甘藍(lán)型油菜胚離體胚性生長培養(yǎng)體系的構(gòu)建

劉有民, 孫 超, 張培竹, 米 超, 周 超, 汪 騫, 林良斌

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201;2.云南省羅平縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心, 云南 曲靖 655800)

油菜是我國重要的油料作物,菜籽油和油菜籽的生產(chǎn)對我國油脂油料市場影響巨大[1]。研究表明,油菜種子含油量是受母體基因型、胚基因型、細(xì)胞質(zhì)基因型等遺傳效應(yīng)和田間環(huán)境因素影響的復(fù)雜數(shù)量遺傳性狀[2-4]。目前,關(guān)于此方面的研究均來自田間數(shù)據(jù)分析,而含油量是綜合因素影響的結(jié)果,不能很好地反映單因素對含油量的影響。而利用胚離體培養(yǎng)技術(shù),不僅可以排除田間環(huán)境因素的影響,還可以排除母體效應(yīng)(母體組織角果皮)影響,從而能很好地研究胚效應(yīng)及正反交種子的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng),所以建立油菜離體胚維持胚性生長的培養(yǎng)體系是獨(dú)立研究油菜種子含油量某種效應(yīng)的關(guān)鍵。姜嬌等[5]采用胚挽救技術(shù),將甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(Ogura CMS)的恢復(fù)基因轉(zhuǎn)至甘藍(lán)Ogura CMS材料上, 獲得Ogura CMS甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜的種間雜種。趙艷艷等[6]將結(jié)球甘藍(lán)與含根腫病抗性基因CCR的人工合成油菜雜交,通過對雜交后代胚挽救,獲得了抗根腫病的甘藍(lán)新材料。以上研究均是通過胚離體培養(yǎng)來獲得其再生植株,不需要維持胚性生長。Avjioglu,Knox等[7]和鄧林彬等[8]以胚的油脂含量及胚干重來確定胚離體培養(yǎng)的最佳體外培養(yǎng)體系,雖然提到了甘藍(lán)型油菜離體培養(yǎng)胚的胚性生長狀況,然而并未闡述維持胚性生長的最佳條件。本研究以甘藍(lán)型油菜ZY 511第22 DAP(Days after pollination)幼胚為研究材料,探索胚離體培養(yǎng)的影響因素,建立油菜胚離體培養(yǎng)最佳胚性生長體系,為油菜種子含油量的遺傳機(jī)制研究提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為甘藍(lán)型油菜ZY 511,含油量為51%。2021年10月5日播種于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山實(shí)驗(yàn)基地(102° E,25° N,海拔1 945 m),株距為0.25 m,行距為0.40 m,每行6株,共20行。

取材時挑選ZY 511第22 DAP主花序上的新鮮角果,長度大小要盡量一致,剝?nèi)∑溆着哌M(jìn)行離體培養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1種子胚剝?nèi)〖半x體培養(yǎng)

將田間選取的新鮮角果立即帶回組培室,置于超凈工作臺上進(jìn)行滅菌處理。用無菌水浸洗3次,每次5 min,隨后用75%乙醇浸泡3 min,然后用無菌水沖洗5 min后用0.1%升汞消毒15 min,最后用無菌水浸洗3次,每次5 min。將消毒完的角果置于無菌濾紙上吸干角果皮上的水分,剝?nèi)》N子,用無菌的尖頭鑷子戳破幼嫩種皮,取出完整胚接種于固體培養(yǎng)基上。在每個直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)放置24個離體胚,3次重復(fù)。培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中,光照強(qiáng)度設(shè)置為40 μmol/(m2·s),溫度設(shè)置為24 ℃,以16 h光照8 h黑暗的光周期進(jìn)行培養(yǎng)。體外培養(yǎng)20 d后測定其胚性生長率。

1.2.2培養(yǎng)基篩選

本實(shí)驗(yàn)選用MS、B 5和N 6培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基,三者均為不含蔗糖和瓊脂的粉末狀培養(yǎng)基。3種培養(yǎng)基配制過程為:分別稱取MS培養(yǎng)基4.74 g、B 5培養(yǎng)基3.21 g、N 6培養(yǎng)基3.99 g,蔗糖濃度6%,瓊脂濃度0.4%,加入1 L蒸餾水,配制成3種不同的固體培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH值為 5.8,于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min后冷卻至45 ℃左右進(jìn)行倒平板。將剝?nèi)〉挠着哌M(jìn)行離體培養(yǎng),對在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)下的生長狀況進(jìn)行比較,得出最適培養(yǎng)基,再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選。

1.2.3蔗糖濃度篩選

在最適培養(yǎng)基中添加蔗糖進(jìn)行重新篩選。分別設(shè)置4%,6%,8%,10%,12%等5個蔗糖濃度處理,瓊脂濃度4%,配制成5種不同的固體培養(yǎng)基,測定不同濃度的蔗糖對離體幼胚的胚性生長的影響,確定最適蔗糖濃度。

1.2.4瓊脂濃度篩選

在最適培養(yǎng)基+最適蔗糖濃度的培養(yǎng)基中設(shè)置5個瓊脂濃度,分別添加0.4%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%的瓊脂,研究不同濃度的瓊脂對離體幼胚的胚性生長的影響,用以確定最適瓊脂濃度。

1.2.5激素濃度配比篩選

在得到最適培養(yǎng)基+最適蔗糖濃度+最適瓊脂濃度后,以新獲得的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,加入不同濃度的NAA(0,0.05,0.10,0.15 mg/L)和6-BA(0.05,0.10,0.15,0.20 mg/L),這兩種激素共設(shè)置了16種激素濃度配比組合,通過對培養(yǎng)基中不同濃度配比對離體幼胚的胚性生長影響的檢測,篩選這兩種激素的最適濃度配比組合。

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010和IBM SPSS Statistics 26軟件處理數(shù)據(jù)。

胚性生長率/%=(胚性生長胚數(shù)/胚總數(shù))×100%;

愈傷組織率/%=(愈傷組織胚數(shù)/胚總數(shù))×100%;

生根率/%=(生根胚數(shù)/胚總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對油菜離體培養(yǎng)胚胚性生長的影響

油菜胚離體培養(yǎng)中,培養(yǎng)基為離體胚的生長所需提供了各種營養(yǎng)物質(zhì),而合適的培養(yǎng)基對離體胚的生長至關(guān)重要。本研究以B 5、MS和N 6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,對甘藍(lán)型油菜22 DAF種子進(jìn)行20 d胚離體培養(yǎng)和生長狀況分析。結(jié)果顯示,在不同培養(yǎng)基中的胚均出現(xiàn)子葉片增大,子葉柄伸長和膨大狀況,但胚的生長狀況差異較明顯(圖1)。B 5中大部分胚能維持胚性生長狀態(tài),只有部分胚有愈傷組織出現(xiàn),胚性生長率達(dá)89.06%,顯著高于N 6和MS培養(yǎng)基,胚的愈傷率、生根率均顯著低于N 6和MS培養(yǎng)基。在N 6和MS中均出現(xiàn)胚早熟萌發(fā)現(xiàn)象,部分子葉片發(fā)生卷曲,有愈傷組織出現(xiàn),子葉柄有白色根毛長出。在N 6中胚出現(xiàn)愈傷組織的情況較多(39.06%),顯著高于MS和B 5。而在MS中胚的子葉柄生根現(xiàn)象較嚴(yán)重,根毛多,根須長,生根率高達(dá)47.40%(表1)。綜上可知,B 5培養(yǎng)基為油菜離體胚培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

注:圖中藍(lán)色圈內(nèi)出現(xiàn)愈傷組織,紅色圈內(nèi)出現(xiàn)生根,白色圈內(nèi)兩者皆出現(xiàn)。

2.2 不同蔗糖濃度對油菜離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

胚離體培養(yǎng)需要蔗糖作為碳源為其提供能源物質(zhì),同時蔗糖還能為離體培養(yǎng)的胚提供穩(wěn)定的滲透壓來維持胚胎的正常生長和發(fā)育。由表2可見,隨著蔗糖濃度增加,胚的胚性生長率呈先升后降趨勢,8%時離體培養(yǎng)胚的胚性生長率最大,其他蔗糖濃度均低于8%。4%時離體培養(yǎng)胚容易早熟萌發(fā)成幼苗,子葉柄會有大量白色根毛產(chǎn)生,胚性生長率最低(79.76%),因此,最適蔗糖濃度為8%。

表2 不同蔗糖濃度對離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

2.3 不同瓊脂濃度對油菜離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

油菜種子在發(fā)育過程中尤其是在發(fā)育早期,未成熟種子的幼胚處于液態(tài)的胚乳中,胚生長的環(huán)境屬于一種半液態(tài)環(huán)境。為了探索這種半液態(tài)環(huán)境下的最適胚離體培養(yǎng)條件,在B 5+8%蔗糖的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上設(shè)計了5個瓊脂濃度進(jìn)行油菜胚離體培養(yǎng)。結(jié)果(表3)表明,隨著瓊脂濃度升高,離體培養(yǎng)胚的胚性生長率呈先升后降的趨勢,瓊脂濃度為0.6%時胚的胚性生長狀況最好,達(dá)92.19%。所以,選擇0.6%作為維持胚離體培養(yǎng)胚性生長的最適瓊脂濃度。

表3 不同瓊脂濃度對離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

2.4 不同激素濃度配比對油菜離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

油菜組織培養(yǎng)體系中,影響外植體生長發(fā)育的一個重要因素是培養(yǎng)基中外源激素的組成,本實(shí)驗(yàn)在重新確定了最適蔗糖濃度(8%)和瓊脂濃度(6%)后的B 5培養(yǎng)基中,加入不同濃度配比的NAA和6-BA,探究兩種激素利于油菜胚離體培養(yǎng)最適濃度配比。結(jié)果顯示,胚離體培養(yǎng)10 d左右胚的子葉生長迅速,20 d時胚的子葉片均明顯增大、增厚且顏色變綠,子葉柄伸長且略有膨大,但也出現(xiàn)個別胚在接種后變黃、變褐或者停止生長現(xiàn)象,且不同配比組合離體培養(yǎng)胚的子葉片彎曲程度不同,子葉片顏色及子葉柄生長狀態(tài)也有所區(qū)別。與其他配比處理相比,P 7培養(yǎng)基中胚的胚性生長狀況最好,子葉片顏色較鮮綠,胚性生長率最高,達(dá)94.64%(表4)。綜合不同配比處理得到的胚性生長率,以P 7(0.05 mg/L NAA和0.15 mg/L 6-BA)激素配比作為胚離體培養(yǎng)胚性生長的最適濃度激素配比組合。

表4 不同激素濃度配比對離體培養(yǎng)胚的胚性生長的影響

3 討論與結(jié)論

培養(yǎng)基既是提供細(xì)胞營養(yǎng)和促使細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)物質(zhì),也是細(xì)胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基種類很多,不同類型的培養(yǎng)基成分差異明顯,對甘藍(lán)型油菜胚離體培養(yǎng)所產(chǎn)生的影響也不同。本研究選用B 5、N 6和MS培養(yǎng)基進(jìn)行甘藍(lán)型油菜幼胚離體培養(yǎng),觀察其生長狀況。結(jié)果顯示,甘藍(lán)型油菜幼胚在B 5培養(yǎng)基上培養(yǎng)更利于胚的胚性生長,在N 6和MS培養(yǎng)基上胚性生長狀況較差,胚在非胚性生長狀態(tài)下更容易出現(xiàn)早熟萌發(fā)及生根現(xiàn)象,這種現(xiàn)象與培養(yǎng)基自身的營養(yǎng)物質(zhì)組成密切相關(guān)。MS和N 6培養(yǎng)基都含有較高濃度的硝酸鹽和銨鹽,尤其是MS培養(yǎng)基,在不添加其他有機(jī)成分的情況下,無機(jī)養(yǎng)分的含量也足以滿足植物細(xì)胞生長發(fā)育營養(yǎng)需求,但甘藍(lán)型油菜幼胚更適宜在銨鹽含量較低及鉀鹽含量較高的培養(yǎng)基中維持其胚性生長。1968年,Gamborg等[9]在研究大豆根細(xì)胞時初次設(shè)計使用了B 5培養(yǎng)基,之后許多研究也表明B 5培養(yǎng)基是雙子葉植物離體培養(yǎng)最適培養(yǎng)基。于新杰[10]研究發(fā)現(xiàn),B 5培養(yǎng)基中木蘭種子發(fā)芽率較高,褐化率最低,是最佳培養(yǎng)基;鄧林彬等[8]在甘藍(lán)型油菜胚離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),B 5培養(yǎng)基中胚胎形態(tài)變化較小,基本維持胚性生長狀態(tài),胚根出現(xiàn)生長延伸、長根毛的現(xiàn)象極少,更適合作為胚培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本研究結(jié)果與之一致。綜上表明,B 5培養(yǎng)基是研究油菜胚離體培養(yǎng)胚性生長的最適培養(yǎng)基。

胚離體培養(yǎng)時對培養(yǎng)環(huán)境要求較高,胚在維持其胚性生長狀態(tài)時需要合適的滲透壓和穩(wěn)定的能量來源及無菌環(huán)境。蔗糖除作為培養(yǎng)基內(nèi)的主要碳源和能源外對維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用,不但為胚離體培養(yǎng)提供了生長發(fā)育所需能量,而且形成的滲透壓也能長時間保持相對穩(wěn)定,不易造成細(xì)胞脫水而影響生長,也在一定程度上減少了微生物的污染。王蕓等[11]、張倩云等[12]研究表明,蔗糖濃度和滲透壓都制約著幼胚的胚性生長及萌發(fā)后的生長。所以,在胚離體培養(yǎng)中,幼胚離體培養(yǎng)需要人為創(chuàng)造一個較高的滲透壓環(huán)境來維持幼胚的胚性生長。Liu等[13]對兩個不同含油量的油菜品系的不同發(fā)育階段果皮和胚珠中的蔗糖濃度進(jìn)行測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),果皮蔗糖含量為3.98%～4.48%,胚珠蔗糖含量為5.26%～6.51%。Avjioglu等[7]通過甘藍(lán)型油菜幼胚培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),胚胎干重會隨著蔗糖濃度的增高而降低,當(dāng)蔗糖濃度為2%時,幼胚早期萌發(fā)現(xiàn)象嚴(yán)重,當(dāng)蔗糖濃度為10%時,幼胚早萌被抑制,維持其胚性生長。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個蔗糖濃度梯度,最終確定了蔗糖濃度為8%時離體幼胚的胚性生長最好。但也發(fā)現(xiàn)過高的蔗糖濃度會造成培養(yǎng)基滲透壓失衡,導(dǎo)致幼胚脫水,影響其正常胚性生長。

油菜是雙子葉植物,具有無胚乳型種子,主要由胚和種皮兩部分構(gòu)成。種子的胚乳在發(fā)育早期為液態(tài),未成熟種子中的胚在這種由種皮包裹的半液態(tài)環(huán)境下以胚乳為養(yǎng)分不斷吸收胚乳進(jìn)行生長發(fā)育,當(dāng)種子成熟后胚乳便會消失[14-15]。所以為胚的正常生長發(fā)育創(chuàng)造一種相對的半液態(tài)環(huán)境對胚的生長發(fā)育至關(guān)重要。瓊脂作為一種很好的固化劑,瓊脂濃度不僅決定了培養(yǎng)基的軟硬程度及表層水分含量,也間接影響了這種人為創(chuàng)造的半液態(tài)環(huán)境下胚的生長發(fā)育狀況。本研究設(shè)置了5個瓊脂濃度梯度,通過胚生長狀況的測定確定了當(dāng)培養(yǎng)基瓊脂濃度在0.6%時為最佳,此時胚能保持較好的胚性生長狀態(tài)。

自1937年,White在組織培養(yǎng)中加入IAA起,植物激素對組織培養(yǎng)的調(diào)控作用就引起了人類的廣泛關(guān)注。添加外源植物激素對離體培養(yǎng)外植體的細(xì)胞分化和形態(tài)建成有明顯的調(diào)節(jié)作用,而且不同種類的植物激素對植物外植體產(chǎn)生的效果不同。雖然植物本身就存在內(nèi)源激素且激素水平會不斷發(fā)生變化,但外源植物激素的施加會直接影響和改變著外植體內(nèi)源激素的水平,起到調(diào)控植物組織生長發(fā)育的作用。郭婷婷等[16]和楊長友等[17]研究也表明,植物外源激素在油菜組織培養(yǎng)中起著重要的作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,高濃度NAA不利于甘藍(lán)型油菜胚性生長,胚性生長對NAA的濃度較敏感;以0.05 mg/L NAA和0.1 mg/L 6-BA配比組合的培養(yǎng)基胚性生長狀況最好,胚性生長率最高(94.64%),更適宜作為胚離體培養(yǎng)的最佳激素濃度配比。

本研究表明,以B 5培養(yǎng)基+8%蔗糖+0.6%瓊脂+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA為甘藍(lán)型油菜胚離體培養(yǎng)最佳胚性生長體系,此條件下的離體幼胚維持胚性生長的狀況最好,胚性生長率高,達(dá)94.64%。本研究建立了甘藍(lán)型油菜胚性生長培養(yǎng)體系,為油菜胚性生長及種子含油量遺傳機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。