間線粒體基因表達(dá)比較 1) P<0.05

2.5 PGC-1α敲低對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響

為驗(yàn)證TGF-β抑制PGC-1α表達(dá)是促進(jìn)A549細(xì)胞EMT的機(jī)制之一,構(gòu)建了PCG-1α可誘導(dǎo)敲低的A549細(xì)胞株模擬TGF-β抑制PGC-1α表達(dá)的作用。首先,DOX可顯著誘導(dǎo)PCG-1α表達(dá)下調(diào)(P<0.01,圖5A)。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)PCG-1α誘導(dǎo)敲低后引起細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)上調(diào)(圖5B)。劃痕損傷修復(fù)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PGC-1α敲低增加了細(xì)胞損傷修復(fù)能力(圖5C-D)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PGC-1α敲低并未明顯改變細(xì)胞的生長速率(圖5E),因此可排除細(xì)胞增殖導(dǎo)致的可能性。PGC-1α敲低除了可以促進(jìn)細(xì)胞損傷修復(fù)能力之外,對(duì)腫瘤細(xì)胞的干性能力也起到了促進(jìn)作用(圖5F)。綜上所述,TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路抑制PGC-1α的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而影響線粒體的功能,癌細(xì)胞為了改善生存條件及獲取更為充分的營養(yǎng),一方面趨向于向干細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化,另一方面也趨向于EMT途徑。

A:評(píng)估構(gòu)建的 A549-tet-shPGC-1α細(xì)胞中PGC-1α的敲低效率;B:A549-tet-shPGC-1α細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和β-actin的檢測及定量結(jié)果;C:劃痕試驗(yàn)的代表性圖像和定量結(jié)果(×100);D:Transwell 遷移分析的代表性圖像和定量結(jié)果 (×100);E:CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果;F:Sphere分析的代表性圖像和定量結(jié)果 (×100)。1) P<0.05

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可通過經(jīng)典的Smad通路改變肺癌細(xì)胞線粒體的表型與功能。進(jìn)一步的機(jī)制探索發(fā)現(xiàn),TGF-β調(diào)控負(fù)責(zé)線粒體生物合成及代謝的轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子PGC-1α的表達(dá),改變線粒體的表型和功能。反過來,線粒體的改變促進(jìn)肺癌細(xì)胞EMT表型的增加。

EMT是發(fā)育的逆分化過程,即在EMT期間,通過相關(guān)的金屬基質(zhì)酶將細(xì)胞-細(xì)胞連續(xù)嵌入的非運(yùn)動(dòng)、極化上皮細(xì)胞形成的細(xì)胞集合溶解并轉(zhuǎn)化為單個(gè)的、非極化、運(yùn)動(dòng)和侵入性間充質(zhì)細(xì)胞［20-22］。在病理情況下,如腫瘤中EMT可使分化細(xì)胞向干細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變,促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥［10-11］。TGF-β是其中重要的調(diào)控因子之一,目前已報(bào)道TGF-β在多種癌癥中通過EMT促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展,包括乳腺癌、肝癌、胰腺癌及肺癌等［23-27］。TGF-β與其受體TGFBR1/2結(jié)合,主要通過經(jīng)典Smad和非經(jīng)典Smad信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞EMT［11］。有研究報(bào)道FOXA1和PGC-1α響應(yīng)TGF-β參與EMT［28］及PGC-1α介導(dǎo)脂肪酸氧化促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞EMT［29］,但其并未詳細(xì)研究肺癌患者線粒體功能在此過程中扮演什么角色。作為細(xì)胞的能量工廠,線粒體的表型和功能改變與干細(xì)胞分化或成體細(xì)胞逆分化有著密切關(guān)系［16］。此過程涉及多個(gè)生物進(jìn)程的調(diào)控,仍有許多未知的新機(jī)制有待闡明。本研究首先驗(yàn)證TGF-β對(duì)線粒體表型和功能的影響。利用TGF-β誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞EMT的模型,通過流式檢測評(píng)價(jià)線粒體膜電位和ROS水平的變化,結(jié)果顯示TGF-β顯著地促進(jìn)線粒體膜電位和ROS的增加［19］。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)線粒體生成和氧化磷酸化功能相關(guān)基因在TGF-β處理后顯著下調(diào),這些表型改變提示TGF-β抑制線粒體的功能。進(jìn)一步通過TGF-β受體抑制劑和Smad2可誘導(dǎo)敲低的方式抑制TGF-β信號(hào)激活,可以顯著恢復(fù)線粒體功能和線粒體相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明TGF-β對(duì)線粒體的作用是通過經(jīng)典的Smad信號(hào)通路調(diào)控的。

代謝重編程是癌細(xì)胞的特征,線粒體的功能和代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變,細(xì)胞ATP的合成方式由氧化磷酸化轉(zhuǎn)變成以有氧糖酵解途徑為主,即所謂的“瓦勃效應(yīng)”,從而也增加營養(yǎng)攝取和生物原料合成,并反饋影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯,促進(jìn)腫瘤生長和惡性發(fā)展［30-31］。PGC-1α是線粒體生成和代謝調(diào)控的共轉(zhuǎn)錄因子,PGC-1α的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的代謝功能,抑制癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展［29,32］。在本研究中,為探討TGF-β對(duì)線粒體的作用,利用RT-PCR檢測TGF-β對(duì)PGC-1α表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β可顯著抑制PGC-1α的mRNA水平。基因結(jié)果也顯示TGF-β可抑制PGC-1α的轉(zhuǎn)錄活性。TGFBR抑制劑可恢復(fù)TGF-β對(duì)PGC-1α的抑制作用,這與敲低Smad2抑制TGF-β信號(hào)通路可恢復(fù)線粒體相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果一致。另外,為證明PGC-1α對(duì)線粒體代謝功能的影響,構(gòu)建可誘導(dǎo)PGC-1α過表達(dá)的A549細(xì)胞系,當(dāng)PGC-1α過表達(dá),可顯著恢復(fù)由于TGF-β引起的線粒體代謝相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)。實(shí)驗(yàn)表明,TGF-β在誘導(dǎo)A549細(xì)胞EMT過程中,通過抑制Smad通路抑制PGC-1α的表達(dá),從而影響線粒體代謝功能。

目前Torrano等［32］發(fā)現(xiàn)PGC-1α在多個(gè)癌種中表達(dá)下調(diào),而且其下調(diào)可促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,且有研究表明在胸主動(dòng)脈瘤中TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)參與PGC-1α調(diào)節(jié)［33］。為驗(yàn)證PGC-1α下調(diào)在TGF-β誘導(dǎo)的EMT模型中的作用,本研究利用PGC-1α可誘導(dǎo)敲低的A549細(xì)胞系來模擬TGF-β引起的PGC-1α表達(dá)下調(diào)的效果。當(dāng)PGC-1α誘導(dǎo)敲低后,細(xì)胞的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)上調(diào)。另外,通過細(xì)胞的損傷修復(fù)和遷移實(shí)驗(yàn)證明了PGC-1α的敲低可顯著增加細(xì)胞的遷移能力,這是癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提。由此表明,PGC-1α下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞的EMT表型。

綜上,本研究的結(jié)果表明TGF-β能夠抑制線粒體的代謝功能,反過來由于線粒體的代謝功能受到抑制,細(xì)胞為了能夠獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)及改善生存條件,進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞EMT。本研究在細(xì)胞水平上揭示了TGF-β信號(hào)通過線粒體調(diào)控細(xì)胞EMT的新機(jī)制,為理解腫瘤細(xì)胞EMT這種逆分化現(xiàn)象提供了新思路,并為此通路的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)聲明

鄭宗耀:提出研究思路和框架,修改論文;陳智鵬:實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析指導(dǎo);曾觀娣:設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),撰寫論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。