妥拉唑啉控制雛雞實驗性近視進展的有效性和安全性

陳思童 孫麗媛 王凱 趙明威

近視是一項重大的公共衛(wèi)生問題，目前近視防控的藥物主要為低濃度阿托品，而臨床中并不是對所有患者適用且有效，因此，新型藥物仍亟需開發(fā)。在以動物模型和人群為對象的近視研究中均存在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的血流灌注量減少、脈絡(luò)膜變薄[1]的現(xiàn)象，而這種變化被認為是引起眼底退行性變的原因之一[2-3]。脈絡(luò)膜作為高度血管化的結(jié)構(gòu)，由交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)共同支配，副交感神經(jīng)刺激產(chǎn)生的一氧化氮（Nitric oxide，NO）介導前部脈絡(luò)膜血管舒張，而交感神經(jīng)受到刺激后引起整個脈絡(luò)膜的血管收縮[4]。妥拉唑啉是一種非選擇性競爭性α-腎上腺素能受體拮抗劑，能夠抑制交感神經(jīng)興奮，抑制平滑肌收縮，導致靜脈容量增加。L-NAME（NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester）作為eNOS（Endothelial nitric oxide synthase）的抑制劑，能夠抑制血管內(nèi)皮中eNOS的活性，eNOS能夠增加血管內(nèi)皮中NO的合成從而舒張血管。因此本研究選用妥拉唑啉對雛雞實驗性近視模型進行干預，觀察玻璃體腔注射妥拉唑啉對實驗性近視的有效性和安全性，同時聯(lián)合應用L-NAME觀察NO是否參與妥拉唑啉在雛雞實驗性近視中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2021年3月選用的6日齡白萊航雞購自北京勃林格殷格勒維通生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于500 lx環(huán)境照度下，并維持12 h/12 h光照/黑暗循環(huán)，提供充足的食物和水。實驗前排除屈光介質(zhì)混濁的個體，實驗前和實驗后記錄每個個體的體質(zhì)量。本研究遵循美國視覺和眼科研究協(xié)會（American Association for Vision and Ophthalmology Research，ARVO）規(guī)定的眼科研究動物使用規(guī)范，并得到北京大學人民醫(yī)院機構(gòu)動物護理和使用委員會的批準（批號：2018PHC059）。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 用0.9%氯化鈉溶液配置100 μmol/L妥拉唑啉（TargetMol Chemicals Inc，US）溶液、一氧化氮合酶（Nitric-oxide synthase，NOS）抑制劑L-NAME（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

將所有雛雞隨機分為形覺剝奪模型27 只、離焦誘導模型34 只和非近視造模雛雞16 只。從6 日齡起對雛雞進行實驗性近視造模，形覺剝奪性近視（Form-deprived myopia，F(xiàn)DM）雛雞配戴遮蓋片，離焦誘導性近視（Lens-induced myopia，LIM）雛雞配戴-10 D PMMA鏡片，造模的同一天開始進行連續(xù)6 d的玻璃體腔注射干預，所有實驗只對右眼進行處理，對側(cè)眼不進行造模和玻璃體腔注藥操作。在形覺剝奪模型中，將雛雞隨機分為形覺剝奪對照組9只（FDM）、形覺剝奪后妥拉唑啉干預組9 只（FDM+T100）和形覺剝奪后妥拉唑啉聯(lián)合L-NAME組9只（FDM+T100+L-NAME）；在離焦誘導模型中，同樣將雛雞隨機分為離焦誘導對照組11 只（LIM）、離焦誘導后妥拉唑啉干預組15 只（LIM+T100）和離焦誘導后妥拉唑啉聯(lián)合L-NAME組8只（LIM+T100+L-NAME）；在非近視造模雛雞中，隨機分為空白對照組8只（Blank）和單純妥拉唑啉干預組8只（Blank+T100）。空白對照組、形覺剝奪對照組和離焦誘導對照組每日注射12.5 μL 0.9%氯化鈉溶液，妥拉唑啉干預組每日注射100 μmol/L妥拉唑啉12.5 μL（1.25 nmol），妥拉唑啉聯(lián)合L-NAME組每日注射12.5 μL的L-NAME和妥拉唑啉混合溶液（妥拉唑啉含量1.25 nmol）。

在誘導過程中，每天同一時段進行注射，連續(xù)6 d，全程給予異氟烷氣體麻醉，用鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥株式會社）給予表面麻醉后，開瞼器暴露眼瞼，用30 G胰島素針頭在角膜后約2 mm處穿刺，再用33 G Hamilton微量注射器注射[5]，并于注射后和次日清晨涂抹泰利必妥眼膏（日本參天制藥株式會社）。

1.2.2 生物參數(shù)測量 在誘導開始前（0 d）、誘導結(jié)束后（6 d）的同一時段測量雛雞的體質(zhì)量、屈光度、眼球生物參數(shù)。高頻A超（25 MHz，EYESCAN-100，美國TECLAB公司）測量全程采用異氟烷氣體麻醉，將雛雞固定于自制固定板上，表面麻醉后，放置開瞼器以暴露角膜（不壓迫角膜）。使用帶狀光檢影鏡（蘇州六六視覺眼科醫(yī)療器械股份公司）在50 cm工作距離對雛雞進行檢影，取2條主子午線的等效球鏡度作為屈光度。

測量得到角膜前、角膜后、晶狀體前、晶狀體后、視網(wǎng)膜前、視網(wǎng)膜后、脈絡(luò)膜后、鞏膜后8 個表面的位置數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導出到MATLAB上采用自編程序進行標記后，根據(jù)文獻中眼球各結(jié)構(gòu)聲速[6]進行換算，每次測量15次取其平均值，得到眼球各部分結(jié)構(gòu)的長度。統(tǒng)計每次測量的玻璃體腔深度、脈絡(luò)膜厚度和眼軸長度。對實驗前后各生物參數(shù)的變化量（實驗后-實驗前）進行計算。

1.2.3 ERG檢測 在治療結(jié)束后對雛雞進行過夜暗適應，次日在氣體麻醉下進行視網(wǎng)膜電圖（ERG）的暗適應3.0和明適應3.0測量。暗適應3.0（刺激強度3.00 cd·s·m-2，0.05 Hz）主要觀察視桿、視錐細胞的混合反應及其連接的雙極細胞的功能，明適應3.0（刺激強度3.00 cd·s·m-2，0.05 Hz）主要觀察視桿細胞及其連接的雙極細胞功能。

對雛雞進行氣體麻醉后，用開瞼器撐開雙眼，將參考電極、接地電極和角膜電極分別放置于雛雞的頸部皮下、背部皮下和角膜，并用卡波姆凝膠（美國博士倫公司）保持角膜濕潤。采用ERG RETIport記錄系統(tǒng)（德國羅蘭視覺電生理儀），每個數(shù)據(jù)取3次測量的平均值。協(xié)議改編自國際視覺臨床電生理學會的指南[7]。

1.2.4 TUNEL試驗 將雛雞斷頭處死后，摘除眼球并去除后極部肌肉及筋膜組織，在FAS眼球固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司）中固定30 min。將眼球前段角膜、晶狀體去除，保留后極部，4%多聚甲醛溶液固定1 h，梯度過糖脫水后用OCT包埋劑（日本櫻花公司）包埋，進行眼球后極部內(nèi)的冰凍切片及TUNEL染色，在熒光顯微鏡200倍下拍照，每張切片隨機選取后極部中央位置不重疊的3個視野計數(shù)TUNEL染色的陽性細胞個數(shù)取平均值。每個處理組選取3個個體樣本的切片進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗研究。使用SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，各計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實呈正態(tài)分布后，數(shù)據(jù)以表示，給藥前后差值的2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用M（Q1，Q3）表示，2組間比較用Mann-WhitneyU檢驗，多組間用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有雛雞基線數(shù)據(jù)包含體質(zhì)量、屈光度、玻璃體腔深度、脈絡(luò)膜厚度、眼軸，各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），實驗結(jié)束時各組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 妥拉唑啉對形覺剝奪模型的近視進展和脈絡(luò)膜的影響

處理6d 后，F(xiàn)DM、FDM+T 100 和FDM+T100+L-NAME組的屈光度變化量分別為（-15.56±1.12）（-7.81±0.91）（-9.64±0.94）D，F(xiàn)DM組和FDM+T100 組之間的屈光度變化值差異有統(tǒng)計學意義（t=-16.16，P＜0.001），F(xiàn)DM+T100組與FDM+T100+L-NAME組之間差異也存在統(tǒng)計學意義（t=4.20，P=0.001）。

3 組玻璃體腔深度增長量分別為（0.93±0.04）（0.46±0.14）（0.57±0.11）mm，F(xiàn)DM 組和FDM+T 100 組差異有統(tǒng)計學意義（t=9.93，P＜0.001），而FDM+T100與FDM+T100+L-NAME組之間差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.84，P=0.085）。

3組脈絡(luò)膜厚度變化量分別為（-58.50±28.06）（-5.42±58.47）（-21.24±53.16）μm，F(xiàn)DM組與FDM+T100組之間差異存在統(tǒng)計學意義（t=-2.46，P=0.031），而FDM+T100組與FDM+T100+L-NAME組之間差異無統(tǒng)計學意義。

3 組眼軸增長量分別為（1.30±0.11）（0.73±0.08）（0.83±0.10）mm，F(xiàn)DM 組和FDM+T 100 組之間的差異存在統(tǒng)計學意義（t=12.41，P＜0.001），F(xiàn)DM+T100與FDM+T100+LNAME 組之間差異存在統(tǒng)計學意義（t=-2.33，P=0.033）。

2.3 妥拉唑啉對離焦誘導模型的近視進展和脈絡(luò)膜的影響

處理6 d后，LIM、LIM+T100和LIM+T100+LNAME組的屈光度變化量分別為（-10.27±1.43）（-7.63±0.91）（-9.19±1.02）D。LIM 組和LIM+T100 組之間的屈光度變化值差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.77，P＜0.001），LIM+T100 組與LIM+T100+L-NAME組之間差異也有統(tǒng)計學意義（t=3.74，P=0.001）。

3 組玻璃體腔深度增長量分別為（0.61±0.11）（0.45±0.09）（0.54±0.07）mm，LIM組和LIM+T100組差異有統(tǒng)計學意義（t=4.19，P＜0.001），LIM+T100組與LIM+T100+L-NAME組差異也有統(tǒng)計學意義（t=-2.93，P=0.008）。

3組脈絡(luò)膜厚度變化量分別為（-23.26±38.46）（-8.75±53.49）（-23.51±39.45）μm，LIM與LIM+T100組、LIM+T100與LIM+T100+L-NAME組差異均無統(tǒng)計學意義（t=-0.77，P=0.452；t=1.23，P=0.233)。

3 組眼軸增長量分別為（0.90±0.10）（0.73±0.11）（0.82±0.04）mm，LIM組和LIM+T100組之間的差異存在統(tǒng)計學意義（t=4.19，P＜0.001），LIM+T100與LIM+T100+L-NAME組之間也存在顯著性差異（t=-3.20，P=0.005）。

2.4 妥拉唑啉不影響眼球正常生長發(fā)育

Blank組和Blank+T100組間進行單因素方差分析顯示，屈光度變化量分別為（-2.16±0.87）D和（-1.69±0.84）D，組間差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.10，P=0.291），眼軸增長量分別為（0.59±0.10）mm和（0.58±0.10）mm，組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.94，P=0.788），說明單純妥拉唑啉注射并沒有抑制正常眼球的生理性生長。

Blank組及Blank+T100 組、FDM+T100 組、LIM+T100組都進行眼球切片和TUNEL染色（每組至少3只眼球），各組的TUNEL染色結(jié)果都罕見熒光著染的細胞，見圖1。

圖1.誘導6 d后各處理組雛雞視網(wǎng)膜凋亡TUNEL染色結(jié)果A：陽性對照（用DNase I處理形成為凋亡細胞的DNA斷裂形態(tài)）；B：陰性對照（無酶）；C：空白對照組（Blank）；D：單純妥拉唑啉注射組（Blank+T100）；E：形覺剝奪后妥拉唑啉干預組（FDM+T100）；F：離焦誘導后妥拉唑啉干預組（LIM+T100）Figure 1.Results of TUNEL staining for retinal apoptosis in chicks of each treatment group after 6 days treatmentA: Positive control (DNase I treatment to mimic the DNA strand breakcharacteristic of apoptosis);B: Negative control (no enzyme);C: Blank group,only get vitreous injection of saline;D: Blank+T100 group,get vitreous injection of 100 μmol/L tolazoline;E: FDM+T100 group,goggled with diffusers and get vitreous injection of 100 μM tolazoline;F: LIM+T100 group,goggled with -10 D lens and get vitreous injection of 100 μmol/L tolazoline.FDM,form-deprived myopia;LIM,lens-induced myopia;T100,100 μmol/L tolazoline.GFP,green fluorescent protein;DAPI,4',6-diamidino-2-phenylindole;GCL,ganglion cells layer;INL,inner nuclear layer;ONL,outer nuclear layer.

2.5 ERG

暗適應3.0反映了視桿和視錐混合系統(tǒng)的功能，明適應3.0反應的是視錐系統(tǒng)的功能，a波反映的是視錐細胞的功能。為了減少由于麻醉和操作帶來的個體差異，本研究對暗適應和明適應刺激反應的a波、b波的測量值，以右眼/左眼的比值進行統(tǒng)計學分析[8]，對Blank組和Blank+T100組進行對比顯示，2組間各測量波的雙眼比值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1.空白對照組和單純妥拉唑啉注射組的ERG雙眼比值（右眼/左眼）Table 1 The ERG statistical ratio results of the blank group and the blank+T100 group (right/ left)

3 討論

近年來，脈絡(luò)膜作為近視防控的關(guān)鍵靶點，受到越來越多的關(guān)注。臨床研究顯示，隨著近視進展，脈絡(luò)膜呈現(xiàn)變薄趨勢，中心凹下脈絡(luò)膜厚度與屈光度和年齡的關(guān)系可通過多元回歸得到脈絡(luò)膜厚度=365.1-2×年齡+7.9×屈光不正[9]。近視兒童的脈絡(luò)膜與非近視兒童相比顯著變薄，而在早期近視發(fā)展中視網(wǎng)膜厚度不變或增厚，這意味著脈絡(luò)膜厚度的變化可能先于視網(wǎng)膜變薄，發(fā)生在近視初期[10]。因此，早期近視防控應聚焦于脈絡(luò)膜厚度變化。

脈絡(luò)膜作為高度血管化的組織，不僅能為外層視網(wǎng)膜提供氧氣和營養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)脈絡(luò)膜血流來調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓，還能通過改變脈絡(luò)膜厚度調(diào)整視網(wǎng)膜的位置，釋放參與調(diào)節(jié)血管形成、鞏膜重塑及眼睛生長調(diào)節(jié)的因子[11-14]。脈絡(luò)膜厚度的改變主要取決于脈絡(luò)膜血管直徑改變引起的血流量變化[15]。近期研究表明，脈絡(luò)膜的血流信號影響了鞏膜的氧氣和營養(yǎng)供應，進而造成近視中的鞏膜缺氧和鞏膜細胞外基質(zhì)重塑，而紅景天苷、芒柄花素等抗缺氧藥物[16]能夠通過抑制鞏膜缺氧而控制近視。本研究中選用的妥拉唑啉是一種非選擇性α腎上腺素受體阻滯劑，能抑制交感神經(jīng)興奮和平滑肌收縮，對α1、α2腎上腺素受體有拮抗作用，同時具有舒張血管的作用[17-18]。在安全性實驗中，不論是非近視模型中單純妥拉唑啉注射組，還是形覺剝奪或離焦誘導模型中的妥拉唑啉注射組，都沒有使雛雞視網(wǎng)膜的各層細胞發(fā)生凋亡；同時，單純妥拉唑啉干預組對于視網(wǎng)膜視錐細胞和視桿細胞以及與它們相連的雙極細胞的功能都沒有顯著性的損害，說明妥拉唑啉在雛雞中玻璃體腔注射安全性良好，妥拉唑啉并沒有因為藥物或劑量的毒性抑制眼球正常發(fā)育而顯示出對雛雞屈光度和眼軸增長的控制效果。

本研究同時構(gòu)建了離焦誘導模型和形覺剝奪模型。既往研究表明，這兩類近視的致病機制并不完全相同，這種差異可能是由視網(wǎng)膜如何響應不同的光學干預而影響近視生長造成的[19]。FDM中只要保持持續(xù)的形覺剝奪，并且處于發(fā)育可塑期，就會導致眼部生長速率增加；相反，LIM中，當眼軸生長到與施加的離焦量相抵消時，眼睛生長就會停止。并且，F(xiàn)DM和LIM動物模型的脈絡(luò)膜厚度對2種刺激的反應也不同，LIM雛雞的脈絡(luò)膜變薄現(xiàn)象相對正常眼并不顯著，而FDM雛雞脈絡(luò)膜顯著變薄[20]。同時，近視相關(guān)的生長調(diào)節(jié)因子DA、乙酰膽堿在FDM和LIM作用通路中受體的主導地位也不全相同[19]，例如多巴胺D2 受體拮抗劑能夠抑制FDM形覺恢復期的正視化和脈絡(luò)膜增厚，但對于LIM并無影響[21]。在本實驗中，雖然妥拉唑啉對FDM和LIM都能有效抑制其屈光度和眼軸的近視化進展，但對FDM的屈光度和眼軸控制效果為57.8%和80.3%，而對LIM的屈光度和眼軸控制效果只有32.6%和54.8%，并且妥拉唑啉能顯著抑制FDM中的脈絡(luò)膜變薄現(xiàn)象，而在LIM中脈絡(luò)膜變薄只表現(xiàn)出微弱的抑制趨勢。這說明妥拉唑啉可能在LIM模型和FDM模型中的作用通路并不完全相同，妥拉唑啉可能在FDM模型中發(fā)揮了更強的擴張血管和脈絡(luò)膜增厚效應。但由于脈絡(luò)膜厚度與眼軸長度呈負相關(guān)[22-23]，因此妥拉唑啉只能夠延緩其變薄趨勢，卻不能使脈絡(luò)膜增厚。在雛雞預實驗中，對不作任何處理的8只眼和單純注射0.9%氯化鈉溶液的8 只眼的脈絡(luò)膜厚度進行統(tǒng)計分析，2組間差異不存在統(tǒng)計學意義，說明在雛雞正常生長中可能存在脈絡(luò)膜的生理性變薄；本研究中對照組單純注射0.9%氯化鈉溶液與單純注射妥拉唑啉組，隨著眼軸和屈光度的生長，也呈現(xiàn)脈絡(luò)膜變薄的趨勢，這與人類兒童成長中脈絡(luò)膜厚度增加不同，可能是由于雛雞脈絡(luò)膜的晝夜節(jié)律較人類更為顯著[24]，而在眼底不同區(qū)域的脈絡(luò)膜厚度也有所差異，因此需要進一步實驗驗證脈絡(luò)膜的血流灌注量來量化脈絡(luò)膜在近視防控中的效果。

目前近視的發(fā)病機制和防控機制研究仍未明晰，但已有多項研究證實可以通過干預腎上腺素通路發(fā)揮近視防控效果。由于多巴胺（Dopamine，DA）與去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）共同作用于G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），存在競爭性拮抗關(guān)系，有研究認為阿托品[25]可能是通過阻斷α2 腎上腺素能受體，而不是毒蕈堿受體（mAChR）來抑制近視。Mathis等[26]的研究顯示毒蕈堿受體和腎上腺素α2受體共同在視網(wǎng)膜多巴胺能神經(jīng)元上表達，α2A受體激動劑抑制了治療眼和對側(cè)眼的DA釋放，而α2A受體拮抗劑和阿托品均能刺激DA的釋放。但另一項研究[27]認為，α2 腎上腺素受體激動劑（20 nmol和200 nmol的溴莫尼定和胍法辛）能夠抑制FDM雛雞的近視進展，可能是通過α2A受體和DA共同介導，調(diào)節(jié)了酪氨酸羥化酶的活性，但此項實驗并沒有排除近視控制現(xiàn)象是否是由于藥物濃度過高或藥物本身造成了毒性效應抑制了眼球正常生長。因此，妥拉唑啉的潛在作用機制除了抑制α1A受體來擴張血管，同時有NO共同參與調(diào)控脈絡(luò)膜血管擴張，也可能通過抑制α2A受體來刺激DA釋放，來共同抑制近視的進展，具體作用機制有待進一步驗證。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明陳思童：設(shè)計實驗，實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。孫麗媛：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與修改論文的結(jié)果結(jié)論。王凱、趙明威：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進行核修